Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar
Summary
Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.
Introduction
Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu kanıtlanmıştır2. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.
Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyileşme hızı, yetişkinler için birkaç haftaya kıyasla birkaç gün ve manuel teknikler kullanarak yaralanmaları indükleme kolaylığıdır. Bu, son araştırmalar da dahil olmak üzere birçok çalışmada3,4,5 başarıyla kullanılmıştır6,7. Genel olarak, bu anlamlı veri üretiminin artmasına, deneysel protokollerin yüksek uyarlanabilirliğine ve deneysel maliyetlerin azalmasına neden olur. Döllenmeden sonraki 5 günden daha genç larvaların kullanımı, hayvan araştırmalarında 3R ilkelerini izleyerek hayvanların kullanımını da azaltır8.
Zebra balığı larvalarında omurilik yaralanmasından sonra, enflamatuar yanıt, hücre proliferasyonu, nörogenez, hayatta kalan veya yeni üretilen hücrelerin göçü, fonksiyonel aksonların reformu ve nöral süreç devrelerinin ve omurga dokularının küresel olarak yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreç meydana gelir6,7,9,10 . Başarılı bir şekilde organize edilmek için, bu süreçler bir dizi hücre tipi, hücre dışı matris bileşenleri ve biyokimyasal sinyaller arasında ince bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşimi içerir11,12. Omurilik gibi karmaşık bir dokunun bu önemli yeniden yapılanmasının ayrıntılarını çözmek, hassas ve kontrollü deneysel yaklaşımların kullanılmasını ve geliştirilmesini gerektirir.
Zebra balıklarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için kullanılan birincil deneysel paradigma, rezeksiyon, bıçaklama veya kriyoyaralanma yoluyla doku hasarını indüklemek için cerrahi araçlar kullanmaktır3,13. Bu yaklaşımlar, herhangi bir yeni operatör için zaman alıcı olan ve kısa vadeli projelerde kullanılmalarını engelleyebilecek mikrocerrahi becerilerinde özel eğitim gerektirme dezavantajına sahiptir. Ayrıca, genellikle rejenerasyonu etkileyebilecek çevre dokulara zarar verirler.
Başka bir yaklaşım da kimyasal olarak14 veya genetik manipülasyonlarla15 hücre hasarını indüklemektir. İkincisi, yüksek oranda hedeflenmiş hasara izin verir. Bununla birlikte, böyle bir teknik, herhangi bir deney yapmadan önce, her benzersiz bir hücre tipi hedeflendiğinde yenilenen yeni transgenik balıklar üretmek için uzun hazırlık çalışmaları gerektirir.
Bu nedenle, rejenerasyonda çeşitli çalışmalara uygun, hedefe yönelik ancak çok yönlü lezyonlara izin veren bir yönteme ihtiyaç vardır. Bir çözüm, ilgilenilen dokuda lokalize hasarı indüklemek için bir lazer kullanmaktır16,17,18,19,20. Gerçekten de, lazere bağlı doku hasarının kullanımı, birçok avantajı olan omurilik lezyonlarının oluşturulması için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Bu tür lazer manipülasyon modülleri ile donatılmış mikroskoplar, zamansal kontrolün ekstra yararı ile hücre ablasyonunun gerçekleşeceği özelleştirilmiş şekilli bir alanın belirlenmesine izin verir. Lezyonun boyutu ve pozisyonu böylece herhangi bir soruyu ele almak için uyarlanabilir.
Çoğu lazer lezyon sisteminin eksik özelliği, bir dizi larva için yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde yaralanmalara neden olma olasılığıdır. Burada, zebra balığı larvalarında yarı otomatik hassas ve kontrollü lezyonları indüklemek için otomatik larva kullanımı için tasarlanmış mikroakışkan bir platforma dayanan orijinal bir protokol açıklanmaktadır21. Dahası, burada sunulan sistemde, larvalar, hayvanın rostrokaudal ekseni etrafında serbest dönmesine izin veren bir cam kılcal damara yerleştirilir. Kullanıcı, larvaların hangi tarafının lazere sunulacağını seçebilirken, floresan görüntülemenin lazer ışınını tam olarak hedeflemesine ve lezyondan sonraki hasarı değerlendirmesine izin verebilir.
Burada açıklanan protokol, UV lazerle donatılmış bir eğirme diski (bundan böyle VAST sistemi olarak anılacaktır) ile birleştirilmiş yarı otomatik bir zebra balığı larva görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılmaktadır. Bununla birlikte, protokolün ana noktaları ve tekniğin iddialarının çoğu, iki fotonlu lazer tarama mikroskopları, UV lazerle sağlanan dönen disk mikroskopları (FRAP modülü) veya fotoğraf manipülasyonu için lazer modüllü video mikroskoplar dahil olmak üzere hücre ablasyonu yapabilen bir lazerle donatılmış herhangi bir sistem için geçerlidir. VAST sistemi ile geleneksel numune işleme arasındaki temel farklardan biri, ikincisi için, larvaların 96 delikli bir plakaya yüklenmesi yerine, cam kapaklar / cam tabanlı Petri tabakları üzerine düşük erime noktalı agarozda monte edilmesinin gerekli olmasıdır.
Bu yöntemin sunduğu faydalar, rejenerasyon sürecinde hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında yenilikçi araştırmalar için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, yüksek veri kalitesi, multidisipliner bir bağlamda nicel araştırmalara izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma BBSRC (BB/S0001778/1) tarafından desteklenmiştir. CR, Princess Royal TENOVUS İskoçya Tıbbi Araştırma Burs Programı tarafından finanse edilmektedir. David Greenald’a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) ve Katy Reid’e (CDBS, Edinburgh Üniversitesi) transgenik balıkların nazik hediyesi için teşekkür ederiz ( Ek Dosyaya Bakınız). Daniel Soong’a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) 3i eğirme diski konfokaline nazik erişim için teşekkür ederiz.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
