Kontrollerade halvautomatiska laserinducerade skador för att studera ryggmärgsregenerering i zebrafisklarver
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att inducera vävnad-specifika och mycket reproducerbara skador i zebrafish larver med hjälp av en laser lesion system i kombination med en automatiserad microfluidic plattform för larver hantering.
Abstract
Zebrafisk larver har ett fullt fungerande centrala nervsystem (CNS) med hög regenerativ kapacitet bara några dagar efter befruktning. Detta gör denna djurmodell mycket användbar för att studera ryggmärgsskada och regenerering. Standardprotokollet för att inducera sådana skador är att transect den dorsala delen av stammen manuellt. Denna teknik kräver dock omfattande träning och skadar ytterligare vävnader. Ett protokoll utvecklades för laser-inducerade skador för att kringgå dessa begränsningar, vilket möjliggör hög reproducerbarhet och fullständighet av ryggmärgstransection över många djur och mellan olika sessioner, även för en otränad operatör. Dessutom är vävnadsskador främst begränsade till ryggmärgen själv, vilket minskar förvirrande effekter från att skada olika vävnader, t.ex. hud, muskler och CNS. Dessutom är hemi-lesioner i ryggmärgen möjliga. Förbättrad bevarande av vävnad integritet efter laser skada underlättar ytterligare dissekeringar som behövs för ytterligare analyser, såsom elektrofysiologi. Därför erbjuder denna metod exakt kontroll av den skada som är ouppnåelig manuellt. Detta möjliggör nya experimentella paradigm i denna kraftfulla modell i framtiden.
Introduction
I motsats till däggdjur kan zebrafisk (Danio rerio) reparera sitt centrala nervsystem (CNS) efter skada1. Användningen av zebrafisklarver som modell för ryggmärgsregenerering är relativt ny. Det har visat sig värdefullt att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger till grund för reparation2. Detta beror på hur lätt manipulering, den korta experimentella cykeln (nya larver varje vecka), vävnadernas optiska transparens och larvernas lilla storlek, idealisk för in vivo fluorescensmikroskopi.
Vid ryggmärgsregenerering är två ytterligare fördelar med att använda larver återhämtningshastigheten, några dagar jämfört med några veckor för vuxna och hur lätt det är att inducera skador med hjälp av manuella tekniker. Detta har framgångsrikt använts i många studier3,4,5, inklusive nyligen genomförda undersökningar6,7. Sammantaget leder detta till ökad meningsfull dataproduktion, hög anpassningsförmåga för experimentella protokoll och minskade experimentella kostnader. Användningen av larver yngre än 5 dagar efter befruktning minskar också användningen av djur enligt 3R-principerna i djurforskning8.
Efter en ryggmärgsskada i zebrafisklarver uppstår många biologiska processer, inklusive inflammatoriskt svar, cellproliferation, neurogenes, migrering av överlevande eller nygenererade celler, reformation av funktionella axoner och en global ombyggnad av neurala processer kretsar och ryggradsvävnader6,7,9,10 . För att framgångsrikt orkestreras innebär dessa processer en fint reglerad interaktion mellan en rad celltyper, extracellulära matriskomponenter och biokemiska signaler11,12. Att reda ut detaljerna i denna betydande omorganisation av en komplex vävnad som ryggmärgen kräver användning och utveckling av exakta och kontrollerade experimentella metoder.
Det primära experimentella paradigmet som används för att studera ryggmärgsregenerering hos zebrafisk är att använda kirurgiska medel för att inducera vävnadsskador genom samband, stickning eller kryoinjury3,13. Dessa metoder har nackdelen att kräva särskild utbildning i mikrokirurgifärdigheter, vilket är tidskrävande för alla nya aktörer och kan förhindra att de används i kortsiktiga projekt. Dessutom inducerar de vanligtvis skador på de omgivande vävnaderna, vilket kan påverka regenerering.
Ett annat tillvägagångssätt är att inducera cellskador kemiskt14 eller genom genetiska manipuleringar15. Den senare möjliggör mycket riktade skador. En sådan teknik kräver dock långt förberedande arbete för att generera ny transgen fisk innan du gör något experiment, förnyas varje gång en unik celltyp är riktad.
Det finns således behovet av en metod som möjliggör riktade men mångsidiga skador som är lämpliga för en mängd olika studier i regenerering. En lösning är att använda en laser för att inducera lokaliserade skador i vävnaden av intresse16,17,18,19,20. Användningen av laser-inducerad vävnad skador utgör en robust strategi för att generera ryggmärg organskador med många fördelar. Mikroskopen utrustade med sådana lasermanipulationsmoduler gör det möjligt att specificera ett anpassat format område där cellablation kommer att uppstå, med den extra fördelen med temporal kontroll. Storleken och positionen för lesionen kan således anpassas för att ta itu med eventuella frågor.
Den saknade funktionen hos de flesta laser lesion system är möjligheten att inducera skador på ett mycket reproducerbart sätt för en serie larver. Här beskrivs ett ursprungligt protokoll med hjälp av en UV-laser för att inducera halvautomatiska exakta och kontrollerade skador i zebrafisklarver baserade på en mikrofluidisk plattform utformad för automatiserad larverhantering21. Dessutom sätts larver i ett glaskapillär i det system som presenteras här i en glaskapillär, vilket tillåter fri rotation av djuret runt sin rostrocaudalaxel. Användaren kan välja vilken sida av larven som ska presenteras för lasern samtidigt som fluorescensavbildningen exakt kan rikta laserstrålen och bedöma skadan efter lesionen.
Protokollet som beskrivs här används med ett halvautomatiskt zebrafisk larver imaging system kombinerat med en snurrande skiva utrustad med en UV-laser (betecknas nedan som VAST-systemet). Protokollets huvudpunkter och de flesta påståendena om tekniken är dock giltiga för alla system som är utrustade med en laser som kan cellablation, inklusive två fotonlaserskanningsmikroskop, spinndiskmikroskop som är försedda med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskop med en lasermodul för fotomanipulation. En av de största skillnaderna mellan VAST-systemet och konventionell provhantering kommer att vara att för den senare kommer montering av larver i lågsmältpunktsagaros på glasöverdrag/petriskål med glasbotten i stället för lastning av dem i en 96-brunnsplatta att krävas.
Fördelarna med denna metod öppnar möjligheter för innovativ forskning om cellulära och molekylära mekanismer under regenereringsprocessen. Dessutom möjliggör den höga datakvaliteten kvantitativa undersökningar i ett tvärvetenskapligt sammanhang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett trängande behov av en djupare förståelse för de processer som står på spel under regenerering hos zebrafisk. Denna djurmodell erbjuder många fördelar för biomedicinsk forskning, särskilt för ryggmärgsskador1. De flesta av studierna involverar manuella lesioner som kräver en välutbildad operatör och inducerar skador i flera vävnader. En laser lesion protokoll presenteras här, tillåter kontroll över lesion egenskaper och minskade skador på de omgivande vävnaderna. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av BBSRC (BB/S0001778/1). CR finansieras av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi tackar David Greenald (CRH, University of Edinburgh) och Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) för den typ av transgen fisk (se kompletterande fil). Vi tackar Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) för den vänliga tillgången till 3i spinning-disk confocal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
- Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
- Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
- Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
- . National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: https://nc3rs.org.uk (2021)
- Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
- Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
- Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
- Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
- Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
- Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
- Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
- Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- . AndOr Micropoint Manual Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021)
- Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
- Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Howell, D. . Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).
- Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
- Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).
