Микрофлюидный акустофорез для сквозного разделения грамотрицательных бактерий с использованием аффинных шариков Аптамера
Summary
В данной работе описывается изготовление и эксплуатация микрофлюидных акустофоретических чипов с использованием метода микрофлюидного акустофореза и модифицированных аптамерами микрошариков, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного выделения грамотрицательных бактерий из среды.
Abstract
В этой статье описывается изготовление и эксплуатация микрофлюидных акустофоретических чипов с использованием метода микрофлюидного акустофореза и модифицированных аптамерами микрошариков, которые могут быть использованы для быстрого и эффективного выделения грамотрицательных бактерий из среды. Этот метод повышает эффективность разделения с помощью смеси длинных квадратных микроканалов. В этой системе образец и буфер вводятся во входной порт через контроллер потока. Для центрирования шариков и разделения образцов питание переменного тока подается на пьезоэлектрический преобразователь через функциональный генератор с усилителем мощности для создания силы акустического излучения в микроканале. Существует раздвоенный канал как на входе, так и на выходе, что обеспечивает одновременное разделение, очистку и концентрацию. Устройство имеет скорость восстановления >98% и чистоту от 97,8% до 10-кратной концентрации дозы. Это исследование продемонстрировало скорость восстановления и чистоту выше, чем существующие методы разделения бактерий, предполагая, что устройство может эффективно разделять бактерии.
Introduction
Разрабатываются микрофлюидные платформы для выделения бактерий из медицинских и экологических образцов, в дополнение к методам, основанным на диэлектрическом переносе, магнитофорезе, извлечении шариков, фильтрации, центробежной микрофлюидике и инерциальных эффектах, а также поверхностных акустическихволнах 1,2. Обнаружение патогенных бактерий продолжают с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), но обычно она трудоемкая, сложная и трудоемкая 3,4. Системы микрофлюидного акустофореза являются альтернативой для решения этой проблемы за счет разумной пропускной способности и бесконтактной изоляции клеток 5,6,7. Акустофорез — это технология, которая отделяет или концентрирует шарики, используя явление движения материала через звуковую волну. Когда звуковые волны попадают в микроканал, они сортируются по размеру, плотности и т. д. шариков, а клетки могут быть разделены в соответствии с биохимическими и электрическими свойствами суспензионной среды 7,8. Соответственно, активно проводилось много акустофоретических исследований 9,10,11, а в последнее время было введено 3D-численное моделирование акустофоретического движения, индуцированного граничным акустическим потоком в микрофлюидике акустических волн стоячей поверхности12.
Исследования в различных областях изучают, как заменить антитела 2,3. Аптамер является целевым материалом, обладающим высокой селективностью и специфичностью, и многие исследования проводятся 2,9,10,13. Аптамеры имеют преимущества небольшого размера, отличной биологической стабильности, низкой стоимости и высокой воспроизводимости по сравнению с антителами и изучаются в диагностических и терапевтических приложениях 2,3,14.
Здесь в этой статье описывается протокол технологии микрофлюидного акустофореза, который может быть использован для быстрого и эффективного отделения грамотрицательных (GN) бактерий из среды с использованием модифицированных аптамерами микрошариков. Эта система генерирует двумерную (2D) акустическую стоячую волну через одиночное пьезоэлектрическое срабатывание путем одновременной стимуляции двух ортогональных резонансов в длинном прямоугольном микроканале для выравнивания и фокусировки прикрепленных к аптамеру микрошариков в узле и точках антиузла для эффективности разделения 2,11,15,16 . Существует раздвоенный канал как на входе, так и на выходе, что обеспечивает одновременное разделение, очистку и концентрацию.
