Aptamer 친화성 비드를 사용한 그람 음성 박테리아의 유류 분리를 위한 미세유체 Acoustophoresis

요약

이 논문은 배지로부터 그람 음성 박테리아의 빠르고 효율적인 분리를 위해 사용될 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 사용하는 마이크로유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동을 설명한다.

초록

이 글에서는 배지로부터 그람 음성 박테리아를 빠르고 효율적으로 분리하는 데 사용할 수 있는 미세유체 acoustophoresis 기술 및 앱타머-개질된 마이크로비드를 이용한 미세유체 acoustophoretic 칩의 제조 및 작동에 대해 설명한다. 이 방법은 긴 사각형 마이크로 채널의 혼합을 사용하여 분리 효율을 향상시킵니다. 이 시스템에서, 샘플과 버퍼는 유동 제어기를 통해 입구 포트로 주입된다. 비드 센터링 및 샘플 분리를 위해 AC 전력은 전력 증폭기가 있는 함수 발생기를 통해 압전 트랜스듀서에 인가되어 마이크로채널에서 음향 방사력을 생성합니다. 입구와 출구 모두에 분기 채널이 있어 분리, 정화 및 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 이 장치는 10x 용량 농도까지 >98 %의 회복률과 97.8 %의 순도를 가지고 있습니다. 이 연구는 박테리아를 분리하는 기존의 방법보다 높은 회수율과 순도를 입증했으며, 이는 장치가 박테리아를 효율적으로 분리 할 수 있음을 시사합니다.

서론

유전체 전달, 자기 영동, 비드 추출, 필터링, 원심 미세 유체 공학 및 관성 효과, 표면 음향파 ^1,2에 기반한 방법 외에도 의료 및 환경 샘플에서 박테리아를 분리하기 위해 미세 유체 플랫폼이 개발되고 있습니다. 병원성 박테리아의 검출은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 계속되지만, 일반적으로 힘들고 복잡하며 시간이 많이 걸립니다 ^3,4. 미세유체 acoustophoresis 시스템은 합리적인 처리량 및 비접촉 세포 분리 ^5,6,7을 통해 이를 해결하기 위한 대안이다. Acoustophoresis는 음파를 통한 물질 이동 현상을 이용하여 비드를 분리하거나 농축하는 기술입니다. 음파가 마이크로채널에 들어갈 때, 이들은 비드의 크기, 밀도 등에 따라 분류되고, 세포는 현탁액 매질^(7,8)의 생화학적 및 전기적 ....

프로토콜

1. 미세 유체 acoustophoresis 칩 디자인

참고: 도 1 은 acoustophoresis에 의한 마이크로채널로부터 표적 마이크로비드의 분리 및 수집의 개략도를 도시한다. 미세유체 acoustophoresis 칩은 CAD 프로그램으로 설계되었습니다.

1. 장치의 분리 성능을 연구하기 위해 박테리아의 크기에 해당하는 앱타머 변형 비드와 스트렙타비딘 코팅 폴리스티렌(PS) 비드의 혼합물을 사용하는 미세유체 acoustophoresis 칩을 설계하십시오.
2. PS 비드를 표적 출구에 모으는 미세유체 acoustophoresis 칩을 설계하고, PS 샘플 혼합물을 샘플 입구에 주입한 후 출구를 통해 나머지를 버린다( 도 2 및 표 1 참조).
   참고: 이러한 목적을 위해 acoustofluidic 칩은 샘플과 버퍼를 주입하기 위한 두 개의 입구, 마이크로비드를 중앙에 정렬할 수 있도록 부착된 압전 트랜스듀서(PZT)가 부착된 주 채널, 시편을 수거하고 폐기물을 배출하는 두 개의 배출구로 구성되어 설계되었습니다(

결과

도 5는 PZT 전압(OFF, 0.1 V, 0.5 V, 5 V)의 함수로서 비드 유동의 이미지를 도시한다. 본 연구에 도입된 acoustophoretic 칩의 경우, PZT의 전압이 증가함에 따라, 10 μm 크기의 비드의 중심 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 10 μm 크기의 비드의 대부분은 PZT 전압의 5 V에서 중앙에 농축되었다. 이 결과를 통해 단일 채널 함수 발생기에서 3.66MHz의 공진 주파수가 생성되었고, 전력 증폭기를 사용하여 일반 신호가 16dB(약 9배)만큼 증폭되었습니다.

표 3 은 본 연구에 사용된 음향 유체 칩에 1 μm(세포 크기)와 10 μm(압타머 부착 비드)의 마이크로비드 혼합물을 주입한 결과를 나타낸 것으로, 유출 유량(400, 450 및 475 μL/min)에 따른 칩 분리 성능을 평가한 결과이다. 회수율은 10 μm 크기의 비드에 대한 주입된 비드의 총 수.......

토론

배양 시료로부터 GN 박테리아를 포획하여 그 크기와 종류에 따른 연속 실행 방법 및 앱타머 변형 마이크로비드를 기반으로 고속으로 포획하고 이송하기 위한 음파 부양 미세유체 장치를 개발하였다. 긴 정사각형 마이크로채널은 이전에 보고된 20,21,22,23,24,25,26보다 더 간단한 설계와 ^2D acoustophoresis에 대한 더 큰 비용 효율성을 가능하게 합니다. 이 장치는 10x 용량 농도까지 >98 %의 회복률을 보입니다. 본 연구는 박테리아를 분리하기 위한 기존의 라벨 프리 방법 20,21,22,23,24 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 &마이크로; m 폴리스티렌 마이크로비즈	Bang Laboratories	PS04001	셀 크기 비즈
10 &마이크로; m Streptavidin-coated microbeads	Bang Laboratories	CP01007	Aptamer 친화성 비드
4인치 실리콘 웨이퍼/SU-8 금형	4science	29-03573-01	칩의 구성 요소
Aptamer	Integrated DNA Technologies	GN3-6'RNA	for bacteria conjugation
붕규산 유리	Schott	BOROFLOAT 33
원심분리기	Daihan	CF-10	Wasing 입자
Cyanoacrylate 접착제	3M	AD100	PZT를 마이크로 칩
대장균 DH5 및 알파	KCTC	KCTC2571	표적 세균
기능성 발전기	GW Instek	AFG-2225	생성 주파수
고속 카메라	Photron	FASTCAM Mini	분리 관찰
핫 플레이트	As one	HI-1000	액체 경화용 가열판 PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL 주사기	Koreavaccine	22G-10ML	미세유체 음향 영동 채널을 기포가 없는 탈염수로 채웁니다.
액상 폴리디메틸실록산, PDMS	다우코닝 Inc.	Sylgard 184	칩의 구성 요소
LB Broth Miller	BD Difco	244620	세포 배양 (Luria-Bertani 매체)
현미경	Olympus Corp.	IX-81	분리
관찰 PBS 완충액	염소자리 과학	PBS-1A	Wasing 박테리아
PEEK 튜브	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	입자 주입 또는 수집
압전 변환기	Fuji Ceramics	C-213	채널에서 특정 파동 생성
전력 증폭기	증폭기 연구	75A250A	증폭
주파수 압력 컨트롤러/μ 플루콘	AMED	AMED-μ flucon	공기압/유량 제어 컨트롤러
Tris-HCl buffer	invitrogen	15567027	Wasing 입자
튜브 로테이터	SeouLin Bioscience	SLRM-3	수정 압타머 및 비드

칩 의 구성 요소에 부착하십시오.