Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish
Summary
O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.
Abstract
As larvas de zebrafish possuem um sistema nervoso central totalmente funcional (SNC) com alta capacidade regenerativa apenas alguns dias após a fertilização. Isso torna este modelo animal muito útil para estudar lesão medular e regeneração. O protocolo padrão para induzir tais lesões é transectar a parte dorsal do tronco manualmente. No entanto, essa técnica requer treinamento extensivo e danifica tecidos adicionais. Um protocolo foi desenvolvido para lesões induzidas por laser para contornar essas limitações, permitindo alta reprodutibilidade e completude da transeção da medula espinhal sobre muitos animais e entre diferentes sessões, mesmo para um operador não treinado. Além disso, os danos teciduais são limitados principalmente à medula espinhal em si, reduzindo os efeitos de confusão de ferir diferentes tecidos, por exemplo, pele, músculo e CNS. Além disso, são possíveis lesões hemi-lesões da medula espinhal. A melhoria da preservação da integridade tecidual após lesão a laser facilita novas dissecções necessárias para análises adicionais, como a eletrofisiologia. Assim, este método oferece um controle preciso da extensão da lesão que é inalcançável manualmente. Isso permite novos paradigmas experimentais neste modelo poderoso no futuro.
Introduction
Em contraste com os mamíferos, o zebrafish (Danio rerio) pode reparar seu sistema nervoso central (SNC) após lesões1. O uso de larvas de zebrafish como modelo de regeneração da medula espinhal é relativamente recente. Provou-se valioso para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao reparo2. Isso se deve à facilidade de manipulação, ao curto ciclo experimental (novas larvas a cada semana), à transparência óptica dos tecidos e ao pequeno tamanho das larvas, idealmente adequada para microscopia de fluorescência in vivo .
No caso da regeneração da medula espinhal, duas vantagens adicionais do uso de larvas são a velocidade de recuperação, alguns dias em comparação com algumas semanas para adultos, e a facilidade de induzir lesões usando técnicas manuais. Isso tem sido usado com sucesso em muitos estudos3,4,5, incluindo investigações recentes6,7. No geral, isso leva ao aumento da produção significativa de dados, alta adaptabilidade dos protocolos experimentais e diminuição dos custos experimentais. O uso de larvas com menos de 5 dias após a fertilização também reduz o uso de animais seguindo os princípios 3R em pesquisas animais8.
Após uma lesão medular em larvas de zebrafish, muitos processos biológicos ocorrem, incluindo resposta inflamatória, proliferação celular, neurogênese, migração de células sobreviventes ou recém-geradas, reforma de axônios funcionais e uma remodelagem global de circuitos de processos neurais e tecidos da coluna vertebral6,7,9,10 . Para serem orquestrados com sucesso, esses processos envolvem uma interação finamente regulada entre uma gama de tipos de células, componentes de matriz extracelular e sinais bioquímicos11,12. Desvendar os detalhes dessa reorganização significativa de um tecido complexo como a medula espinhal requer o uso e o desenvolvimento de abordagens experimentais precisas e controladas.
O paradigma experimental primário usado para estudar a regeneração da medula espinhal em zebrafish é usar meios cirúrgicos para induzir danos teciduais por ressecção, esfaqueamento ou crio lesão3,13. Essas abordagens têm a desvantagem de exigir treinamento específico em habilidades de microcirurgia, que é demorado para qualquer novo operador e pode impedir seu uso em projetos de curto prazo. Além disso, eles geralmente induzem danos aos tecidos circundantes, o que pode influenciar a regeneração.
Outra abordagem é induzir danos celulares quimicamente14 ou por manipulações genéticas15. Este último permite danos altamente direcionados. No entanto, tal técnica requer um longo trabalho preparatório para gerar novos peixes transgênicos antes de fazer qualquer experimento, renovado cada vez que um tipo de célula única é alvo.
Há, portanto, a necessidade de um método que permita lesões direcionadas, mas versáteis, adequadas a uma variedade de estudos em regeneração. Uma solução é usar um laser para induzir danos localizados no tecido de interesse16,17,18,19,20. De fato, o uso de danos teciduais induzidos por laser apresenta uma abordagem robusta para gerar lesões medular com muitas vantagens. Os microscópios equipados com tais módulos de manipulação a laser permitem especificar uma área em forma personalizada onde ocorrerá a ablação celular, com o benefício extra do controle temporal. O tamanho e a posição da lesão podem ser assim adaptados para responder a quaisquer questões.
A característica que falta na maioria dos sistemas de lesão a laser é a possibilidade de induzir lesões de forma altamente reprodutível para uma série de larvas. Aqui, um protocolo original é descrito usando um laser UV para induzir lesões precisas e controladas semi-automatizadas em larvas de zebrafish baseadas em uma plataforma microfluidica projetada para manuseio automatizado de larvas21. Além disso, no sistema aqui apresentado, as larvas são inseridas em um capilar de vidro, o que permite a livre rotação do animal em torno de seu eixo rostrocaudal. O usuário pode escolher qual lado da larva apresentar ao laser, permitindo que a imagem de fluorescência direja precisamente o raio laser e avalie o dano após a lesão.
O protocolo descrito aqui é usado com um sistema semi-automatizado de imagens de larvas de zebrafish combinado com um disco giratório equipado com um laser UV (designado a partir de agora como o sistema VAST). No entanto, os principais pontos do protocolo e a maioria das alegações da técnica são válidos para qualquer sistema equipado com um laser capaz de ablação celular, incluindo microscópios de varredura a laser de dois fótons, microscópios de disco giratório fornecidos com um laser UV (módulo FRAP), ou microscópios de vídeo com um módulo laser para manipulação de fotos. Uma das principais diferenças entre o sistema VAST e o manuseio convencional da amostra será que, para este último, serão necessárias larvas de montagem em pontos de baixa fusão em tampas de vidro/placas de petri de fundo de vidro no lugar de carregá-las em uma placa de 96 poços.
Os benefícios oferecidos por este método abrem oportunidades para pesquisas inovadoras sobre os mecanismos celulares e moleculares durante o processo de regeneração. Além disso, a alta qualidade dos dados permite investigações quantitativas em um contexto multidisciplinar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há uma necessidade urgente de uma compreensão mais profunda dos processos em jogo durante a regeneração em zebrafish. Este modelo animal oferece muitos benefícios para a pesquisa biomédica, em especial para lesões medular1. A maioria dos estudos envolve lesões manuais que requerem um operador bem treinado e induzem danos multi tecidos. Aqui é apresentado um protocolo de lesão a laser, permitindo o controle sobre as características da lesão e danos reduzidos aos tecidos circundantes. Al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo BBSRC (BB/S0001778/1). A CR é financiada pelo Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidade de Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de presente de peixe transgênico (Ver Arquivo Suplementar). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de acesso ao 3i spinning-disk confocal.
Materials
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Open-Source | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Microscope and accessories | |||
| ApoTome microscope | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens | Carl Zeiss | ||
| dual AxioCam 506 m CCD cameras | Carl Zeiss | ||
| Laser scanning confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Spinning-disk module CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Upright microscopeAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV laser | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri dish | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96-well plate | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antibodies | |||
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Mouse anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Mouse anti-tubulin acetylated antibody | Sigma | T6793 | |
| Transgenic zebrafish lines | |||
| Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | First described in [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) | N/A | Established by Katy Reid, University of Edinburgh | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Established by David Greenhald, University of Edinburgh |
References
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