Summary

Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati

Published: May 13, 2022
doi:

Summary

Il protocollo qui dimostra che le vescicole extracellulari possono essere adeguatamente separate dai terreni di coltura cellulare condizionati utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture legate alla membrana lipidica di dimensioni nanometriche che vengono rilasciate da tutte le cellule, sono presenti in tutti i biofluidi e contengono proteine, acidi nucleici e lipidi che riflettono la cellula madre da cui derivano. La corretta separazione degli EV dagli altri componenti in un campione consente la caratterizzazione del loro carico associato e fornisce informazioni sul loro potenziale come comunicatori intercellulari e biomarcatori non invasivi per numerose malattie. Nel presente studio, le EV derivate dagli oligodendrociti sono state isolate dai terreni di coltura cellulare utilizzando una combinazione di tecniche all’avanguardia, tra cui l’ultrafiltrazione e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per separare le EV da altre proteine extracellulari e complessi proteici. Utilizzando colonne SEC disponibili in commercio, le EV sono state separate dalle proteine extracellulari rilasciate dalle cellule di oligodendroglioma umano sia in condizioni di controllo che di stress del reticolo endoplasmatico (ER). I marcatori EV canonici CD9, CD63 e CD81 sono stati osservati nelle frazioni 1-4, ma non nelle frazioni 5-8. GM130, una proteina dell’apparato di Golgi, e calnexina, una proteina integrale dell’ER, sono stati usati come marcatori EV negativi e non sono stati osservati in nessuna frazione. Inoltre, quando si raggruppano e si concentrano le frazioni 1-4 come frazione EV e le frazioni 5-8 come frazione proteica, è stata osservata l’espressione di CD63, CD81 e CD9 nella frazione EV. L’espressione di GM130 o calnexina non è stata osservata in nessuno dei tipi di frazione. Le frazioni aggregate da entrambe le condizioni di stress di controllo e ER sono state visualizzate con microscopia elettronica a trasmissione e le vescicole sono state osservate nelle frazioni EV, ma non nelle frazioni proteiche. Anche le particelle nell’EV e le frazioni proteiche di entrambe le condizioni sono state quantificate con l’analisi del tracciamento delle nanoparticelle. Insieme, questi dati dimostrano che SEC è un metodo efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare condizionati.

Introduction

L’esplosione di interesse nello studio delle vescicole extracellulari (EV) è stata accompagnata da importanti progressi nelle tecnologie e nelle tecniche utilizzate per separare e studiare queste particelle eterogenee di dimensioni nanometriche. Nel tempo trascorso dalla loro scoperta quasi quattro decenni fa1,2, queste piccole strutture membranose sono state trovate per contenere lipidi bioattivi, acidi nucleici e proteine, e svolgono un ruolo importante nella comunicazione intercellulare 3,4. Le EV vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e sono quindi presenti in tutti i fluidi biologici, compresi plasma sanguigno e siero, saliva e urina. Le EV all’interno di questi fluidi sono molto promettenti per servire come biomarcatori non invasivi per varie malattie, tra cui malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative, tumori e disturbi autoimmuni 5,6,7. Inoltre, gli studi meccanicistici in vitro possono essere eseguiti attraverso tecniche di coltura cellulare separando le EV rilasciate nel terreno di coltura 3,8,9.

Per comprendere il ruolo delle EV nella fisiopatologia della malattia, un’adeguata separazione dal fluido in cui si trovano è fondamentale. Il gold standard per la separazione delle EV è stato a lungo l’ultracentrifugazione differenziale (dUC)10, tuttavia sono emerse tecniche più sofisticate per ottenere una migliore separazione delle EV da altri componenti extracellulari. Alcune di queste tecniche includono gradienti di densità, frazione di flusso asimmetrico (A4F), citometria a flusso, immunocattura, precipitazione di polietilenglicole e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) 11,12,13. Ogni tecnica ha il suo insieme di vantaggi e svantaggi; tuttavia, la SEC in particolare ha dimostrato di separare gli EV sia dai fluidi biologici che dai supernatanti di coltura cellulare in modo abbastanza efficace 8,14,15. SEC ha anche il vantaggio di essere relativamente semplice e facile da usare.

SEC è un metodo che separa i componenti di un fluido in base alle dimensioni. Con questa tecnica, una colonna di resina (prodotta internamente o acquistata commercialmente) viene utilizzata per frazionare un campione. Le particelle piccole nel campione rimangono intrappolate tra le perle all’interno della resina, mentre le particelle più grandi sono in grado di passare attraverso la resina più liberamente, e quindi eluire all’inizio del processo. Poiché le EV sono di dimensioni maggiori rispetto a molte proteine extracellulari e aggregati proteici, le EV passano attraverso la colonna più velocemente e si eluiscono nelle frazioni precedenti rispetto alle proteine extracellulari14.

In questo documento sui metodi, viene delineato l’uso di SEC per la separazione di EV da terreni di coltura cellulare (CCM) da oligodendrociti umani in condizioni di stress sia di controllo che del reticolo endoplasmatico (ER). Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che le EV separate con questa tecnica si trovano all’interno di frazioni specifiche che possono essere raggruppate insieme e concentrate per la caratterizzazione a valle, e che le EV separate derivano da cellule e non da una fonte esogena come il siero bovino fetale (FBS) utilizzato per integrare il CCM. La presenza dei marcatori EV canonici, CD63, CD81 e CD916,17,18,19 nelle frazioni EV e la loro assenza nelle frazioni proteiche è dimostrata con western blotting. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le EV vengono visualizzate e visualizzano la morfologia attesa e vengono osservate solo nella frazione EV. Le particelle vengono anche contate nelle frazioni EV e proteiche di entrambe le condizioni di stress di controllo e ER, e un gran numero di particelle all’interno dell’intervallo di dimensioni previsto di 50-200 nm di diametro sono osservati nei campioni EV. Insieme, questi dati supportano l’idea che SEC sia un metodo efficiente ed efficace per separare le EV dai terreni di coltura cellulare.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti NOTA: Produrre reagenti di coltura cellulare nella cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità. Preparazione di reagenti di coltura cellularePreparare il normale DMEM ad alto contenuto di glucosio aggiungendo 50 ml di FBS e 5 ml di penicillina-streptococco (Pen-Strep) in 500 ml di DMEM ad alto contenuto di glucosio e conservare a 4 °C. Utilizzare questo mezzo per la coltura e l’espansione delle cellule. …

Representative Results

Il Western blotting rivela un’adeguata separazione dei veicoli elettrici dal CCMPer valutare l’efficacia del SEC per separare le EV dai terreni di coltura cellulare, è stata eseguita una macchia occidentale utilizzando ogni singola frazione dai campioni di controllo per sondare l’espressione dei tre marcatori EV canonici, CD9, CD63 e CD81, nonché GM130 e calnexin18, che sono stati utilizzati come controlli negativi (Figura 3). L’espressione dell…

Discussion

SEC è un metodo intuitivo per separare adeguatamente i veicoli elettrici dal CCM condizionato. Al fine di isolare specificamente le EV derivate da cellule, deve essere presa in considerazione un’attenta considerazione del tipo di CCM e dei suoi integratori. Molti terreni di coltura cellulare devono essere integrati con FBS, che contiene EV derivate dall’animale in cui è stato raccolto il siero. Queste EV sieriche possono saturare e mascherare qualsiasi segnale prodotto da EV derivate da cellule in coltura<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare la Penn State Behrend e la Hamot Health Foundation per i finanziamenti, nonché la Penn State Microscopy Facility di University Park, PA.

Materials

2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

References

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Cite This Article
Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

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