Summary

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Published: May 13, 2022
doi:

Summary

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Abstract

Hücre dışı veziküller (EV’ler), tüm hücrelerden salınan, tüm biyoakışkanlarda bulunan ve türetildikleri ana hücreyi yansıtan proteinler, nükleik asitler ve lipitler içeren nano boyutlu lipit-membrana bağlı yapılardır. EV’lerin bir numunedeki diğer bileşenlerden uygun şekilde ayrılması, ilişkili kargolarının karakterizasyonuna izin verir ve sayısız hastalık için hücreler arası iletişimciler ve invaziv olmayan biyobelirteçler olarak potansiyelleri hakkında fikir verir. Bu çalışmada, oligodendrosit türevi EV’ler, EV’leri diğer hücre dışı proteinlerden ve protein komplekslerinden ayırmak için ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) dahil olmak üzere en son tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak hücre kültürü ortamından izole edildi. Ticari olarak temin edilebilen SEC kolonları kullanılarak, EV’ler hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendroglioma hücrelerinden salınan hücre dışı proteinlerden ayrıldı. Kanonik EV belirteçleri CD9, CD63 ve CD81, 1-4 fraksiyonlarında gözlendi, ancak 5-8 fraksiyonlarında gözlenmedi. Golgi aparatının bir proteini olan GM130 ve ER’nin ayrılmaz bir proteini olan kalneksin, negatif EV belirteçleri olarak kullanıldı ve herhangi bir fraksiyonda gözlenmedi. Ayrıca, EV fraksiyonu olarak 1-4 fraksiyonlarını ve protein fraksiyonu olarak 5-8 fraksiyonlarını bir araya getirip yoğunlaştırırken, EV fraksiyonunda CD63, CD81 ve CD9 ekspresyonu gözlenmiştir. GM130 veya kalneksin ekspresyonu, fraksiyon tiplerinin hiçbirinde gözlenmedi. Hem kontrol hem de ER stres koşullarından toplanan fraksiyonlar transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirildi ve veziküller EV fraksiyonlarında gözlendi, ancak protein fraksiyonlarında gözlenmedi. EV’deki parçacıklar ve her iki koşuldan protein fraksiyonları da nanopartikül izleme analizi ile ölçüldü. Birlikte, bu veriler SEC’in EV’leri şartlandırılmış hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Introduction

Hücre dışı vezikülleri (EV’ler) incelemeye olan ilginin patlamasına, bu nano boyutlu, heterojen parçacıkları ayırmak ve incelemek için kullanılan teknoloji ve tekniklerdeki büyük gelişmeler eşlik etmiştir. Yaklaşık kırk yıl önce 1,2 keşfedilmelerinden bu yana geçen sürede, bu küçük membranöz yapıların biyoaktif lipitler, nükleik asitler ve proteinler içerdiği ve hücreler arası iletişimde önemli roller oynadığı bulunmuştur 3,4. EV’ler tüm hücre tiplerinden salınır ve bu nedenle kan plazması ve serum, tükürük ve idrar dahil olmak üzere tüm biyolojik sıvılarda bulunur. Bu sıvıların içindeki EV’ler, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar, kanserler ve otoimmün bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için invaziv olmayan biyobelirteçler olarak hizmet etme konusunda büyük umut vaat etmektedir 5,6,7. Ayrıca, in vitro mekanik çalışmalar, kültür ortamı 3,8,9’a salınan EV’leri ayırarak hücre kültürü teknikleri aracılığıyla gerçekleştirilebilir.

EV’lerin hastalık patofizyolojisindeki rolünü anlamak için, bulundukları sıvıdan yeterli ayrılma çok önemlidir. EV ayırma için altın standart uzun zamandır diferansiyel ultrasantrifüjleme (dUC)10 olmuştur, ancak EV’lerin diğer hücre dışı bileşenlerden daha iyi ayrılmasını sağlamak için daha sofistike teknikler ortaya çıkmıştır. Bu tekniklerden bazıları yoğunluk gradyanları, asimetrik akış alanı-akış fraksiyonu (A4F), akış sitometrisi, immünocapture, polietilen glikol çökeltmesi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) 11,12,13’tür. Her tekniğin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır; Bununla birlikte, özellikle SEC’in EV’leri hem biyolojik sıvılardan hem de hücre kültürü süpernatantlarından oldukça etkili bir şekilde ayırdığı gösterilmiştir 8,14,15. SEC ayrıca nispeten basit ve kullanıcı dostu olma bonusuna sahiptir.

SEC, bir sıvının bileşenlerini boyuta göre ayıran bir yöntemdir. Bu teknikle, bir numuneyi fraksiyone etmek için bir reçine sütunu (şirket içinde yapılan veya ticari olarak satın alınan) kullanılır. Numunedeki küçük parçacıklar reçine içindeki boncuklar arasında sıkışıp kalırken, daha büyük parçacıklar reçineden daha serbest bir şekilde geçebilir ve böylece işlemin başlarında ortaya çıkabilir. EV’ler birçok hücre dışı proteinden ve protein agregalarından daha büyük boyuttadır, EV’ler kolondan daha hızlı geçer ve hücre dışı proteinlerden daha erken fraksiyonlarda süzülür14.

Bu yöntem makalesinde, EV’lerin hücre kültürü ortamından (CCM) hem kontrol hem de endoplazmik retikulum (ER) stres koşulları altında insan oligodendrositlerinden ayrılması için SEC’in kullanımı özetlenmiştir. Bu protokolü kullanarak, bu teknikle ayrılan EV’lerin, birlikte toplanabilen ve aşağı akış karakterizasyonu için konsantre edilebilen spesifik fraksiyonlar içinde bulunduğu ve ayrılan EV’lerin, CCM’yi desteklemek için kullanılan fetal sığır serumu (FBS) gibi eksojen bir kaynaktan değil, hücrelerden türetildiği gösterilmiştir. EV fraksiyonlarında kanonik EV belirteçleri, CD63, CD81 ve CD916,17,18,19’un varlığı ve protein fraksiyonlarında yokluğu batı lekelenmesi ile gösterilmiştir. İletim elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak, EV’ler görselleştirilir ve beklenen morfolojiyi gösterir ve sadece EV fraksiyonunda gözlenir. Parçacıklar ayrıca hem kontrol hem de ER stres koşullarının EV ve protein fraksiyonlarında sayılır ve EV numunelerinde 50-200 nm çapında beklenen boyut aralığında çok sayıda parçacık gözlenir. Birlikte, bu veriler SEC’in EV’leri hücre kültürü ortamından ayırmak için etkili ve etkili bir yöntem olduğu fikrini desteklemektedir.

Protocol

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması NOT: Steriliteyi korumak için hücre kültürü reaktiflerini hücre kültürü davlumbazında yapın. Hücre kültürü reaktiflerinin hazırlanması500 mL yüksek glikoz DMEM’ine 50 mL FBS ve 5 mL penisilin-streptokok (Pen-Strep) ekleyerek normal yüksek glikoz DMEM’i hazırlayın ve 4 ° C’de saklayın. Hücreleri kültürlemek ve genişletmek için bu ortamı kullanın. 500 mL yüksek glikoz DMEM…

Representative Results

Batı lekelenmesi, EV’lerin CCM’den yeterli şekilde ayrıldığını ortaya koymaktadırEV’leri hücre kültürü ortamından ayırmak için SEC’in etkinliğini değerlendirmek için, kontrol örneklerinden her bir fraksiyon kullanılarak, üç kanonik EV belirtecinin, CD9, CD63 ve CD81’in yanı sıra negatif kontroller olarak kullanılan GM130 ve calnexin18’in ekspresyonunu araştırmak için bir batı lekesi çalıştırıldı (Şekil 3). Albü…

Discussion

SEC, EV’leri şartlandırılmış CCM’den yeterince ayırmak için kullanıcı dostu bir yöntemdir. Hücre kaynaklı EV’leri spesifik olarak izole etmek için, CCM tipinin ve takviyelerinin dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir. Birçok hücre kültürü ortamının, serumun toplandığı hayvandan türetilen EV’leri içeren FBS ile desteklenmesi gerekir. Bu serum EV’leri, kültür26’daki hücrelerden türetilen EV’ler tarafından üretilen herhangi bir sinyali doyurabilir ve maskeleye…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Penn State Behrend ve Hamot Sağlık Vakfı’na finansman için ve ayrıca University Park, PA’daki Penn State Mikroskopi Tesisi’ne teşekkür etmek istiyor.

Materials

2-Mercaptoethanol VWR 97064-588
4X Laemmli Sample Buffer BioRad 1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mL Sigma-Aldrich UFC900308 3 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane Sigma-Aldrich UFC200324 3 kDa cutoff
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked Antibody Cell Signaling Technology 7074V 1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibody Abcam  ab22595 1:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal Antibody BioLegend 312102 1:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] – cis-Golgi Marker Abcam ab52649 1:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076V 1:1000 Dilution
Automatic Fraction Collector Izon Science
BCA assay Kit Bio-Rad
CCD camera Gatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti Human BD 556019 1:1000 Dilution
CD81 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-23962 1:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture Flasks Greiner Bio-One 660175
ChemiDoc MP Imager BioRad
Clarity Western ECL Substrate BioRad 1705061
deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
dithiothreitol Sigma 3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodium Cytiva SH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium grade VWR 97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depleted Thermo Scientific A2720801
Glycine BioRad 1610718
Great Value Nonfat Dry Milk Amazon B076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell Line Sigma-Aldrich SCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pk Izon Science
Methanol >99.8% ACS VWR BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass plates BioRad 1653310 with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short plates BioRad 1653308
NP-40 Sigma-Aldrich 492016
Penicillin-Streptomycin,Solution Sigma-Aldrich P4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBS Fisher Scientific BP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and Reagents Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce PVDF Transfer Membranes Thermo Scientific 88518
Pierce Western Blotting Filter Paper Thermo Scientific 84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mL Bio Basic TB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Cell Signaling Technology 5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)] ABCam ab125011 1:1000 dilution
Slodium hydroxide Sigma-Aldrich SX0603
Sodium azide Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pellets Sigma-Aldrich 75746-1KG
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10% BioRad 1610183
Transmission Electron Microscope FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris BioRad 1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesium Cytiva SH30042.01
Tunicamycin Tocris 3516
Zeta View software Analytik NTA software

References

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14 (2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O’Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651 (2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211 (2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773 (2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles’ characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042 (2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145 (2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239 (2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061 (2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450 (2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276 (2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479 (2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Play Video

Cite This Article
Jones, M. T., Manioci, S. W., Russell, A. E. Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media. J. Vis. Exp. (183), e63614, doi:10.3791/63614 (2022).

View Video