Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

השבתה של פתוגנים באמצעות פוטוליזה של אור נראה של ריבופלבין-5′-פוספט

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשבתת חיידקים פתוגניים עם מיני חמצן תגובתי המיוצרים במהלך פוטוליזה של פלווין מונונוקלאוטיד (FMN) תחת קרינת אור כחול וסגול בעוצמה נמוכה. פוטוליזה FMN הוכחה כשיטה פשוטה ובטוחה לתהליכים סניטריים.

Abstract

ריבופלבין-5'-פוספט (או פלווין מונונוקלאוטיד; FMN) רגיש לאור הנראה. תרכובות שונות, כולל מיני חמצן תגובתי (ROS), יכולות להיווצר מפוטוליזה של FMN בעת הקרנה עם אור נראה. ה-ROS שנוצר מפוטוליזה של FMN מזיק למיקרואורגניזמים, כולל חיידקים פתוגניים כגון סטפילוקוקוס אאורוס (S. aureus). מאמר זה מציג פרוטוקול להשבתת S. aureus, כדוגמה, באמצעות תגובות פוטוכימיות המערבות FMN תחת קרינת אור נראה. האניון הרדיקלי סופראוקסיד (באנגלית: Superoxide radical anion) שנוצר במהלך פוטוליזה של FMN מוערך באמצעות הפחתת טראזוליום כחול ניטרו (Equation 1NBT). הכדאיות המיקרוביאלית של S. aureus המיוחסת למינים תגובתיים Equation 1 שימשה לקביעת יעילות התהליך. קצב ההשבתה של החיידקים פרופורציונלי לריכוז ה-FMN. אור סגול יעיל יותר בהשבתת S. aureus מאשר קרינת אור כחול, בעוד שהאור האדום או הירוק אינו מניע פוטוליזה של FMN. המאמר הנוכחי מדגים פוטוליזה FMN כשיטה פשוטה ובטוחה לתהליכים סניטריים.

Introduction

ריבופלבין-5′-פוספט (FMN) נוצר על ידי פוספורילציה במיקום 5′-ריבופלבין של שרשרת הצד של הריביטיל ונדרש על ידי כל חלבוני הפלבופרוטאין לתהליכים תאיים רבים כדי לייצר אנרגיה. זה גם משחק את התפקיד של ויטמין עבור כמה פונקציות בגוף האדם1. FMN מסיס בערך פי 200 במים מאשר ריבופלבין2.

ההשבתה הפוטודינמית האנטי-בקטריאלית (aPDI) של חיידקים היא דרך יעילה לשלוט בעמידות לחיידקים 3,4 מכיוון שהיא אינה תלויה במצב עמידות החיידקים. מבחינה קלינית, aPDI משמש לטיפול בזיהומים ברקמות רכות על מנת להפחית זיהום של עור nosocomial עקב חיידקים עמידים מרובים 5,6,7,8,9. aPDI גם מייצר מוות תאי על ידי יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS, כגון רדיקלים סופראוקסיד (באנגלית: ROS), כגון רדיקלים סופראוקסיד, חמצן סינגלט, רדיקלים הידרוקסיליים (Equation 1•OH) ורדיקלים פרוקסיליים, הם רדיקלים חופשיים או מולקולות המכילות חמצן תגובתי 10,11,12 והן בדרך כלל תגובתיות 13. בדומה לנזק לדנ"א שנגרם על ידי ROS, חמצון ממברנה והרס של תאי אנדותל הם גם תגובות ביוכימיות שליליות המיוחסות ל- ROS בתאים12.

השימוש ב- aPDI עבור חיידקים פתוגניים כרוך במקור אור נראה או UV כדי להשבית מיקרואורגניזמים בנוכחות תרכובות כימיות, כגון מתילתיוניניום כלוריד 14, PEI-c e6 מצומד15, פורפירין16, טיטניום דו-חמצני 17, טולוידין כחול O 18, וננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ 19. כחול טולוידין O ומתילן כחול הם צבעי פנותיאזיניום ולכחול מתילן יש תכונות רעילות. ננו-חלקיקים של תחמוצת אבץ וקרינת UV קשורים להשפעות בריאותיות וסביבתיות שליליות. ככזה, הניצול של פוטו-סנסיטייזר אמין, מאובטח ופשוט באמצעות פוטוליזה תחת הקרנה נראית לעין ראוי למחקר נוסף.

המיקרונוטריאנט, ריבופלבין או FMN, אינו רעיל ואכן משמש לייצור מזון או להאכלה20. גם FMN וגם ריבופלבין רגישים מאוד לקרינת אור2. תחת UV 1,2,21,22,23 וקרינת אור כחול 10,24, שתי תרכובות אלה משיגות מצב נרגש. הריבופלבין המופעל או FMN המיוצר על ידי פוטוליזה מקודם למצב השלישייה שלו ו- ROS נוצרים בו זמנית 2,25. Kumar et al. דיווחו כי ריבופלבין המופעל על ידי אור UV באופן סלקטיבי גורם לפגיעה מוגברת בגואנין מואטי של דנ"א במיקרואורגניזמים פתוגניים26. תחת הקרנה על ידי אור UV, ריבופלבין המופעל פוטודינמית הוכח כמקדם את הדור של 8-OH-dG, שהוא סמן ביולוגי לעקה חמצונית, בדנ"אדו-גדילי 27. הוא דיווח כי S. aureus ו E. coli מושבתים על ידי ROS במהלך riboflavin או FMN photolysis 10,24,28. מחקר קודם של המחברים הראה כי התגובות הפוטוליטיות המערבות ריבופלבין ו- FMN מפחיתות את סגול הגביש, צבע טריארילמתאן וסוכן אנטיבקטריאלי שמייצר Equation 1, ומבטלות את רוב היכולת האנטי מיקרוביאלית של קריסטל סגול28. כאשר פלווין אדנין דינוקלאוטיד או FMN מוקרן על ידי אור כחול, ROS וכתוצאה מכך לייצר אפופטוזיס בתאי HeLa עבור הרעלתם במבחנה29. באמצעות טיפול פוטוכימי בנוכחות ריבופלבין, Cui et al. לימפוציטים מומתים על ידי עיכוב התפשטותם וייצור ציטוקינים30.

הפוטוליזה של ריבופלבין משמשת להשבתה של פתוגן הדם על ידי UV 10,24, אך מרכיבי הדם יכולים להיפגע תחת קרינת אור UV30. כמו כן, דווח כי טסיות שנחשפו ל- UV משפרות בהדרגה את הביצועים של סמני ההפעלה P-selectin ו- LIMP-CD63 על הממברנות שלהם. יש לחקור את הציטוטוקסיות של UV והקרנה בעוצמה גבוהה ופוטו-סנסיטייזר שאינו מסובך ובטוח במהלך פוטו-ריאקציה של FMN המערבת אור נראה יהיה שימושי מאוד.

אור באורכי גל קצרים יותר הוא בעל אנרגיה רבה יותר והוא נוטה הרבה יותר לגרום נזק חמור לתאים. עם זאת, בנוכחות פוטוסנסיטייזר מתאים, הקרנה עם אור סגול בעוצמה נמוכה יכולה לעכב מיקרואורגניזמים פתוגניים. לפיכך, חשוב לחקור את הרגישות לאור הפוטו-סנסיטיזציה ואת יצירתה על Equation 1 ידי FMN כאשר היא מוקרנת באור סגול, על מנת לקבוע את המסלול שבו ROS מפוטוליזה של FMN מגבירה את ההשבתה של חיידקים.

בקרה אנטי-מיקרוביאלית היא בעיה נפוצה, והתפתחות של אנטיביוטיקות חדשות נמשכת לעתים קרובות עשרות שנים. לאחר הקרנה באור סגול, פוטו-אינאקטיבציה המתווכת על ידי FMN יכולה להשמיד חיידקים פתוגניים סביבתיים. מחקר זה מציג פרוטוקול אנטי-מיקרוביאלי יעיל במבחנה המשתמש באור סגול להנעת פוטוליזה של FMN ובכך יוצר Equation 1 עבור aPDI. הכדאיות המיקרוביאלית של S. aureus משמשת לקביעת ההיתכנות של aPDI המושרה על ידי FMN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הגדרת מערכת פוטוליזה

  1. הרכיבו שש דיודות פולטות אור (LED) (DC 12 V) על החלק הפנימי של פלסטיק אטומה (8 ס"מ x 7 ס"מ) כפי שמוצג באיור 1 כדי ליצור מערכת פוטוליזה31.
  2. הוסיפו מגיבים (ראו בהמשך) למבחנות הזכוכית (בקוטר 13 מ"מ ובגובה 100 מ"מ) והדקו את הצינורות בחלק העליון של הכוס, כפי שמוצג באיור 1. מקם את מערך הניסוי בחדר עם טמפרטורה קבועה של 25 ± 3 מעלות צלזיוס.
  3. נטר ורשום את הטמפרטורה של יחידות הבדיקה לאורך התגובות הפוטוליטיות על ידי מדחום אינפרא אדום.
    הערה: איור 2 מציג את ספקטרום הפליטה עבור אורות כחולים, ירוקים, אדומים וסגולים, כפי שתועד באמצעות ספקטרומטר אופטי מכויל UV-Vis. אורכי הגל המתאימים למקסימום הספיגה עבור נורות LED כחולות, ירוקות, אדומות וסגולות ששימשו במחקר הם 465, 529, 632 ו-405 ננומטר, בהתאמה. שבבי ה- LED יכולים לחמם את המנגנון במהלך ניסויי הקרנה. כל מערכת הפוטו-ריאקציה בכל ניסוי הונחה, אם כן, בחדר שבו הטמפרטורה נשמרה קבועה ב 25 ± 3 מעלות צלזיוס.

2. ההשפעה של אורך גל האור על הפוטוליזה של FMN (איור 3)

  1. הכן תמיסת FMN של 0.1 mM בחיץ אשלגן פוספט (PB) של 100 mM (pH 7.8). חשוף דגימות FMN (3 מ"ל כל אחת) לאור כחול, ירוק, אדום או סגול בעוצמה של 10 ואט/מ"רלמשך 5 דקות. שמור 3 מ"ל של תמיסת FMN בחושך כבקרה.
  2. תעד את הספיגה של דגימות FMN מוקרנות בטווח של 250-750 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV/נראה.

3. שיטת הפחתת הטרזוליום הכחול של ניטרו (NBT) לזיהוי Equation 1 (איור 4).

הערה: שיטת הפחתת ה- NBT המשמשת כאן שונתה מעט מהבדיקה עבור תגובת פוטו-רחיפה של ריבופלבין. שיטת הפחתת NBT משמשת להערכת רמת Equation 1 הפוטוליזה של FMN. ה-FMN הנרגש מבחינה פוטוכימית מצטמצם תחילה על-ידי L-מתיונין לסמיקינון, אשר לאחר מכן תורם אלקטרון לחמצן ומוליד 31Equation 1. כפי שנוצר Equation 1 מקטין NBT כדי formazan, אשר יש ספיגה אופיינית ב 560 ננומטר32.

  1. יש להוסיף 109.3 מ"ג של L-מתיונין ל-73.3 מ"ל של PB (100 מ"מ; pH 7.8). מערבלת את התמיסה להמסת L-מתיונין.
  2. לאחר שה-L-מתיונין מומס במלואו, יש להוסיף 10 מ"ג של אבקת NBT ו-1.53 מ"ל של 0.117 mM FMN לתמיסה. עבור כל 1 מ"ל של תמיסת התגובה (כלומר, תערובת של FMN, L-מתיונין ו-NBT), הריכוזים הסופיים של FMN, מתיונין ו-NBT הם 2.4 x 10-6 M, 1.0 x 10-2 M ו-1.6 x 10-4 M, בהתאמה.
  3. חשוף את תמיסת התגובה (1 מ"ל) לקרינת אור LED כחול או סגול בהספק של 10 ואט/מ"רלמשך 1-5 דקות.
  4. לזהות את Equation 1 המין (מן הספיגה ב 560 ננומטר) המיוצר על ידי התגובה הפוטוכימית, אשר מפחית NBT ומייצר formazan.

4. הכדאיות של S. aureus לאחר פוטוליזה של FMN (איור 5)

  1. להעביר מושבה של S. aureus(BCRC 10451) מצלחת מתורבתת לתוך 10 מ"ל של מרק Lysogeny נלקח במבחנה 15 מ"ל בורג מכסה. תרבית בשייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  2. העבר 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הוסף מים מעוקרים לצינור הצנטריפוגה כדי לדלל את התרבית לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר (OD600) (~6 x 107 CFU/mL).
  3. מעבירים 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ומעבירים את הסופר-נטנט כדי לקבל כדור תא.
  4. הוסף 1 מ"ל של תמיסה חוצצת FMN (30, 60 ו-120 μM FMN ב-PB) לכדורי התא שהתקבלו כמו בשלב 4.3, ולמערבולת. לבקרה מוקרנת, יש להוסיף 1 מ"ל של PB בלבד.
  5. העבירו 1 מ"ל כל אחד מתמיסות תאי חיידקים בנות קיימא המכילות 30 μM FMN ו-PB בלבד לתוך צינורות זכוכית, והקרינו אותם באור סגול ב-10 W/m 2 למשך 30 דקות.
  6. מעבירים 1 מ"ל כל אחד מתמיסות תאי חיידקים בנות קיימא המכילות 30, 60 ו-120 מיקרומטר FMN ו-PB בלבד לתוך צינורות זכוכית ומקרינים אותם באור כחול ב-20 W/m2 למשך 120 דקות. הגדר צינור זכוכית נוסף עם 1 מ"ל של תמיסת תאי חיידקים בת קיימא המכילה 120 μM FMN והקרן אותו באור כחול ב 20 W / m2 במשך 60 דקות.
  7. הגדר מבחנות כמתואר בשלבים 4.5 ו-4.6 וכסה אותן ביריעות אלומיניום עבות. צינורות אלה משמשים כבקרות כהות.
  8. שמור את תא ההקרנה (כמו גם את הפקדים הכהים) בחדר קר ב 9 ± 1 מעלות צלזיוס במהלך תקופת הקרנה 30-120 דקות.
    הערה: לא ניתן להתעלם מחום המשתחרר על ידי נורות LED מכיוון ששבבי ה-LED המונחים בתוך הכוס יכולים לחמם את מערכת הפוטו-ריאקציה במהלך ניסויי הקרנה. הניסויים נערכו, אם כן, בחדר קר שנשמר בטמפרטורה של 9 ± 1 מעלות צלזיוס.
  9. לאחר ההקרנה, העבר 0.2 מ"ל מכל אחת מתמיסות התגובה לצלחת לוריא אגר (LA). מורחים את החיידקים על הצלחת על ידי מוט זכוכית בצורת L ודוגרים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  10. חשב את ספירת הצלחות הקיימות ואת שיעורי ההשבתה של S. aureus לאחר צמיחה בן לילה.
    הערה: שיעור ההשבתה של S. aureus מחושב כהפחתה באחוזים, השווה ל-[1 -I / D] ×100%, כאשר I ו - D מציינים, בהתאמה, את מספר ה- CFUs בדגימה המוקרנת ובבקרה הכהה. ההפחתה באחוזים מוגדרת כערך שלילי של שיעור ההשבתה.

5. זיהוי של Equation 1S. aureus (איור 6) 

  1. הכן את דגימות S. aureus כמתואר בשלב 4.
  2. לדלל את צפיפות החיידקים של הדגימות במים מעוקרים לצפיפות אופטית של 0.5 ב-600 ננומטר (OD600, ~6 x 106 CFU/mL). העבר 0.5 מ"ל מהתרבית לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ו decant את supernatant כדי לקבל גלולה תא.
  3. הוסיפו 0.1093 גרם של L-מתיונין, 0.1 גרם של NBT ו-25 מ"ל של FMN (400, 240 או 120 מיקרומטר) ל-75 מ"ל של PB. עבור כל 1 מ"ל של המגיב המיושם, הריכוזים הסופיים של FMN, מתיונין ו- NBT הם 100 (60 או 30) x 10-6 M, 7.3 x 10-3 M, ו- 1.2 x 10-3 M, בהתאמה.
  4. הוסף 1 מ"ל מכל תמיסה מגיבה (כלומר, עם ריכוזי FMN משתנים) לכדורי התא המתקבלים כמו בשלב 5.2. להקרין את התמיסות על ידי אור סגול ב-10 W/m2 למשך 10 דקות.
  5. צנטריפוגה את התערובת ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ואת decant את supernatant. יש להשהות את הכדור ב-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי למצות את ה-NBT המופחת. זהה את המינים המיוצרים Equation 1 מהספיגה במהירות של 560 ננומטר.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. להביע נתונים כממוצע ± סטיית תקן (SD) של שלוש בדיקות בלתי תלויות.
  2. החל מבחן t הומוסקדאסטי בן שתי דגימות כדי להעריך אם שתי מדידות שונות. ערכי p < 0.05 נחשבים מובהקים סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השפעת אורך גל האור על FMN
ספקטרום הספיגה של 0.1 mM FMN המוקרן באמצעות נוריות LED כחולות, ירוקות, אדומות וסגולות מוצג באיור 3. ישנן שתי פסגות עבור FMN (372 ננומטר ו-444 ננומטר) עבור הבקרה החשוכה. לאור ירוק ואדום אין השפעה מכיוון ששינויים בספקטרום אינם משמעותיים. מצד שני, הקליטה המתאימה של FMN ב-444 ננומטר מופחתת בכ-19% ו-34%, בהתאמה, לאחר הקרנת אור כחול וסגול ב-10 W/m2 למשך 5 דקות, מה שמרמז על כך שהקרנה עם אור כחול/סגול מגבירה את הפוטוליזה של FMN.

זיהוי של Equation 10 מ-FMN המוקרן באמצעות אור כחול או סגול
הפחתת NBT שימשה לקביעת היווצרותם של Equation 132. FMN רגיש מאוד לאור נראה ואולטרה סגול אפילו לתקופות קצרות של קרינה. Equation 1 נוצר מתגובות פוטוכימיות ביניים במהלך הפוטוליזה של FMN. איור 4 מראה שההשפעה הפוטוכימית של FMN על הפחתת NBT תלויה בזמן ההקרנה, כפי Equation 1 שנוצר מ-FMN שנחשף לקרינת אור כחול או סגול באופן תלוי זמן. עם זאת, האפקט הפוטוליטי הממוצע של אור כחול ואור סגול דומה לזה שמוצג באיור 4.

השפעת פוטוליזה של FMN על הכדאיות של S. aureus
ההשפעה של FMN שנחשף לקרינת אור סגול או כחול על הכדאיות של S. aureus נקבעה. פוטוליזה של FMN באמצעות קרינת אור כחול או סגול גורמת להשבתה משמעותית של S. aureus. ככל שהריכוז של FMN גדול יותר, כך שיעור ההשבתה של S. aureus שנחשף לקרינת אור כחול ב-20 W/m2 למשך 120 דקות, כפי שמוצג באיור 5A. שיעורי השבתה של 26%, 39%, 43% ו-97% הושגו עבור S. aureus באמצעות 0, 30, 60 ו-120 μM FMN, בהתאמה, תחת הקרנה של אור כחול של 20 W/m2 למשך 120 דקות. כפי שניתן לראות באיור 5A, אין הבדל משמעותי (ערך p = 0.20) בקצב ההשבתה של S. aureus באמצעות קרינת אור כחול עם 60 μM FMN ב- 20 W/m 2 למשך 120 דקות (מינון אנרגיה, 14.4 J/cm 2) או 120 μM FMN ב- 20 W/m 2 למשך 60 דקות (מינון אנרגיה, 7.2 J/cm2). מצד שני, כפי שניתן לראות באיור 5B, שיעורי השבתה של 53% ו-96% הושגו עבור S. aureus ללא ועם 30 μM FMN, בהתאמה, תחת קרינת אור סגול ב-10 W/m 2 למשך 30 דקות (מינון אנרגיה של 1.8 J/cm2). לכן, FMN שנחשף לקרינת אור כחול או סגול יש השפעה גדולה יותר על הכדאיות של S. aureus על ידי הגדלת ההשבתה החיידקית. FMN שטופל בהקרנה של אור סגול יעיל יותר בהשבתת S. aureus.

זיהוי של Equation 10 ב- S. aureus שטופל ב- FMN תחת קרינת אור סגול
הייצור של Equation 1 S. aureus שטופל ב- FMN תחת קרינת אור סגול נקבע באמצעות שיטת הפחתת NBT. ערך הספיגה ב 560 ננומטר שימש להערכת היקף Equation 1 הייצור. ההשפעה הפוטוכימית של FMN על Equation 1 הדור ב-S. aureus היא פרופורציונלית לריכוז ה-FMN (איור 6). ערכי הספיגה של 560 ננומטר עבור S. aureus ללא טיפול FMN הם 0.31 ו-0.07 מתחת ל-10 W/m2 קרינת אור סגול למשך 10 דקות ובחושך, בהתאמה (איור 6). זה מצביע על כך שמעט מאוד Equation 1 הופק ב - S. aureus שלא טופל לאחר הקרנת אור סגול. ערכי הספיגה של 560 ננומטר בהתאמה עבור S. aureus שטופלו ב- 100 μM FMN הם 1.36 ו- 0.08 תחת הקרנה של אור סגול של 10 W/m2 למשך 10 דקות ובחושך, בהתאמה. לכן, ההשפעה הפוטוכימית על הפחתת NBT ב- S. aureus המטופל ב- FMN עולה תחת הקרנה סגולה, כפי Equation 1 שהיא מיוצרת בשפע.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של מערכת הפוטו-ריאקציה (photoreaction). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ספקטרום הפליטה של נורות LED כחולות, ירוקות, אדומות וסגולות במחקר זה. מקסימום הפליטה של האורות הכחולים, הירוקים, האדומים והסגולים הוא 465, 529, 632 ו-405 ננומטר, בהתאמה, והרוחב הספקטרלי בחצי גובה (W1/2) הוא 26, 31, 14 ו-12 ננומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ספקטרום ספיגה של FMN שטופל בנורות LED באורכי גל שונים ב-10 W/m 2 למשך 5 דקות.

Figure 4
איור 4: הפחתת NBT כדי לקבוע את ההשפעה של קרינת אור כחול וסגול ב-10 W/m2 למשך 1-5 דקות על פוטוליזה של FMN. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ההשפעה של פוטוליזה של FMN על הכדאיות של S. aureus. ההפחתה באחוזים מוגדרת כערך שלילי של שיעור ההשבתה עבור S. aureus שטופל ב-(A) FMN תחת קרינת אור כחול ב-20 W/m 2 למשך 120 דקות ו-(B) FMN תחת קרינת אור סגול ב-10 W/m2 למשך 30 דקות. שים לב שאין הבדל משמעותי (p = 0.20) בקצב ההשבתה עבור S. aureus באמצעות 60 μM FMN ב 20 W / m 2 הקרנה אור כחול במשך 120 דקות או 120 μM FMN ב 20 W / m2 הקרנה אור כחול במשך 60 דקות (A). התוצאות מבוטאות כממוצע ± SD, כאשר n = 3. *עמ' < 0.05; **עמ' < 0.01; עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: ההשפעה של ריכוז FMN על Equation 10 הדור ב-S. aureus הנתון לקרינת אור סגול ב-10 W/m 2 למשך 10 דקות. באופן כללי, מעט מאוד מיוצר ב- S. aureus בהיעדר FMN אם כי קרינת אור סגול עולה Equation 1 מעט Equation 1 בדגימה המוקרנת (PB (אור סגול)) ביחס לבקרת כהה (PB (כהה)). התוצאות מבוטאות כממוצע ± SD, כאשר n = 3. * עמ' < 0.05; ** עמ' < 0.01; עמ' < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פוטוסנסיטייזר מגביר את התגובה הפוטוכימית של תרכובות כימיות כדי ליצור ROS. מיקרואורגניזמים פתוגניים יכולים להיות מושתקים על ידי הקרנת אור בנוכחות פוטוסנסיטייזרים. מחקר זה קובע את ה- aPDI של S. aureus עקב ROS שנוצר על ידי הקרנת אור סגול של פוטוסנסיטייזר אקסוגני, FMN.

כפי שניתן לראות באיור 3, עבור FMN, הספיגה ב-444 ננומטר מופחתת באופן משמעותי לאחר 5 דקות של הקרנה באמצעות אור סגול או כחול ואין שינוי משמעותי בבליעת ה-FMN תחת הקרנה עם אור ירוק או אדום. הפחתת NBT משמשת לקביעת היווצרותו באמצעות Equation 1 תהליך העברת חיובים10,33. מחקר קודם של המחברים השתמש ב-FMN תחת קרינת אור כחול, ירוק או אדום כדי לקבוע את היווצרות השימוש Equation 1 בהפחתת NBT. קרינת אור כחול מייצרת כמות עצומה של בעוד שהיעילות הפוטוליטית של Equation 1 אור ירוק ואדום היא פחות מ-3% מזו המושגת על ידי אור כחול10. תוצאות אלה מראות כי תהליך העברת מטען נוצר כאשר FMN נחשף לקרינת אור כחול או סגול וכי אין שינוי משמעותי בהקרנה על ידי אור ירוק או אדום.

מחקר קודם של המחברים34 הראה כי ניתן לתאר את המנגנון לפוטוליזה של FMN עם תגובות פוטוליטיות ראשוניות של FMN (משוואה 1):

Equation 2 (1),

כאשר 1FMN* ו-3FMN* הם מצבי הסינגלט והשלישייה של ה-FMN הנרגש, בהתאמה. מנגנוני התגובה הפוטוליטית של ה-FMN הפוטו-אינדוקציה האלה מופעלים ככל הנראה על ידי השמדת שלישייה-שלישייה או תהליך מרווה של מצב שלשה-קרקע35,36,37,38. מצב הקרקע של FMN (FMN0) הוא תורם אלקטרונים המספק אלקטרון ל-3FMN* ומייצר את הצורות המופחתות למחצה (FMN•-) והמחומצנות למחצה (FMN•+), כפי שמוצג במשוואה 2

Equation 3 (2)

מסלולי הפירוק של FMN נובעים מרגישות לאור. FMN מקודם למצב ההתרגשות האלקטרונית, FMN•, באמצעות תגובה פוטוליטית ולאחר מכן, FMN נייטרלי מופחת כאשר FMN• מאבד אלקטרון, כפי שמוצג במשוואות 3-8 להלן:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

כאשר FMN•+ הוא מין קטיון רדיקלי.

האינטראקציה של FMN•- עם O2 (3Σg-) מייצרת את רדיקל הסופראוקסיד הריאקטיבי, ואחריו את רדיקל ההידרופרוקסיל, HOO•, Equation 1שנוצר בתגובה בין Equation 1 פרוטון ובסופו של דבר מוביל להתפרקות של FMN0:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

כאשר FMN•- הוא אניון רדיקלי.

במחקר הנוכחי, בהיעדר FMN, שיעור ההשבתה במקרה של S. aureus הוא 53% תחת קרינת אור סגול ב-10 W/m 2 למשך 30 דקות ו-26% תחת קרינת אור כחול ב-20 W/m2 למשך 120 דקות, מה שמרמז על כך שקרינת אור כחול משביתה פחות חיידקים מאשר אור סגול (איור 5). מוקדם יותר דווח כי הקרנה באורכי גל ארוכים מ-430 ננומטר ללא פוטו-סנסיטייזר אקסוגני אינה משביתה תאי S. aureus, אם כי לפורפירינים ב- S. aureus יש ספיגה מקסימלית ב- 405 ± 5 ננומטר וגורמים להשבתה חיידקית לאחר הקרנה39.

מחקר קודם של המחברים הנוכחיים הראה כי E. coli ו- S. aureus מושבתים על ידי ביקוע DNA המושרה על ידי היווצרות של פוטוליזה של ריבופלבין או FMN 10,24,40. שיעורי ההשבתה המתאימים עבור S. aureus הם 97% ו-96%, בהתאמה, תוך שימוש ב-120 μM FMN תחת 20 W/m 2 קרינת אור כחול (מינון אנרגיה של 14.4 J/cm 2) למשך 120 דקות ו-30 μM FMN תחת 10 W/m 2 קרינת אור סגול (מינון אנרגיה של 1.8 J/cm 2) למשך 30 דקות (איור 5). לכן, קרינת אור סגול יעילה יותר בהשבתת S. aureus מכיוון שמינונים נמוכים של אור סגול יכולים להשבית את S. aureus בנוכחות ריכוזי FMN נמוכים יותר ותקופות הארה קצרות יותר בהשוואה לאור כחול. אף על פי שמידת הפוטוליזה של FMN המושגת על-ידי אור סגול גבוהה יותר בהשוואה לאור כחול (איור 3), ההשפעות הפוטוליטיות הממוצעות של FMN על הפחתת NBT תחת קרינת אור כחול וסגול דומות (איור 4).

E. coli הוא חיידק גראם שלילי נפוץ. פוטוליזה של ריבופלבין או FMN על ידי קרינת אור כחול משביתה את E. coli באמצעות ROS 10,24,41 עם שיעור השבתה של 96% בעת שימוש ב- FMN10,24. S. aureus, לעומת זאת, הוא חיידק גראם חיובי, אשר למעשה מושתק על ידי פוטוליזה FMN תחת קרינת אור סגול, כפי שהודגם כאן (איור 5). לכן, תגובה פוטוליטית FMN תחת קרינת אור כחול או סגול יכולה לייצר ROS ולהשבית הן חיידקים גראם-שליליים והן חיידקים גראם-חיוביים.

בהיעדר FMN, לעומת זאת, מעט מיוצר ב- S. aureus החשוף לקרינת אור סגול (איור 6); לכן, פוטוסנסיטייזרים אנדוגניים רק מקטינים מעט Equation 1 את הכדאיות של S. aureus תחת הקרנה אור סגול, לעומת ההשפעה בנוכחות של פוטוסנסיטייזר אקסוגני כגון FMN. באותם תנאים, FMN שנחשף לקרינת אור סגול מקטין את הכדאיות של S. aureus כדי לגרום לשיעור השבתה של 96%, שהוא הרבה יותר גבוה מזה של פוטוסנסיטייזרים אנדוגניים תוך תאיים בלבד. הייצור של Equation 1 S. aureus שטופל ב-FMN תחת קרינת אור סגול גדל באופן משמעותי, כפי שמוצג באיור 6. תוצאות אלה מראות כי FMN בעת חשיפה לקרינת אור סגול גורמת לרמה גבוהה של השבתת חיידקים.

FMN יכול להשיג מצב של התרגשות צילום כאשר הוא מוקרן באמצעות UV 1,2,21,22,23, כחול 10,24 ואור סגול 31; עם זאת, יש להתייחס לציטוטוקסיות הנגרמת על ידי קרינת UV והקרנה באורך גל קצר בעוצמה גבוהה42. מצד שני, קרינה אדומה וירוקה עם אורכי גל ארוכים יותר אינן מייצרות כמויות משמעותיות של ROS במהלך פוטוליזה FMN10. לכן, ה- aPDI המושרה על ידי ROS של S. aureus דורש הקרנת FMN עם אור סגול בעל אורך גל בינוני. הרוחב הספקטרלי בחצי גובה (W1/2) עבור אור סגול חייב להיות צר כדי למנוע חפיפה עם ספיגת UV ולעכב סיכון עקב קרינת UV31. המיקרונוטריאנט, FMN, הוא ככזה מזיק, להיות ויטמין חיוני עבור גוף האדם. באמצעות פוטוסנסיטייזר מתאים כגון FMN, קרינת אור סגול באנרגיה נמוכה יכולה לדכא חיידקים פתוגניים, ומספקת אמצעי בטוח ויעיל לתהליך התברואתי. בנוסף לתגובה הפוטוליטית של FMN על S. aureus, נושאים אחרים ראויים לחקירה נוספת, כגון פוטוטוקסיות של FMN על חיידקים, הנובעת מהלחץ הנגרם על ידי Equation 1 , אשר ניתן לחקור באמצעות טכניקת RNA-seq יחד עם qPCR.

פוטוליזה של FMN באמצעות קרינת אור סגול מובילה לחמצון פוטוכימי שבאמצעותו נוצר ROS ומגביר בתורו את ההשבתה של חיידקים פתוגניים. השימוש באור סגול נחשב לצעד קריטי בפוטו-פירוק FMN. המגבלה של הטכניקה הנוכחית היא כי מרווח אורך הגל של אור סגול חייב להיות צר למדי כדי למנוע את הסיכון עקב קרינת UV. לשיטה הנוכחית יש פוטנציאל ליישומים רפואיים עתידיים, כגון טיפול בזיהומים של עור פני השטח יחד עם רקמות תת עוריות עמוקות או שרירים על ידי החדרת סיב אופטי להכוונת האור הסגול לאזורים הנגועים. טיפול פוטוכימי באמצעות FMN הוא אפוא דרך בטוחה ופשוטה להבטיח שיטות היגיינה יעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים מודים לד"ר טאק-ווה וונג ולמר זונג-ג'ה הסייה על תמיכתם בניסויים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 182 FMN פוטוליזה ROS S. aureus אור סגול
השבתה של פתוגנים <em>באמצעות</em> פוטוליזה של אור נראה של ריבופלבין-5′-פוספט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter