Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63531
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 3,4, 1
1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

Summary

Burada, düşük yoğunluklu mavi ve mor ışık ışınlaması altında flavin mononükleotidin (FMN) fotolizi sırasında üretilen reaktif oksijen türleri ile patojenik bakterileri inaktive etmek için bir protokol sunuyoruz. FMN fotolizinin sıhhi işlemler için basit ve güvenli bir yöntem olduğu gösterilmiştir.

Abstract

Riboflavin-5'-fosfat (veya flavin mononükleotid; FMN) görünür ışığa duyarlıdır. Reaktif oksijen türleri (ROS) de dahil olmak üzere çeşitli bileşikler, görünür ışıkla ışınlama üzerine FMN fotolizinden üretilebilir. FMN fotolizinden üretilen ROS, Staphylococcus aureus (S. aureus) gibi patojenik bakteriler de dahil olmak üzere mikroorganizmalara zararlıdır. Bu makale, örnek olarak, görünür ışık ışınlaması altında FMN'yi içeren fotokimyasal reaksiyonlar yoluyla S. aureus'u devre dışı bırakmak için bir protokol sunmaktadır. FMN fotolizi sırasında üretilen süperoksit radikal anyonu (), nitro mavi tetrazolyum (Equation 1NBT) indirgemesi ile değerlendirilir. Reaktif Equation 1 türlere atfedilen S. aureus'un mikrobiyal canlılığı, sürecin etkinliğini belirlemek için kullanılmıştır. Bakteriyel inaktivasyon oranı FMN konsantrasyonu ile orantılıdır. Mor ışık, S. aureus'u inaktive etmede mavi ışık ışınlamasından daha etkilidir, kırmızı veya yeşil ışık ise FMN fotolizini tetiklemez. Bu makalede, FMN fotolizi sıhhi işlemler için basit ve güvenli bir yöntem olarak gösterilmektedir.

Introduction

Riboflavin-5′-fosfat (FMN), ribityl yan zincirinin riboflavin 5′-pozisyonunda fosforilasyon ile oluşur ve enerji üretmek için çok sayıda hücresel işlem için tüm flavoproteinler tarafından gereklidir. Aynı zamanda insan vücudundaki bazı fonksiyonlar için vitamin rolünü oynar1. FMN, suda riboflavin 2'den yaklaşık200 kat daha fazla çözünür.

Bakterilerin antibakteriyel fotodinamik inaktivasyonu (aPDI), bakteri direncini kontrol etmenin etkili bir yoludur 3,4 çünkü bakteriyel direnç moduna bağlı değildir. Klinik olarak aPDI yumuşak doku enfeksiyonlarını tedavi etmek için çok dirençli bakterilere bağlı hastane derisi enfeksiyonunu azaltmak amacıyla kullanılır 5,6,7,8,9. aPDI ayrıca reaktif oksijen türleri (ROS) üreterek hücre ölümü üretir. Süperoksit radikalleri (), singlet oksijen, hidroksil radikalleri (Equation 1•OH) ve peroksil radikalleri gibi ROS, reaktif oksijen10,11,12 içeren ve normalde reaktif olan serbest radikaller veya moleküllerdir13. ROS'un neden olduğu DNA hasarına benzer şekilde, membran peroksidasyonu ve endotel hücrelerinin tahrip edilmesi de hücrelerde ROS'a atfedilen olumsuz biyokimyasal reaksiyonlardır12.

Patojenik bakteriler için aPDI kullanımı, metiltioninyum klorür 14, PEI-c e6 konjugat15, porfirin16, titanyum dioksit 17, toluidin mavisi O18 ve çinko oksit nanopartikülleri 19 gibi kimyasal bileşiklerin varlığında mikroorganizmaları inaktive etmek için görünür veya UV ışık kaynağını içerir. Toluidin mavisi O ve metilen mavisi fenotiyazinyum boyalarıdır ve metilen mavisi toksik özelliklere sahiptir. Çinko oksit nanopartikülleri ve UV ışınlaması, olumsuz sağlık ve çevresel etkilerle bağlantılıdır. Bu nedenle, görünür ışınlama altında fotoliz yoluyla güvenilir, güvenli ve basit bir fotosensitizörün kullanılması daha fazla çalışmayı hak etmektedir.

Mikro besin maddesi, riboflavin veya FMN, toksik değildir ve gerçekten de gıda üretimi veya beslenmesi için kullanılır20. Hem FMN hem de riboflavin, ışık ışınlamasına karşı oldukça hassastır2. UV 1,2,21,22,23 ve mavi ışık ışınlaması 10,24 altında, bu iki bileşik uyarılmış bir duruma ulaşır. Fotoliz ile üretilen aktif riboflavin veya FMN, üçlü durumuna terfi ettirilir ve ROS aynı anda2,25 üretilir. Kumar ve ark., UV ışığı tarafından aktive edilen riboflavinin, patojenik mikroorganizmalarda DNA'nın guanin moiety'sinde artmış yaralanmaya neden olduğunu seçici olarak bildirmiştir26. UV ışığı ile ışınlama altında, fotodinamik olarak aktive edilmiş riboflavinin, çift sarmallı DNA27'de oksidatif stres için bir biyobelirteç olan 8-OH-dG'nin üretimini teşvik ettiği gösterilmiştir. S. aureus ve E. coli'nin riboflavin veya FMN fotolizi 10,24,28 sırasında ROS tarafından devre dışı bırakıldığı bildirilmiştir. Yazarlar tarafından yapılan önceki bir çalışma, riboflavin ve FMN içeren fotolitik reaksiyonların kristal menekşe, bir triarilmetan boyası ve üreten Equation 1bir antibakteriyel ajanı azalttığını ve kristal menekşe28'in antimikrobiyal kapasitesinin çoğunu ortadan kaldırdığını göstermiştir. Flavin adenin dinükleotid veya FMN mavi ışıkla ışınlandığında, ortaya çıkan ROS, in vitro29 zehirlenmesi için HeLa hücrelerinde apoptoz üretir. Riboflavin varlığında fotokimyasal tedavi kullanarak, Cui ve ark. proliferasyonlarını ve sitokin üretimini inhibe ederek lenfositleri inaktive ettiler30.

Riboflavinin fotolizi, kan patojeninin UV 10,24 tarafından inaktive edilmesi için kullanılır, ancak UV ışık ışınlaması altında kan bileşenleri bozulabilir30. Ayrıca, UV'ye maruz kalan trombositlerin, membranlarındaki P-selectin ve LIMP-CD63 aktivasyon belirteçlerinin performansını giderek arttırdığı bildirilmektedir. UV ve yüksek yoğunluklu ışınlamanın sitotoksisitesinin araştırılması gerekir ve görünür ışığı içeren bir FMN fotoreaksiyonu sırasında karmaşık olmayan ve güvenli bir fotosensitizör çok faydalı olacaktır.

Daha kısa dalga boylarındaki ışık daha fazla enerjiye sahiptir ve hücrelere ciddi zararlar verme olasılığı çok daha yüksektir. Bununla birlikte, uygun bir fotosensitizörün varlığında, düşük yoğunluklu mor ışıkla ışınlama patojenik mikroorganizmaları inhibe edebilir. Mor ışıkla ışınlandığında FMN'nin Equation 1 ışığa duyarlı hale getirilmesi ve üretilmesi, FMN fotolizinden ROS'un bakterilerin inaktivasyonunu arttırdığı yolu belirlemek için çalışmak için önemlidir.

Antimikrobiyal kontrol yaygın bir konudur ve yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi sıklıkla on yıllar alır. Menekşe ışıkla ışınlamadan sonra, FMN tarafından aracılık edilen fotoinaktivasyon, çevresel patojenik bakterileri yok edebilir. Bu çalışma, FMN fotolizini sürmek ve böylece PDI için üretmek Equation 1 için mor ışık kullanan etkili bir antimikrobiyal protokolü in vitro olarak sunmaktadır. S. aureus'un mikrobiyal canlılığı, FMN kaynaklı aPDI'nın fizibilitesini belirlemek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fotoliz sistemi kurulumu

  1. Bir fotoliz sistemi kurmak için Şekil 1'de gösterildiği gibi opak bir plastik kabın (8 cm x 7 cm) içine altı ışık yayan diyot (LED) (DC 12 V) monte edin31.
  2. Cam test tüplerine (13 mm çapında ve 100 mm yüksekliğinde) reaktanlar ekleyin (aşağıya bakınız) ve tüpleri Şekil 1'de gösterildiği gibi kabın üstüne sabitleyin. Deney düzeneğini 25 ± 3 °C sabit bir sıcaklığa sahip bir odaya yerleştirin.
  3. Fotolitik reaksiyonlar boyunca test ünitelerinin sıcaklığını kızılötesi termometre ile izleyin ve kaydedin.
    NOT: Şekil 2 , kalibre edilmiş bir UV-Vis optik spektrometresi kullanılarak kaydedilen mavi, yeşil, kırmızı ve mor ışıklar için emisyon spektrumlarını göstermektedir. Çalışmada kullanılan mavi, yeşil, kırmızı ve mor LED ışıkları için maksimum absorbansa karşılık gelen dalga boyları sırasıyla 465, 529, 632 ve 405 nm'dir. LED çipleri, ışınlama deneyleri sırasında cihazı ısıtabilir. Bu nedenle, her deneydeki tüm fotoreaksiyon sistemi, sıcaklığın 25 ± 3 ° C'de sabit tutulduğu bir odaya yerleştirildi.

2. Işık dalga boyunun FMN fotolizi üzerindeki etkisi (Şekil 3)

  1. 100 mM potasyum fosfat tamponunda (PB) (pH 7,8) 0,1 mM FMN çözeltisi hazırlayın. FMN numunelerini (her biri 3 mL) 5 dakika boyunca 10 W/m2 yoğunlukta mavi, yeşil, kırmızı veya mor ışığa maruz bırakın. Kontrol olarak 3 mL FMN solüsyonunu karanlıkta tutun.
  2. Bir UV / Görünür spektrofotometre kullanarak ışınlanmış FMN numunelerinin 250-750 nm aralığındaki emiciliğini kaydedin.

3. Nitro mavisi tetrazolium (NBT) indirgeme yöntemini tespit Equation 1 etmek (Şekil 4).

NOT: Burada kullanılan NBT indirgeme yöntemi, riboflavin fotoreaksiyonu için yapılan tahlilden biraz değiştirilmiştir. NBT indirgeme yöntemi, FMN fotolizinden üretilen seviyeyi Equation 1 değerlendirmek için kullanılır. Fotokimyasal olarak uyarılmış FMN ilk önce L-metiyonin tarafından bir semikinona indirgenir, daha sonra oksijene bir elektron bağışlayarak 31'eEquation 1 yükselir. Üretilen Equation 1 NBT, 560 nm 32'de karakteristik bir emilime sahip olan formazan'aindirgenir.