Этот протокол может быть полезен в области ранней диагностики бактериальных инфекционных заболеваний, а также быстрого, селективного и чувствительного ответа на патогенные бактериальные инфекции посредством мониторинга воды в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали микрофлюидное устройство звуковой левитации для захвата и передачи бактерий GN из образцов культуры на высокой скорости на основе метода непрерывного хода в соответствии с их размером и типом, а также модифицированных аптамерами микрошариков. Длинный квадратный микрок?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (Министерство науки и ИКТ). (Нет. НРФ-2021R1A2C1011380)
Materials
| 1 µm polystyrene microbeads | Bang Laboratories | PS04001 | Cell size beads |
| 10 µm Streptavidin-coated microbeads | Bang Laboratories | CP01007 | Aptamer affinity beads |
| 4-inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | Components of chip |
| Aptamer | Integrated DNA Technologies | GN3-6' | RNA for bacteria conjugation |
| Borosilicate glass | Schott | BOROFLOAT 33 | Components of chip |
| Centrifuge | Daihan | CF-10 | Wasing particles |
| Cyanoacrylate glue | 3M | AD100 | Attach PZT to microchip |
| Escherichia coli DH5α | KCTC | KCTC2571 | Target bacteria |
| Functional generator | GW Instek | AFG-2225 | Generate frequency |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of separation |
| Hot plate | As one | HI-1000 | Heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic acoustophoresis channel with bubble-free demineralized water. |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| LB Broth Miller | BD Difco | 244620 | Cell culture (Luria-Bertani medium) |
| Microscope | Olympus Corp. | IX-81 | Observation of separation |
| PBS buffer | Capricorn scientific | PBS-1A | Wasing bacteria |
| PEEK Tubes | Saint-Gobain Ppl Corp. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Piezoelectric transducer | Fuji Ceramics | C-213 | Generate specific wave in channel |
| Power amplifier | Amplifier Research | 75A250A | Amplify frequency |
| Pressure controller/μflucon | AMED | AMED-μflucon | Control of air pressure/flow controller |
| Tris-HCl buffer | invitrogen | 15567027 | Wasing particles |
| Tube rotator | SeouLin Bioscience | SLRM-3 | Modifiying aptamer and bead |
References
- Wu, M., et al. Acoustofluidic separation of cells and particles. Microsystem & Nanoengineering. 5 (1), 1-18 (2019).
- Lee, S. W., et al. Aptamer affinity-bead mediated capture and displacement of Gram-negative bacteria using acoustophoresis. Micromachines. 10 (11), 770 (2019).
- Hirvonen, J. J., et al. One-step sample preparation of positive blood cultures for the direct detection of methicillin-sensitive and -resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci within one hour using the automated GenomEra CDXTM PCR system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (10), 2835-2842 (2012).
- Swaminathan, B., Feng, P. Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. Annual Review of Microbiology. 48 (1), 401-426 (1994).
- Ding, X., et al. On-chip manipulation of single microparticles, cells, and organisms using surface acoustic waves. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 11105-11109 (2012).
- Karthick, S., et al. Acoustic impedance-based size independent isolation of circulating tumor cells from blood using acoustophoresis. Lab on a Chip. 18 (24), 2802 (2018).
- Lenshof, A., et al. Acoustofluidics 8: Applications of acoustophoresis in continuous flow microsystems. Lab on a Chip. 12 (7), 1210-1223 (2012).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Klussmann, S. . The aptamer handbook: Functional oligonucleotides and their applications. , (2006).
- Ellington, A., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Namnabat, M. S., et al. 3D numerical simulation of acoustophoretic motion induced by boundary-driven acoustic streaming in standing surface acoustic wave microfluidics. Scientific Reports. 11 (1), 11326 (2021).
- Nimjee, S. M., et al. Aptamer as therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 61-79 (2017).
- Zhang, Y., et al. Recent advances in aptamer discovery and application. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- Park, J. W., et al. Acousto-microfluidics for screening of ssDNA aptamer. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Persson, J., et al. Acoustic microfluidic chip technology to facilitate automation of phage display selection. The FEBS Journal. 275 (22), 5657-5666 (2008).
- Van Toan, N., et al. An investigation of processes for glass micromachining. Micromachines. 7 (3), 51 (2016).
- Jansen, H., et al. A survey on the reactive ion etching of silicon in microtechnology. Journal of Micromechanics and Microengineering. 6 (1), 14 (1996).
- Hanneborg, A., et al. Silicon-to-silicon anodic bonding with a borosilicate glass layer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 1 (3), 139 (1991).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnology and bioengineering. 107 (2), 302-311 (2010).
- Wang, S., et al. Simple filter microchip for rapid separation of plasma and viruses from whole blood. International Journal of Nanomedicine. 7, 5019-5028 (2012).
- Ai, Y., et al. Separation of Escherichia coli bacteria from peripheral blood mononuclear cells using standing surface acoustic waves. Analytical Chemistry. 85 (19), 9126-9134 (2013).
- Ohlsson, P., et al. Acoustic impedance matched buffers enable separation of bacteria from blood cells at high cell concentrations. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Park, S., et al. Continuous dielectrophoretic bacterial separation and concentration from physiological media of high conductivity. Lab on a Chip. 11 (17), 2893-2900 (2011).
- Kim, U., Soh, H. T. Simultaneous sorting of multiple bacterial targets using integrated Dielectrophoretic-Magnetic Activated Cell Sorter. Lab on a Chip. 9 (16), 2313-2318 (2009).
- Cai, G., et al. A fluidic device for immunomagnetic separation of foodborne bacteria using self-assembled magnetic nanoparticle chains. Micromachines. 9 (12), 624 (2018).