  1. 73.3 mL PB'ye (100 mM; pH 7.8) 109.3 mg L-metiyonin ekleyin. L-metiyonini çözmek için çözeltiyi vorteksleyin.
  2. L-metiyonin tamamen çözüldükten sonra, çözeltiye 10 mg NBT tozu ve 1.53 mL 0.117 mM FMN ekleyin. Uygulanan reaksiyon çözeltisinin her 1 mL'si (yani, FMN, L-metiyonin ve NBT karışımı) için, FMN, metiyonin ve NBT'nin nihai konsantrasyonları sırasıyla 2.4 x 10-6 M, 1.0 x 10-2 M ve 1.6 x 10-4 M'dir.
  3. Reaksiyon çözeltisini (1 mL) 1-5 dakika boyunca 10 W/m2'de mavi veya mor LED ışık ışınlamasına maruz bırakın.
  4. NBT'yi azaltan Equation 1 ve formazan üreten fotokimyasal reaksiyon tarafından üretilen türleri (560 nm'deki emilimden) tespit edin.

4. FMN fotolizi sonrası S. aureus canlılığı (Şekil 5)

  1. Bir S. aureus kolonisini (BCRC 10451) kültürlenmiş bir plakadan, 15 mL vidalı kapaklı bir test tüpünde alınan 10 mL Lysogeny suyuna iletin. 16 saat boyunca 37 ° C'de bir çalkalayıcıda kültür.
  2. Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kültürü 600 nm'de (OD 600) (~6 x 107 CFU/mL)0,5 optik yoğunluğa seyreltmek için santrifüj tüpüne sterilize edilmiş su ekleyin.
  3. Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatantı boşaltın.
  4. Adım 4.3'te ve vortekste olduğu gibi elde edilen hücre peletlerine 1 mL FMN tamponlu çözelti (PB'de 30, 60 ve 120 μM FMN) ekleyin. Işınlanmış kontrol için, yalnızca 1 mL PB ekleyin.
  5. Sadece 30 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücresi çözeltilerinin her birini 1 mL'lik canlı bakteri hücresi çözeltilerini cam tüplere aktarın ve bunları 30 dakika boyunca 10 W /m2'de mor ışıkla ışınlayın.
  6. Tek başına 30, 60 ve 120 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücresi çözeltilerinin her birini 1 mL'lik canlı bakteri hücresi çözeltilerini cam tüplere aktarın ve 120 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışıkla ışınlayın. 120 μM FMN içeren 1 mL canlı bakteri hücresi çözeltisi içeren başka bir cam tüp kurun ve 60 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışıkla ışınlayın.
  7. Test tüplerini adım 4.5 ve 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın ve kalın alüminyum folyolarla örtün. Bu tüpler karanlık kontroller görevi görür.
  8. Işınlama odasını (karanlık kontrollerin yanı sıra) 30-120 dakikalık ışınlama süresi boyunca 9 ± 1 ° C'de soğuk bir odada tutun.
    NOT: LED ışıkları tarafından salınan ısı göz ardı edilemez, çünkü bardağın içine yerleştirilen LED çipleri ışınlama deneyleri sırasında fotoreaksiyon sistemini ısıtabilir. Bu nedenle deneyler, 9 ± 1 ° C'de tutulan soğuk bir odada gerçekleştirildi.
  9. Işınlamadan sonra, reaksiyon çözeltilerinin her birinden 0,2 mL'yi bir Luria agar (LA) plakasına aktarın. Bakterileri L şeklinde bir cam çubukla plakanın üzerine yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  10. Uygulanabilir plaka sayısını ve S. aureus'un inaktivasyon oranlarını bir gecede büyümeden sonra hesaplayın.
    NOT: S. aureus'un inaktivasyon oranı, [1 -I / D] ×% 100'e eşit olan yüzde azalma olarak hesaplanır; burada I ve D , sırasıyla, ışınlanmış numunedeki CFU'ların sayısını ve karanlık kontrolü gösterir. Yüzde azalma, inaktivasyon oranının negatif bir değeri olarak tanımlanır.

5. S. aureus'unEquation 1 tespiti (Şekil 6) 

  1. S. aureus örneklerini adım 4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
  2. Numunelerin bakteri yoğunluğunu sterilize edilmiş suyla 600 nm'de 0,5 optik yoğunluğa (OD600, ~6 x 10 6 CFU/mL) kadar seyreltin. Kültürün 0,5 mL'sini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj yapın ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatantı boşaltın.
  3. 75 mL PB'ye 0,1093 g L-metiyonin, 0,1 g NBT ve 25 mL FMN (400, 240 veya 120 μM) ekleyin. Uygulanan reaktanların her 1 mL'si için, FMN, metiyonin ve NBT'nin nihai konsantrasyonları sırasıyla 100 (60 veya 30) x 10-6 M, 7.3 x 10-3 M ve 1.2 x 10-3 M'dir.
  4. Adım 5.2'de olduğu gibi elde edilen hücre peletlerine her bir reaktant çözeltisinden 1 mL (yani, değişen FMN konsantrasyonları ile) ekleyin. Çözeltileri 10 dakika boyunca 10 W/m2'de mor ışıkla ışınlayın.
  5. Karışımı 10 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı boşaltın. İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden askıya alın. Üretilen Equation 1 türleri 560 nm'deki absorbanstan tespit edin.

6. İstatistiksel analiz

  1. Üç bağımsız testin ortalama ± standart sapması (SD) olarak ekspres veriler.
  2. İki ölçümün farklı olup olmadığını değerlendirmek için homosedastik iki örneklemli bir t-testi uygulayın. 0.05 < p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Işık dalga boyunun FMN üzerine etkisi
Mavi, yeşil, kırmızı ve mor LED'ler kullanılarak ışınlanan 0.1 mM FMN'nin absorbans spektrumları Şekil 3'te gösterilmiştir. Karanlık kontrol için FMN için iki tepe noktası (372 nm ve 444 nm) vardır. Yeşil ve kırmızı ışığın hiçbir etkisi yoktur, çünkü spektrumdaki değişiklikler önemsizdir. Öte yandan, FMN'nin 444 nm'deki ilgili emilimi, 5 dakika boyunca 10 W /m2'de mavi ve mor ışık ışınlamasından sonra sırasıyla% 19 ve% 34 oranında azalır, bu da mavi / mor ışıkla ışınlamanın FMN fotolizini arttırdığını düşündürür.

Tespiti Equation 10 mavi veya mor ışık kullanılarak ışınlanan FMN'den
NBT indirgemesi 32 oluşumunu Equation 1 belirlemek için kullanıldı. FMN, kısa süreli radyasyon için bile görünür ve UV ışığına karşı oldukça hassastır. Equation 1 FMN'nin fotolizi sırasında ara fotokimyasal reaksiyonlardan oluşur. Şekil 4, FMN'nin NBT indirgemesi üzerindeki fotokimyasal etkisinin, zamana bağlı bir şekilde mavi veya mor ışık ışınlamasına maruz kalan FMN'den oluştuğu gibiEquation 1, ışınlama süresine bağlı olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, mavi ışığın ve mor ışığın ortalama fotolitik etkisi, Şekil 4'te gösterildiği gibi benzerdir.

FMN fotolizinin S. aureus canlılığı üzerine etkisi
Menekşe veya mavi ışık ışınlamasına maruz kalan FMN'nin S. aureus canlılığı üzerine etkisi belirlendi. Mavi veya mor ışık ışınlaması kullanılarak FMN fotolizi, S. aureus'un önemli ölçüde inaktivasyonuna neden olur. FMN konsantrasyonu ne kadar büyük olursa, Şekil 5A'da gösterildiği gibi 120 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışık ışınlamasına maruz kalan S. aureus'un inaktivasyon oranı da o kadar yüksek olur. S. aureus için sırasıyla 0, 30, 60 ve 120 μM FMN kullanılarak, 120 dakika boyunca 20 W/m2 mavi ışık ışınlaması altında %26, %39, %43 ve %97 inaktivasyon oranları elde edildi. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, 120 dakika boyunca 20 W/m2'de 60 μM FMN (enerji dozu, 14.4 J/cm2) veya 60 dakika boyunca20 W/m2'de 120 μM FMN (enerji dozu, 7,2 J/cm2). Öte yandan, Şekil 5B'de gösterildiği gibi, S. aureus için sırasıyla 30 μM FMN'siz ve 30 μM FMN'li olarak, 30 dakika boyunca 10 W /m2'de mor ışık ışınlaması altında (1.8 J /cm2 enerji dozu) inaktivasyon oranları elde edilmiştir. Bu nedenle, mavi veya mor ışık ışınlamasına maruz kalan FMN, bakteriyel inaktivasyonu artırarak S. aureus'un yaşayabilirliği üzerinde daha büyük bir etkiye sahiptir. Menekşe ışık ışınlaması ile tedavi edilen FMN, S. aureus inaktivasyonunda daha etkilidir.

Tespiti Equation 10 FMN ile muamele edilmiş S. aureus'ta mor ışık ışınlaması altında
Menekşe ışık ışınlaması Equation 1 altında FMN ile muamele edilmiş S. aureus'un üretimi, NBT indirgeme yöntemi kullanılarak belirlendi. Üretim derecesini Equation 1 değerlendirmek için 560 nm'deki absorbans değeri kullanılmıştır. FMN'nin S. aureus'ta üretim üzerindeki Equation 1 fotokimyasal etkisi FMN konsantrasyonu ile orantılıdır (Şekil 6). FMN tedavisi olmayan S. aureus için 560 nm absorbans değerleri, 10 dakika boyunca ve karanlıkta 10 W / m2 mor ışık ışınlaması altında sırasıyla 0.31 ve 0.07'dir (Şekil 6). Bu, mor ışık ışınlamasından sonra tedavi edilmemiş S. aureus'ta çok az şey Equation 1 üretildiğini göstermektedir. 100 μM FMN ile muamele edilen S. aureus için ilgili 560 nm absorbans değerleri, 10 dakika boyunca ve karanlıkta sırasıyla 10 W / m2 mor ışık ışınlaması altında 1.36 ve 0.08'dir. Bu nedenle, FMN ile muamele edilmiş S. aureus'ta NBT indirgemesi üzerindeki fotokimyasal etki, bol miktarda üretildiği gibi Equation 1 menekşe ışınlaması altında artar.

Figure 1
Şekil 1: Fotoreaksiyon sisteminin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Bu çalışmada mavi, yeşil, kırmızı ve mor LED ışıklarının emisyon spektrumları. Mavi, yeşil, kırmızı ve mor ışıklar için emisyon maksimumu sırasıyla 465, 529, 632 ve 405 nm'dir ve yarı yükseklikteki spektral genişlikler (W1/2) sırasıyla 26, 31, 14 ve 12 nm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: FMN'nin absorbans spektrumları, 5 dakika boyunca 10 W /m2'de çeşitli dalga boylarında LED'lerle muamele edilmiştir.

Figure 4
Şekil 4: 10 W/m2'de 1-5 dakika boyunca mavi ve mor ışık ışınlamasının FMN fotolizi üzerindeki etkisini belirlemek için NBT azaltımı.

Figure 5
Şekil 5: FMN fotolizinin S. aureus canlılığı üzerine etkisi. Yüzde azalma, (A) 120 dakika boyunca 20 W/ m2'de mavi ışık ışınlaması altında FMN ve (B) 30 dakika boyunca 10 W /m2'de mor ışık ışınlaması altında FMN ile muamele edilen S. aureus için inaktivasyon oranının negatif bir değeri olarak tanımlanır. 120 dakika boyunca 20 W/m2 mavi ışık ışınlamasında 60 μM FMN veya 60 dakika (A) için20 W/m2 mavi ışık ışınlamasında 120 μM FMN kullanan S. aureus için inaktivasyon oranında anlamlı bir fark olmadığını (p = 0,20) unutmayın. Sonuçlar, n = 3 olan SD ± ortalama olarak ifade edilir. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: FMN konsantrasyonunun S. aureus'ta 10 dakika boyunca 10 W/m2'de mor ışık ışınlamasına maruz kalan üretim üzerindeki Equation 10 etkisi. Genel olarak, FMN'nin yokluğunda S. aureus'ta çok az şey Equation 1 üretilir, ancak mor ışık ışınlaması ışınlanmış numunede (PB (Mor ışık)) karanlık kontrole (PB (Koyu)) göre hafifçe artarEquation 1. Sonuçlar, n = 3 olan SD ± ortalama olarak ifade edilir. * p < 0.05; ** p < 0,01; p 0.0001 <. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir fotosensitizör, ROS üretmek için kimyasal bileşiklerin fotokimyasal reaksiyonunu arttırır. Patojenik mikroorganizmalar, fotosensitizörlerin varlığında hafif ışınlama ile inaktive edilebilir. Bu çalışma, eksojen bir fotosensitizör olan FMN'nin mor ışık ışınlaması ile üretilen ROS'a bağlı olarak S. aureus'un aPDI değerini belirlemektedir.

Şekil 3'te gösterildiği gibi, FMN için, 444 nm'deki absorbans, mor veya mavi ışık kullanılarak 5 dakikalık ışınlamadan sonra önemli ölçüde azalır ve yeşil veya kırmızı ışıkla ışınlama altında FMN emiliminde önemli bir değişiklik yoktur. NBT indirgemesi,10,33 yük transfer işlemi yoluyla oluşumunu Equation 1 belirlemek için kullanılır. Yazarlar tarafından yapılan önceki bir çalışmada, NBT indirgeme kullanımının oluşumunu belirlemek için mavi, yeşil veya kırmızı ışık ışınlaması Equation 1 altında FMN kullanılmıştır. Mavi ışık ışınlaması Equation 1 muazzam miktarda üretirken, yeşil ve kırmızı ışığın fotolitik verimliliği, mavi ışık10 ile elde edilenin% 3'ünden daha azdır. Bu sonuçlar, FMN mavi veya mor ışık ışınlamasına maruz kaldığında bir yük transfer işleminin üretildiğini ve yeşil veya kırmızı ışıkla ışınlamada önemli bir değişiklik olmadığını göstermektedir.

Yazarlar tarafından yapılan önceki bir çalışma34 , FMN fotolizi mekanizmasının birincil FMN fotolitik reaksiyonları ile tanımlanabileceğini göstermiştir (Denklem 1):

Equation 2 (1),

burada 1FMN* ve 3FMN*, sırasıyla uyarılmış FMN'nin tekli ve üçlü durumlarıdır. Bu fotoindüklenmiş FMN için fotolitik reaksiyon mekanizmaları muhtemelen üçlü-üçlü imha veya üçlü zemin durumu söndürme işlemi35,36,37,38 ile başlatılır. FMN'nin zemin durumu (FMN0), Denklem 2'de gösterildiği gibi 3FMN'ye * elektron sağlayan ve yarı indirgenmiş (FMN • -) ve yarı oksitlenmiş (FMN • +) formları üreten bir elektron donörüdür.

Equation 3 (2)

FMN için fotodegradasyon yolları fotosensitizasyondan kaynaklanır. FMN, fotolitik bir reaksiyon yoluyla elektronik olarak uyarılmış duruma (FMN•) yükseltilir ve daha sonra, aşağıdaki Denklem 3-8'de gösterildiği gibi, FMN• bir elektron kaybettiğinde nötr bir FMN azalır:

Equation 4 (3)

Equation 5 (4)

Equation 6 (5),

burada FMN • + radikal bir katyon türüdür.

FMN•- ileO2 (3Σg-) etkileşimi, reaktif süperoksit radikalini üretir, Equation 1ardından bir proton ile arasındaki Equation 1 reaksiyonda üretilen ve sonunda FMN0'ın bozulmasına yol açan hidroperoksil radikali HOO•:

Equation 7 (6)

Equation 8 (7)

Equation 9 (8),

burada FMN•- radikal bir anyon olduğunu.

Bu çalışmada, FMN'nin yokluğunda, S. aureus durumunda inaktivasyon oranı, 30 dakika boyunca 10 W /m2'de mor ışık ışınlaması altında% 53 ve 120 dakika boyunca 20 W /m2'de mavi ışık ışınlaması altında% 26'dır, bu da mavi ışık ışınlamasının mor ışıktan daha az bakteriyi devre dışı bıraktığını düşündürmektedir (Şekil 5). Eksojen bir fotosensitizör olmadan 430 nm'den daha uzun dalga boylarında ışınlamanın S. aureus hücrelerini inaktive etmediği, ancak S. aureus'taki porfirinlerin 405 ± 5 nm'de maksimum emilime sahip olduğu ve ışınlama39'dan sonra bakteriyel inaktivasyona neden olduğu daha önce bildirilmiştir.

Mevcut yazarlar tarafından yapılan önceki bir çalışma, E. coli ve S. aureus'un, riboflavin veya FMN10,24,40'ın fotolizi yoluyla oluşumu ile indüklenen DNA bölünmesi ile devre dışı bırakıldığını göstermiştir. S. aureus için ilgili inaktivasyon oranları sırasıyla% 97 ve% 96'dır, 120 dakika boyunca 20 W / m2 mavi ışık ışınlaması (14.4 J / cm2 enerji dozu) altında120 μM FMN ve 30 dakika boyunca 10 W / m 2 mor ışık ışınlaması (1.8 J /cm2 enerji dozu) altında 30 μM FMN kullanılarak (Şekil 5). Bu nedenle, mor ışık ışınlaması, S. aureus'un devre dışı bırakılmasında daha etkilidir, çünkü düşük enerjili mor ışık dozları, mavi ışığa kıyasla daha düşük FMN konsantrasyonları ve daha kısa aydınlatma süreleri varlığında S. aureus'u devre dışı bırakabilir. Mor ışık ile elde edilen FMN fotolizinin derecesi mavi ışığa göre daha yüksek olmasına rağmen (Şekil 3), FMN'nin mavi ve mor ışık ışınlaması altında NBT redüksiyonu üzerindeki ortalama fotolitik etkileri benzerdir (Şekil 4).

E. coli yaygın bir Gram-negatif bakteridir. Mavi ışık ışınlaması ile Riboflavin veya FMN fotolizi, FMN 10,24 kullanıldığında% 96'lık bir inaktivasyon oranıyla ROS 10,24,41 yoluyla E. coli'yi inaktive eder. Öte yandan S. aureus, burada gösterildiği gibi, mor ışık ışınlaması altında FMN fotolizi ile etkili bir şekilde inaktive edilen Gram-pozitif bir bakteridir (Şekil 5). Bu nedenle, mavi veya mor ışık ışınlaması altında FMN fotolitik reaksiyonu ROS üretebilir ve hem Gram-negatif hem de Gram-pozitif bakterileri inaktive edebilir.

Bununla birlikte, FMN'nin yokluğunda, mor ışık ışınlamasına maruz kalan S. aureus'ta çok az şey Equation 1 üretilir (Şekil 6); Bu nedenle, endojen fotosensitizörler, FMN gibi eksojen fotosensitizörün varlığındaki etkiye kıyasla, mor ışık ışınlaması altında S. aureus'un yaşayabilirliğini sadece biraz azaltır. Aynı koşullar altında, mor ışık ışınlamasına maruz kalan FMN, S. aureus'un yaşayabilirliğini azaltarak% 96'lık bir inaktivasyon oranına neden olur, bu da yalnızca endojen hücre içi fotosensitizörlerden çok daha yüksektir. Mor ışık ışınlaması altında FMN ile muamele edilmiş S. aureus'un Equation 1 üretimi, Şekil 6'da gösterildiği gibi önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, mor ışık ışınlamasına maruz kaldığında FMN'nin yüksek düzeyde bakteriyel inaktivasyona neden olduğunu göstermektedir.

FMN, UV1,2,21,22,23, mavi 10,24 vemor ışık 31 kullanılarak ışınlandığında foto-uyarılmış bir duruma ulaşabilir; Bununla birlikte, UV radyasyonu ve yüksek yoğunluklu kısa dalga boylu ışınlamanın neden olduğu sitotoksisite42 olarak düşünülmelidir. Öte yandan, daha uzun dalga boylarına sahip kırmızı ve yeşil radyasyonlar, FMN fotolizi10 sırasında önemli miktarda ROS üretmez. Bu nedenle, S. aureus'un ROS kaynaklı aPDI'sı, FMN'nin ara dalga boyuna sahip mor ışıkla ışınlanmasını gerektirir. Mor ışık için yarım yükseklikteki spektral genişlik (W1/2), UV emilimi ile herhangi bir örtüşmeyi önlemek ve UV radyasyonu31 nedeniyle riski önlemek için dar olmalıdır. Mikro besin maddesi FMN, insan vücudu için gerekli bir vitamin olan zararsızdır. FMN gibi uygun bir fotosensitizör kullanarak, düşük enerjili mor ışık ışınlaması, patojenik bakterileri baskılayabilir ve sıhhi işlemin güvenli ve etkili bir yolunu sağlayabilir. FMN'nin S. aureus üzerindeki fotolitik reaksiyonuna ek olarak, FMN'nin mikroplar üzerindeki fototoksisitesi gibi, qPCR ile birlikte bir RNA-seq tekniği kullanılarak incelenebilen stresten Equation 1 kaynaklanan diğer konular daha fazla araştırmayı hak etmektedir.

Menekşe ışık ışınlaması yoluyla FMN fotolizi, ROS'un üretildiği fotokimyasal oksidasyona yol açar ve sırayla patojenik bakterilerin inaktivasyonunu arttırır. Mor ışığın kullanımı, FMN fotodekompozisyonunda kritik bir adım olarak kabul edilir. Mevcut tekniğin sınırlaması, UV ışınlamasından kaynaklanan riski önlemek için mor ışığın dalga boyu aralığının oldukça dar olması gerektiğidir. Mevcut yöntem, mor ışığı enfekte olmuş bölgelere yönlendirmek için bir optik fiber yerleştirerek derin deri altı dokular veya kaslarla birlikte yüzey derisinin enfeksiyon tedavisi gibi gelecekteki tıbbi uygulamalar için potansiyele sahiptir. Bu nedenle FMN kullanarak fotokimyasal işlem, etkili hijyen uygulamalarını sağlamak için güvenli ve basit bir yoldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, deneylere verdikleri destek için Dr. Tak-Wah Wong ve Bay Zong-Jhe Hsieh'e minnettardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blue, green and red LED lights Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan DC 12 V 5050
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 190186
Infrared thermometer Raytek Co. Santa Cruz, CA MT4
LB broth Difco Co., NJ
L-Methionine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 1.05707
NBT Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Canada
Power supply China tech Co., New Taipei City, Taiwan YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO R7774
RNase New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solar power meter Tenmars Electronics Co., Taipei, Taiwan TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan 10451
UV-Vis optical spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL USB4000
UV-Vis spectrophotometer Hitachi High-Tech Science Corporation,Tokyo, Japan U-2900
Violet LED Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jian, H. L., Cheng, C. W., Chen, L. Y., Liang, J. Y. The photochemistry of riboflavin. MC-Transaction on Biotechnology. 3, 1-11 (2011).
  2. Lin, Y., Eitenmiller, R. R., Landen, W. O. Riboflavin. Vitamin analysis for the health and food sciences. , CRC Press. 329-360 (2008).
  3. Xie, L. J., Wang, R. L., Wang, D., Liu, L., Cheng, L. Visible-light-mediated oxidative demethylation of N(6)-methyl adenines. Chemical Communications. 53 (77), 10734-10737 (2017).
  4. Tim, M. Strategies to optimize photosensitizers for photodynamic inactivation of bacteria. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 150, 2-10 (2015).
  5. Maisch, T., et al. Photodynamic inactivation of multi-resistant bacteria (PIB) - a new approach to treat superficial infections in the 21st century. Journal of the German Society of Dermatology. 9 (5), 360-366 (2011).
  6. Hamblin, M. R. Antimicrobial photodynamic inactivation: a bright new technique to kill resistant microbes. Current Opinion in Microbiology. 33, 67-73 (2016).
  7. Del Rosso, J. Q. Oral Doxycycline in the management of acne vulgaris: Current perspectives on clinical use and recent findings with a new double-scored small tablet formulation. The Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 8 (5), 19-26 (2015).
  8. Wong, T. W., et al. Photodynamic inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by indocyanine green and near infrared light. Dematologica Sinica. 36 (1), 8-15 (2018).
  9. Yuann, J. M. P., et al. Effects of free radicals from doxycycline hyclate and minocycline hydrochloride under blue light irradiation on the deactivation of Staphylococcus aureus, including a methicillin-resistant strain. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 226, 112370 (2022).
  10. Liang, J. Y., Cheng, C. W., Yu, C. H., Chen, L. Y. Investigations of blue light-induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide on inactivation of E. coli. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 143, 82-88 (2015).
  11. Yang, M. J., et al. Effects of blue-light-induced free radical formation from catechin hydrate on the inactivation of Acinetobacter baumannii, Including a carbapenem-resistant strain. Molecules. 23 (7), 1631 (2018).
  12. Yuann, J. M. P., et al. A study of catechin photostability using photolytic processing. Processes. 9 (2), 293 (2021).
  13. Yuann, J. M. P., Wang, J. S., Jian, H. L., Lin, C. C., Liang, J. Y. Effects of Clinacanthus nutans (Burm. f) Lindau leaf extracts on protection of plasmid DNA from riboflavin photoreaction. MC-Transaction on Biotechnology. 4 (1), 45-59 (2012).
  14. Rineh, A., et al. Attaching NorA efflux pump inhibitors to methylene blue enhances antimicrobial photodynamic inactivation of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii in vitro and in vivo. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 28 (16), 2736-2740 (2018).
  15. Dai, T., et al. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3929-3934 (2009).
  16. Nitzan, Y., Ashkenazi, H. Photoinactivation of Acinetobacter baumannii and Escherichia coli B by a cationic hydrophilic porphyrin at various light wavelengths. Current Microbiology. 42 (6), 408-414 (2001).
  17. Tseng, C. C., et al. Altered susceptibility to the bactericidal effect of photocatalytic oxidation by TiO2 is related to colistin resistance development in Acinetobacter baumannii. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (19), 8549-8561 (2016).
  18. Boluki, E., et al. Antimicrobial activity of photodynamic therapy in combination with colistin against a pan-drug resistant Acinetobacter baumannii isolated from burn patient. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 18, 1-5 (2017).
  19. Yang, M. Y., et al. Blue light irradiation triggers the antimicrobial potential of ZnO nanoparticles on drug-resistant Acinetobacter baumannii. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 180, 235-242 (2018).
  20. Code of Federal Regulations. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2009-title21-vol6/pdf/CFR-2009-title21-vol6-sec582-5695.pdf (2022).
  21. Lu, C. Y., et al. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 52 (1-3), 111-116 (1999).
  22. Sato, K., et al. The primary cytotoxicity in ultraviolet-a-irradiated riboflavin solution is derived from hydrogen peroxide. The Journal of Investigative Dermatology. 105 (4), 608-612 (1995).
  23. Tripathi, A. K., et al. Attenuated neuroprotective effect of riboflavin under UV-B irradiation via miR-203/c-Jun signaling pathway in vivo and in vitro. Journal of Biomedical Science. 21 (1), 39 (2014).
  24. Liang, J. Y., et al. Blue light induced free radicals from riboflavin on E. coli DNA damage. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 119, 60-64 (2013).
  25. Ottaway, P. B. The Technology of Vitamins in Food. , Chapman and Hall. London. Ch. 5 233-244 (1993).
  26. Kumar, V., et al. Riboflavin and UV-light based pathogen reduction: extent and consequence of DNA damage at the molecular level. Photochemistry and Photobiology. 80 (1), 15-21 (2004).
  27. Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K., Kawanishi, S. 8-Hydroxydeoxyguanosine formation at the 5'site of 5'-GG-3'sequences in double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13221-13227 (1993).
  28. Liang, J. Y., Yuann, J. M. P., Hsie, Z. J., Huang, S. T., Chen, C. C. Blue light induced free radicals from riboflavin in degradation of crystal violet by microbial viability evaluation. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 174, 355-363 (2017).
  29. Yang, M. Y., Chang, C. J., Chen, L. Y. Blue light induced reactive oxygen species from flavin mononucleotide and flavin adenine dinucleotide on lethality of HeLa cells. Journal of Photochemistry and Photobiology B, Biology. 173, 325-332 (2017).
  30. Cui, Z., Huang, Y., Mo, Q., Wang, X., Qian, K. Inactivation of lymphocytes in blood products using riboflavin photochemical treatment with visible light. Photochemistry and Photobiology. 84 (5), 1195-1200 (2008).
  31. Wong, T. W., Cheng, C. W., Hsieh, Z. J., Liang, J. Y. Effects of blue or violet light on the inactivation of Staphylococcus aureus by riboflavin-5′-phosphate photolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 173, 672-680 (2017).
  32. Russell, L. F., Vanderslice, J. T. Comprehensive review of vitamin B2 analytical methodology. Journal of Micronutrient Analysis. 8, 257-310 (1990).
  33. Cheng, C. W., Chen, L. Y., Chou, C. W., Liang, J. Y. Investigations of riboflavin photolysis via coloured light in the nitro blue tetrazolium assay for superoxide dismutase activity. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 148, 262-267 (2015).
  34. Huang, S. T., et al. Effects of 462 nm light-emitting diode on the inactivation of Escherichia coli and a multidrug-resistant by tetracycline photoreaction. Journal of Clinical Medicine. 7 (9), 278 (2018).
  35. Barua, M. G., Escalada, J. P., Bregliani, M., Pajares, A., Criado, S. Antioxidant capacity of (+)-catechin visible-light photoirradiated in the presence of vitamin B2. Redox Report: Communications in Free Radical Research. 22 (6), 282-289 (2017).
  36. Castillo, C., Criado, S., Díaz, M., García, N. A. Riboflavin as a sensitiser in the photodegradation of tetracyclines. Kinetics, mechanism and microbiological implications. Dyes and Pigments. 72 (2), 178-184 (2007).
  37. Huvaere, K., Sinnaeve, B., Van Bocxlaer, J., Skibsted, L. H. Flavonoid deactivation of excited state flavins: reaction monitoring by mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (36), 9261-9272 (2012).
  38. Massad, W. A., Bertolotti, S., Garcia, N. A. Kinetics and mechanism of the vitamin B2-sensitized photooxidation of isoproterenol. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 428-433 (2004).
  39. Maclean, M., MacGregor, S. J., Anderson, J. G., Woolsey, G. High-intensity narrow-spectrum light inactivation and wavelength sensitivity of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 285 (2), 227-232 (2008).
  40. Huang, S. T., et al. The influence of the degradation of tetracycline by free radicals from riboflavin-5'-phosphate photolysis on microbial viability. Microorganisms. 7 (11), 500 (2019).
  41. Maisch, T., et al. Fast and effective photodynamic inactivation of multiresistant bacteria by cationic riboflavin derivatives. PLoS One. 9 (12), 111792 (2014).
  42. Grijzenhout, M., et al. Ultraviolet-B irradiation of platelets induces a dose-dependent increase in the expression of platelet activation markers with storage. British Journal of Haematology. 83 (4), 627-632 (1993).

Tags

Biyomühendislik Sayı 182 FMN fotoliz ROS S. aureus mor ışık
Riboflavin-5′- <em>Fosfatın Görünür</em> Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T.… More

Cheng, C. W., Lee, S. Y., Chen, T. Y., Yuann, J. M. P., Chiu, C. M., Huang, S. T., Liang, J. Y. Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5′-Phosphate. J. Vis. Exp. (182), e63531, doi:10.3791/63531 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter