Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Valutazione della probabilità aperta del poro di transizione della permeabilità mitocondriale nel setting dell'eccesso di coenzima Q

Published: June 1, 2022 doi: 10.3791/63646
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Questo metodo sfrutta il contributo del poro di transizione della permeabilità mitocondriale alla perdita di protoni a bassa conduttanza per determinare la soglia di tensione per l'apertura dei pori nei topi neonatali con sindrome dell'X fragile con aumento del contenuto di coenzima Q mitocondriale dei cardiomiociti rispetto al controllo wildtype.

Abstract

Il poro di transizione della permeabilità mitocondriale (mPTP) è un mega-canale della membrana mitocondriale interna (IMM) voltaggio-dipendente, non selettivo, importante per la salute e la malattia. L'mPTP media la fuoriuscita di protoni attraverso l'IMM durante l'apertura a bassa conduttanza ed è specificamente inibito dalla ciclosporina A (CsA). Il coenzima Q (CoQ) è un regolatore dell'mPTP e sono state trovate differenze tessuto-specifiche nel contenuto di CoQ e nella probabilità aperta di mPTP nei mitocondri del proencefalo e del cuore in un modello murino neonato di sindrome dell'X fragile (FXS, Fmr1 knockout). Abbiamo sviluppato una tecnica per determinare la soglia di tensione per l'apertura di mPTP in questo ceppo mutante, sfruttando il ruolo dell'mPTP come canale di perdita di protoni.

Per fare ciò, il consumo di ossigeno e il potenziale di membrana (ΔΨ) sono stati misurati simultaneamente in mitocondri isolati utilizzando la polarografia e un elettrodo iono-selettivo tetrafenilfosfonio (TPP+) durante la respirazione delle perdite. La soglia per l'apertura di mPTP è stata determinata dall'insorgenza dell'inibizione mediata da CsA della perdita di protoni a specifici potenziali di membrana. Utilizzando questo approccio, le differenze di tensione di gating dell'mPTP sono state definite con precisione nel contesto dell'eccesso di CoQ. Questa nuova tecnica consentirà future indagini per migliorare la comprensione della regolazione fisiologica e patologica dell'apertura a bassa conduttanza del mPTP.

Introduction

L'mPTP media la transizione di permeabilità (PT), per cui l'IMM diventa bruscamente permeabile a piccole molecole e soluti 1,2. Questo fenomeno eclatante è un distinto allontanamento dall'impermeabilità caratteristica dell'IMM, che è fondamentale per stabilire il gradiente elettrochimico necessario per la fosforilazione ossidativa3. Il PT, a differenza di altri meccanismi di trasporto mitocondriale, è un processo ad alta conduttanza, non specifico e non selettivo, che consente il passaggio di una gamma di molecole fino a 1,5 kDa 4,5. L'mPTP è un canale voltaggio-dipendente all'interno dell'IMM la cui apertura altera ΔΨ, la produzione di ATP, l'omeostasi del calcio, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la vitalità cellulare4.

All'estremo patologico, l'apertura ad alta conduttanza incontrollata e prolungata di mPTP porta al collasso del gradiente elettrochimico, al gonfiore della matrice, all'esaurimento dei nucleotidi piridinici della matrice, alla rottura della membrana esterna, al rilascio di proteine intermembrana (incluso il citocromo c) e, infine, alla morte cellulare 4,6. Tale apertura patologica di mPTP è stata implicata in lesioni da ischemia-riperfusione cardiaca, insufficienza cardiaca, lesioni cerebrali traumatiche, varie malattie neurodegenerative e diabete 1,7. Tuttavia, l'apertura mPTP a bassa conduttanza è di natura fisiologica e, a differenza dell'apertura ad alta conduttanza, non porta a una profonda depolarizzazione o gonfiore mitocondriale4.

L'apertura a bassa conduttanza del poro limita la permeabilità a ~ 300 Da, consente il passaggio di protoni indipendenti dalla sintesi di ATP ed è una potenziale fonte di perdita fisiologica di protoni5. L'apertura fisiologica di mPTP provoca un declino controllato di ΔΨ, aumenta il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto respiratoria e provoca un breve scoppio o lampo di superossido, contribuendo alla segnalazione ROS8. La regolazione di tale apertura transitoria di mPTP è importante per l'omeostasi del calcio e il normale sviluppo e maturazione cellulare 4,9,10,11. L'apertura transitoria dei pori nei neuroni in via di sviluppo, ad esempio, innesca la differenziazione, mentre la chiusura del mPTP induce la maturazione nei cardiomiociti immaturi 4,5.

Sebbene il significato funzionale dell'mPTP in salute e malattia sia ben stabilito, la sua precisa identità molecolare rimane dibattuta. I progressi sulla struttura molecolare e la funzione dell'mPTP sono stati esaminati in modo completo altrove12. In breve, attualmente, gli stati di alta e bassa conduttanza del mPTP sono stati ipotizzati per essere mediati da entità distinte12. I principali candidati sono la F1/F0 ATP sintasi (ATP sintasi) e il trasportatore nucleotidico adeninico (ANT) per modalità ad alta e bassa conduttanza, rispettivamente12.

Nonostante la mancanza di consenso sull'esatta identità della componente di formazione dei pori dell'mPTP, alcune caratteristiche chiave sono state dettagliate. Una caratteristica ben consolidata dell'mPTP è che è regolato dal gradiente elettrochimico tale che la depolarizzazione dell'IMM porta all'apertura dei pori13. Lavori precedenti hanno dimostrato che lo stato redox dei gruppi tiolici vicinili altera la tensione di gating del mPTP, in modo tale che l'ossidazione apre il poro a ΔΨs relativamente più alti, e la riduzione del gruppo tiolico si traduce in probabilità mPTP chiusa14. Tuttavia, l'identità del sensore di tensione proteica è sconosciuta.

Sono state identificate varie piccole molecole che modulano la probabilità aperta del poro. Ad esempio, l'mPTP può essere stimolato ad aprirsi con calcio, fosfato inorganico, acidi grassi e ROS e può essere inibito da nucleotidi adeninici (in particolare ADP), magnesio, protoni e CsA 5,12. I meccanismi d'azione di alcuni di questi regolatori sono stati chiariti. Il calcio mitocondriale innesca l'apertura di mPTP almeno in parte legandosi alla subunità β dell'ATP sintasi15. ROS può attivare l'mPTP diminuendo la sua affinità per aDP e migliorando la sua affinità per la ciclofilina D (CypD), l'attivatore mPTP proteico più studiato16. Il meccanismo di attivazione dell'mPTP da parte del fosfato inorganico e degli acidi grassi è meno chiaro. Per quanto riguarda gli inibitori endogeni, si ritiene che l'ADP inibisca l'mPTP legandosi all'ANT o all'ATP sintasi, mentre il magnesio esercita il suo effetto inibitorio spostando il calcio dal suo sito di legame 15,17,18,19.

Il basso pH inibisce l'apertura di mPTP protonando l'istidina 112 della subunità della proteina regolatrice che conferisce la sensibilità all'oligomicina (OSCP) dell'ATP sintasi 12,20,21. Il prototipo di inibitore farmacologico del mPTP, CsA, agisce legando CypD e impedendo la sua associazione con OSCP 22,23. Lavori precedenti hanno anche dimostrato che una varietà di analoghi Del CoQ interagiscono con l'mPTP, inibendolo o attivandolo24. In lavori recenti, abbiamo trovato prove di un mPTP patologicamente aperto, eccessiva perdita di protoni e fosforilazione ossidativa inefficiente a causa di una carenza di CoQ nei mitocondri del proencefalo dei cuccioli di topo FXS appena nati25.

La chiusura del poro con CoQ esogena ha bloccato la perdita patologica di protoni e indotto la maturità morfologica delle spine dendritiche25. È interessante notare che, negli stessi animali, i cardiomiociti FXS avevano livelli eccessivi di CoQ e probabilità di mPTP chiusa rispetto ai controlli wildtype26. Sebbene la causa di queste differenze tessuto-specifiche nei livelli di CoQ sia sconosciuta, i risultati sottolineano il concetto che il CoQ endogeno è probabilmente un regolatore chiave del mPTP. Tuttavia, c'è una grande lacuna nelle nostre conoscenze perché il meccanismo di inibizione mediata dal CoQ dell'mPTP rimane sconosciuto.

La regolazione dell'mPTP è un determinante critico della segnalazione cellulare e della sopravvivenza4. Pertanto, rilevare l'apertura di mPTP all'interno dei mitocondri è fondamentale quando si considerano specifici meccanismi fisiopatologici. Tipicamente, la soglia per l'apertura dei pori ad alta conduttanza viene determinata utilizzando il calcio per innescare la transizione di permeabilità. Tale carico di calcio porta al collasso del potenziale di membrana, al rapido disaccoppiamento della fosforilazione ossidativa e al gonfiore mitocondriale27,28. Abbiamo cercato di sviluppare un metodo per rilevare l'apertura mPTP a bassa conduttanza in situ, senza indurlo di per sé.

L'approccio sfrutta il ruolo dell'mPTP come canale di perdita di protoni. Per fare ciò, sono stati impiegati elettrodi iono-selettivi di tipo Clark e TPP+ per misurare simultaneamente il consumo di ossigeno e il potenziale di membrana, rispettivamente, nei mitocondri isolati durante la respirazione delle perdite29. La soglia per l'apertura di mPTP è stata determinata dall'insorgenza dell'inibizione mediata da CsA della perdita di protoni a specifici potenziali di membrana. Utilizzando questo approccio, le differenze di tensione di gating dell'mPTP nel contesto dell'eccesso di CoQ sono state definite con precisione.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

L'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Columbia University Medical Center è stata ottenuta per tutti i metodi descritti. FXS (Fmr1 KO) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J) e controllo (FVB) (FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ) mouse utilizzati come sistemi modello per questo studio sono stati acquisiti commercialmente (vedere la Tabella dei materiali). Da cinque a undici animali sono stati utilizzati in ogni gruppo sperimentale. I topi del giorno 10 postnatale (P10) sono stati usati per modellare un punto temporale nell'infanzia umana.

1. Isolamento mitocondriale dal cuore di topo

  1. Preparare tamponi per l'isolamento mitocondriale e gli esperimenti di respirazione come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4 °C se fatto in anticipo.
    1. Preparare il mezzo con gradiente di densità del 15%: diluire il gradiente di densità commerciale medio all'80% di volume/volume (v/v) con diluente di gradiente di densità. Diluire ulteriormente il gradiente di densità dell'80% medio 15% v/v aggiungendo tampone di isolamento mitocondriale (MI)/albumina sierica bovina (BSA).
  2. Isolare i mitocondri da tessuti freschi e non congelati per questi esperimenti e utilizzarli il giorno della preparazione, in genere entro cinque ore26. Eseguire tutte le fasi di isolamento sul ghiaccio.
    1. Decapitare il topo ed asportare il cuore. Lavare immediatamente 1-2 volte in una capsula di Petri con MI/BSA ghiacciato. Tagliare l'atrio e tritare il tessuto.
    2. Trasferire il tessuto cardiaco tritato in un omogeneizzatore vetro-vetro contenente 1 mL di MI/BSA. Omogeneizzare con un pestello più sciolto (A) (10 colpi), quindi un pestello più stretto (B) (10 colpi).
    3. Centrifugare l'omogeneizzato a 1.100 × g per 2 min a 4 °C per rimuovere i detriti nucleari e cellulari.
    4. Prendere delicatamente il surnatante senza toccare alcun pellet soffice e sovrapporlo con cura sopra 700 μL di mezzo gradiente di densità del 15% in un tubo di centrifuga. Centrifugare a 18.500 × g per 15 min a 4 °C.
    5. Risospesare il pellet in 1 mL di tampone di saccarosio (SB)/BSA e centrifugare a 10.000 × g per 10 min a 4 °C.
    6. Rimuovere completamente e scartare il surnatante. Risospesso il pellet in SB/BSA ad un volume finale di 55 μL.
    7. Quantificare il contenuto proteico mitocondriale utilizzando un test standard come il test proteico dell'acido bicinchoninico (BCA).

2. Consumo di ossigeno mitocondriale (O2) e ΔΨ

  1. Assemblaggio e calibrazione di elettrodi di ossigeno
    1. Impostare e calibrare l'elettrodo di ossigeno (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
      1. Posizionare una goccia di soluzione di elettrolita di cloruro di potassio al 50% (KCl) sopra la cupola del disco dell'elettrodo.
      2. Posizionare un piccolo pezzo ~ 2 cm2 distanziatore di carta per sigarette coperto con un pezzo leggermente più grande della membrana di politetrafluoroetilene (PTFE) fornita sopra la goccia di elettrolita.
      3. Utilizzando lo strumento applicatore fornito, spingere il piccolo disco dell'elettrodo O-ring sopra la cupola dell'elettrodo.
        NOTA: Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria e che la membrana sia liscia.
    2. Riempire bene il serbatoio con la soluzione elettrolitica.
    3. Posizionare bene l'O-ring più grande nella rientranza attorno al disco dell'elettrodo.
    4. Installare il disco nella camera degli elettrodi e collegarlo all'unità di controllo.
    5. Aggiungere 2 mL di acqua deionizzata satura d'aria alla camera di reazione e il magnete rivestito in PTFE alla camera.
    6. Collegare la camera alla parte posteriore dell'unità di controllo.
    7. Impostare la temperatura a 37 °C e la velocità di agitazione a 100.
    8. Attendere 10 minuti affinché la temperatura del sistema si equilibri prima di iniziare la calibrazione.
    9. Nella scheda Calibrazione selezionare Calibrazione fase liquida per eseguire la calibrazione in fase liquida. Confermare che la temperatura è impostata su 37 °C, la velocità di agitazione è 100 e la pressione è impostata sulla pressione atmosferica (101,32 kPa).
    10. Premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi.
    11. Quando viene raggiunto un plateau, premere OK.
    12. Stabilire zero O2 nella camera aggiungendo una piccola quantità (~ 20 mg) di ditionite di sodio.
    13. Premere OK e attendere che il segnale si stabilizzi.
    14. Quando viene raggiunto un plateau, premere Salva per accettare la calibrazione.
  2. Assemblaggio elettrodo selettivo TPP+
    1. Riempire la punta dell'elettrodo selettivo TPP+ con una soluzione TPP da 10 mM utilizzando la siringa e l'ago flessibile forniti, avendo cura di evitare bolle d'aria.
    2. Assemblare l'apparecchiatura per elettrodi selettivi TPP+, compresi l'elettrodo di riferimento e il supporto per elettrodi, (vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    3. In breve, allentare il cappuccio del supporto dell'elettrodo e inserire l'elettrodo di riferimento interno nella punta TPP+. Stringere il cappuccio per fissare la punta. Collegare il cavo in dotazione al supporto dell'elettrodo e alla porta ausiliaria della scatola di controllo.
    4. Inserire l'elettrodo TPP+ selettivo e gli elettrodi di riferimento nel gruppo stantuffo adattato per elettrodi iono-selettivi. Collegare l'elettrodo di riferimento alla porta di riferimento della scatola di controllo.
    5. Inserire gli elettrodi TPP+ selettivi e di riferimento nel gruppo stantuffo adattato per elettrodi iono-selettivi.
  3. Preparazione della camera di reazione
    1. Aggiungere la miscela di reazione alla camera di reazione: 10 mM di succinato (substrato del complesso II), 5 μM di rotenone (inibitore del complesso I), 80 ng mL−1 nigericina (per far collassare il gradiente di pH attraverso IMM), 2,5 μg di oligomicina mL-1 (per indurre la respirazione allo stato 4) e tampone di reazione respiratorio (RB)/BSA a un volume finale di 1 mL. Fare attenzione ad evitare di introdurre bolle d'aria nella camera.
    2. Chiudere la camera con il gruppo stantuffo adattato con il TPP+-selettivo e l'elettrodo di riferimento in posizione. Seleziona VAI per avviare la registrazione. Una volta chiusa la camera, introdurre reagenti aggiuntivi direttamente nella soluzione di reazione utilizzando microsiringhe separate modificate con tubi di plastica per regolare la lunghezza dell'ago.
  4. Calibrazione TPP+
    1. Una volta ottenuto un segnale di tensione stabile, calibrare l'elettrodo TPP+ selettivo aggiungendo incrementi di 1 μM di una soluzione TPP da 0,1 mM a una concentrazione finale di 3 μM. Osservare che c'è un declino logaritmico nel segnale di tensione TPP + con ogni aggiunta.
      NOTA: calibrare l'elettrodo TPP+-selettivo all'inizio di ogni esperimento.
  5. Acquisizione dati
    1. Lasciare stabilizzare le tracce di O2 e TPP+ e aggiungere 100 μg di mitocondri cardiomiocitari appena preparati alla camera di reazione fino a una concentrazione finale di 0,1 mg mL-1 tramite la porta di aggiunta del reagente nel gruppo stantuffo. Osservare la diminuzione dei livelli di O2 nella camera quando i mitocondri diventano energizzati e consumano O2 e il brusco aumento del segnale di tensione TPP + mentre i mitocondri generano un potenziale di membrana e assorbono TPP + dalla soluzione.
    2. Aggiungere 2,5 μg di oligomicina mL-1 per indurre la respirazione allo stato 4.
      NOTA: i tassi di consumo di O2 rappresenteranno ora il tasso di respirazione della perdita di protoni. L'oligomicina può essere aggiunta alla camera di reazione prima di TPP+ come alternativa.
  6. Valutare la probabilità aperta dell'mPTP
    1. Osservare che ΔΨ diminuisce nel tempo durante la respirazione delle perdite. Una volta raggiunto il ΔΨ desiderato, aggiungere 1 μM CsA (inibitore mPTP) alla camera di reazione per valutare la probabilità aperta dell'mPTP a quello specifico ΔΨ.
    2. Misurare l'effetto di CsA sul consumo di O2 e ΔΨ prima e dopo l'aggiunta di CsA
    3. Determinare la dipendenza dalla tensione dell'apertura mPTP variando il ΔΨ a cui viene aggiunto CsA in esperimenti successivi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vengono mostrati il consumo tipico di O2 e le curve ΔΨ generate in questi esperimenti (Figura 1A,B). Il declino logaritmico del segnale di tensione con calibrazione TPP+ viene mostrato all'inizio di ogni esperimento. L'assenza di questo pattern logaritmico può suggerire un problema con l'elettrodo selettivo TPP+. I mitocondri in genere generano ΔΨ immediatamente dopo l'aggiunta al tampone respiratorio. ΔΨ può essere interpretato dalle variazioni della tensione TPP+ basate sull'equazione di Nernst (rapporto logaritmico di [TPP+ all'interno della matrice mitocondriale] a [TPP+]esterno)30. Si noti che il fisiologico ΔΨ si avvicina al livello di 2 μM TPP+ della curva standard. Le soglie di tensione sono state così definite rispetto allo standard TPP+ da 2 μM (indicato come segnale di tensione Δ mV TPP+).

Ad esempio, "alto ΔΨ" è stato definito come ~Δ0 mV (al livello 2 μM TPP+), un "ΔΨ intermedio" è stato impostato a ~Δ5 mV (inferiore a 2 μM TPP+), e "basso ΔΨ" è stato impostato a ~Δ10 mV (inferiore a 2 μM TPP+) (Figura 1A,B). Negli esperimenti pilota, i mitocondri a Δ0 mV hanno mostrato una probabilità chiusa di mPTP al 100% e quelli a Δ10 mV hanno mostrato una probabilità aperta al 100%; i grafici rappresentativi sono mostrati nella Figura 1A,B. La soglia Δ5 mV è stata quindi scelta arbitrariamente come ΔΨ intermedio. Si noti che in questi esperimenti, dopo l'aggiunta di mitocondri alla camera di reazione, i mitocondri sono in stato 2 respirazione dove sono esposti al substrato in eccesso. I mitocondri non sono stimolati ad entrare nello stato 3 con ADP; di conseguenza, una volta aggiunta l'oligomicina, passano direttamente allo stato 4 oligomicina (respirazione a perdita). Di conseguenza, una differenza apprezzabile nel consumo di ossigeno non è tipicamente osservata dopo l'aggiunta di oligomicina, suggerendo che l'ATP sintasi contribuisce minimamente alla respirazione durante lo stato 2 (Figura 1A, B). Per valutare lo stato aperto o chiuso dell'mPTP, vengono confrontati il tasso di consumo di O2 e il potenziale di membrana appena prima e subito dopo l'aggiunta di CsA (Figura 1C). Una diminuzione del tasso di consumo di O2 e un aumento e stabilizzazione di ΔΨ in risposta a CsA indicano la chiusura di un mPTP aperto (blocco della perdita di protoni mediata dai pori) (Figura 1C, curve nere).

Quando l'mPTP è chiuso, non vi è alcuna diminuzione del tasso di consumo di O2 e ΔΨ non aumenta e si stabilizza ma continua a diminuire (Figura 1C, curve rosse). I risultati sperimentali dimostrano simili probabilità di mPTP chiuso e aperto ad alti e bassi ΔΨs, rispettivamente, nel controllo FVB e nei mitocondri cardiaci Fmr1 KO (Figura 1D). Questi risultati sono coerenti con le proprietà note sensibili alla tensione dell'mPTP, dove il poro tende ad essere chiuso ad alti ΔΨs e aperto a basso ΔΨs13. Pertanto, utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato in modo affidabile la normale dipendenza dalla tensione dell'mPTP in entrambi i ceppi. È interessante notare che, al ΔΨ intermedio (soglia Δ5 mV), i mitocondri cardiaci Fmr1 KO hanno dimostrato un aumento della probabilità di mPTP chiuso rispetto ai controlli FVB (Figura 1D). Pertanto, i mitocondri cardiaci fmr1 KO hanno dimostrato uno spostamento nel gating tale che il poro richiedeva un ΔΨ inferiore per l'attivazione dell'apertura. Ciò è coerente con la precedente scoperta che i KO Fmr1 hanno livelli elevati di CoQ e un mPTP26 relativamente chiuso. Pertanto, il metodo ha identificato una soglia ΔΨ ottimale per risolvere le differenze nell'apertura di mPTP. È importante sottolineare che la definizione di questa soglia ΔΨ consentirà ulteriori indagini per comprendere meglio come il CoQ regola l'mPTP e come la carenza di CoQ porta all'apertura patologica dei pori in FXS.

Figure 1
Figura 1: Rilevamento della probabilità aperta mPTP a bassa conduttanza. (A, B) Curve rappresentative del consumo simultaneo di O2 (rosso, i numeri sono tassi in nmol di O2 mL-1 min-1 mg proteina-1) con ΔΨ (nero, [TPP+]). Le frecce indicano l'aggiunta di TPP+, mitocondri, oligomicina e CsA. Vengono mostrate le soglie di alta, intermedia e bassa tensione rispetto al livello di calibrazione TPP+ da 2 μM. Viene mostrata l'aggiunta di CsA a soglie di tensione alta (A) e bassa (B). (C) Sezione ingrandita delle curve di consumo di O2 (superiore) e ΔΨ (inferiore) in (A) e (B) nel punto di aggiunta di CsA, che illustra mPTP chiuso (rosso) ad alto ΔΨ (insensibile a CsA) e mPTP aperto (nero) a basso ΔΨ (sensibile a CsA). (D) I grafici di riepilogo dello stato aperto e chiuso di mPTP a ΔΨ alti, bassi e intermedi sono mostrati per i controlli FVB (nero) e i KO Fmr1 (grigio). Da cinque a 11 animali sono stati valutati a ciascuna soglia ΔΨ; I valori p sono stati calcolati utilizzando un test chi-quadrato, *p < 0,05. Abbreviazioni: ΔΨ = potenziale di membrana mitocondriale; mPTP = poro di transizione della permeabilità mitocondriale; TPP+ = tetrafenilfosfonio; mito = mitocondri; oligo = oligomicina; CsA = ciclosporina A; ΔΨ = ; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente MI/BSA* SB/BSA* Diluente gradiente di densità RB/BSA*
Mannitolo 225 metri quadrati - - -
Saccarosio 75 metri quadrati 250 metri quadrati 1 M 200 metri quadrati
HEPES · 5 mM 5 mM 50 metri quadrati 5 mM
EGTA 1 mM 0,1 mM 10 mM -
Kcl - - - 25 metri quadrati
KH2PO4 - - - 2 mM
MgCl2 - - - 5 mM
pH** 7.4 7.4 - 7.2
BSA*** 0.10% 0.10% - 0.02%
AP5A*** - - - 30 mM

Tabella 1: Buffer e soluzioni.
* Filtrare attraverso filtri da 0,2 μm
**Regolare il pH con idrossido di potassio 3 M secondo necessità.
Indica i componenti tampone che vengono aggiunti appena prima dell'isolamento mitocondriale.
Abbreviazioni: MI = tampone di isolamento mitocondriale; SB = tampone di saccarosio; RB = Tampone respiratorio; BSA = albumina sierica bovina priva di acidi grassi; HEPES = acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico; EGTA = glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N′,N′-acido tetraacetico; KCl = cloruro di potassio; KH2PO4 = potassio diidrogeno fosfato; MgCl2 = cloruro di magnesio; AP5A = P1,P5-diadenosina-5' pentafosfato pentasodio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo documento descrive un metodo per valutare la probabilità aperta dell'mPTP. In particolare, la soglia di tensione per l'apertura mPTP a bassa conduttanza è stata determinata valutando l'effetto dell'inibizione del CsA sulla perdita di protoni su un intervallo di ΔΨs. Usando questa tecnica, abbiamo potuto identificare le differenze nel gating di tensione dell'mPTP tra i topi FXS e i controlli FVB coerenti con le loro differenze nel contenuto di CoQ specifico del tessuto. Fondamentale per il successo di questa metodologia è che i mitocondri sono appena isolati prima dell'uso e sono di buona qualità. I mitocondri danneggiati durante l'isolamento o troppo vecchi non saranno in grado di generare ΔΨ appropriati e in genere saranno disaccoppiati. Si noti che mentre il pH della matrice contribuisce tipicamente alla forza motrice del protone, la nigericina viene utilizzata per far collassare ΔpH attraverso l'IMM in questi esperimenti, come precedentemente descritto nei protocolli standard che valutano la perdita di protoni29. Pertanto, in questo caso, la forza motrice del protone è equivalente a ΔΨ, il che semplifica l'approccio sperimentale.

Un'altra considerazione importante è che alcuni degli inibitori utilizzati nella miscela respiratoria (come rotenone, oligomicina e CsA) sono difficili da risciacquare tra gli esperimenti perché aderiscono alle superfici plastiche della camera di reazione, compresi gli elettrodi iono-selettivi. La camera deve essere lavata di routine con etanolo e una sospensione di mitocondri congelati rozzamente preparati per "pulire" questi inibitori dalla camera e ridurre la probabilità di riporto di inibitori che può influire sulla riproducibilità degli esperimenti.

Poiché i mitocondri devono essere preparati al momento per mantenere la loro integrità, questo metodo non è suscettibile di analisi ad alto rendimento. Inoltre, sono necessarie quantità relativamente grandi di mitocondri per ogni esperimento. Tipicamente, per gli animali P10, abbastanza mitocondri possono essere isolati da un organo per condurre un singolo esperimento. Pertanto, testare condizioni diverse sullo stesso lotto di mitocondri di solito non è possibile. Se gli esperimenti vengono eseguiti con animali più anziani, questa limitazione è meno problematica, date le dimensioni relativamente maggiori di tessuti e organi.

Esistono numerosi metodi ben descritti per studiare la probabilità aperta dell'mPTP in mitocondri intatti isolati. Tecniche, come il rigonfiamento della matrice mitocondriale e i saggi di carico o capacità di ritenzione del calcio, innescano necessariamente PT ad alta conduttanza e quindi non consentono lo studio dell'apertura fisiologica a bassa conduttanza che è di interesse in questi esperimenti28. La tecnica patch-clamp fornisce un metodo potente e diretto per studiare la dipendenza dalla tensione degli stati ad alta o bassa conduttanza dell'mPTP31,32. Tuttavia, è una tecnica laboriosa, in cui solo un singolo mitocondrio e una singola condizione sperimentale possono essere studiati alla volta, il che rende gli studi comparativi più difficili32,33.

Inoltre, la membrana mitocondriale esterna è tipicamente lisata e la membrana mitocondriale interna è tipicamente rotta nei metodi patch-clamp utilizzati per i mitocondri isolati, il che può comportare la perdita di fattori regolatori mPTP che non sono intimamente associati all'IMM31. L'apertura a bassa conduttanza dell'mPTP è stata anche studiata utilizzando una varietà di tecniche di fluorescenza che impiegano tipicamente un estere tetrametilrodamina (per valutare i cambiamenti nel ΔΨ) da solo o in combinazione con calceina, la cui fluorescenza intramitocondriale è suscettibile alla tempra del cobalto quando l'mPTP è aperto 8,34. Tuttavia, negli approcci basati sulla fluorescenza, poiché i cambiamenti nel ΔΨ sono espressi come cambiamenti relativi nella fluorescenza, l'approccio in genere non consente una misurazione precisa di ΔΨ 8,34.

Questo metodo fornisce un nuovo approccio alternativo per valutare l'apertura a bassa conduttanza dell'mPTP rispetto a ΔΨ. Utilizzando questo approccio, i ricercatori possono studiare la regolazione del gating fisiologico e patologico della tensione mPTP. Questa tecnica promette anche di aiutare a comprendere il ruolo di sviluppo del mPTP nella maturazione degli organi in quanto può essere applicata a vari tessuti e diversi stadi di sviluppo. Questo approccio può essere facilmente applicato per studiare la tensione di gating dell'mPTP nel tessuto proencefalico del topo FXS, che in precedenza mostrava livelli di CoQridotti 25. Inoltre, proponiamo che questa tecnica possa essere utilizzata anche per studiare come altri agenti, endogeni o esogeni, impattano la tensione di gating dell'mPTP. Pertanto, si rivelerà uno strumento utile per espandere la comprensione del contributo del mPTP alla salute e alla malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dalle seguenti sovvenzioni: NIH / NIGMS T32GM008464 (K.K.G.), Columbia University Irving Medical Center Target of Opportunity Provost award al Dipartimento di Anestesiologia (K.K.G.), Society of Pediatric Anesthesia Young Investigator Research Award (K.K.G.) e NIH / NINDS R01NS112706 (R.J.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific 15630080
Adapted plunger assembly for pH or ion-selective electrodes for use with OXYT1 PP systems 941039
BD Intramedic PE Tubing, PE 50, 0.023 in. 10 ft. Fisher Scientific 14-170-11B to modify the length of the hamilton synringe as needed
Bovine Serum Albumin (BSA). Fatty acid free Sigma A7030-10G
Dri-Ref Reference Electrode, 2 mm World Precision Inst. LLC DRIREF-2
Electrode Holder for KWIK-Tips World Precision Inst. LLC KWIK-2  ion selective electrode holder
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid  (EGTA) Sigma 324626
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch Fmr1tm1Cgr/J Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FXS mice, Fmr1 KO 
FVB.129P2-Pde6b+ Tyrc-ch/AntJ Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME FVB mice
Hamilton 80366 Standard Syringes, 10 uL, Cemented-Needle, 6/pk Cole-Parmer EW-07938-30 microsyringe
Hamilton 80500 Standard Microliter Syringes, 50 uL, Cemented-Needle Cole-Parmer EW-07938-02 microsyringe
Hansatech Instruments Oxytherm+ System (Respiration) Complete PP systems OXYTHERM+R oxygen electrode and software
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma 1374248
Mannitol Sigma M9546-250G
P1,P5-diadenosine-5′ pentaphosphate pentasodium (AP5A) Sigma D4022-10MG
Percoll Sigma P1644 medium for density gradient separation
Potassium chloride (KCl) Sigma P3911
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma 5.43841
Sucrose Sigma S0389
TPP+ Electrode Tips (3) World Precision Inst. LLC TIPTPP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rasola, A., Bernardi, P. The mitochondrial permeability transition pore and its involvement in cell death and in disease pathogenesis. Apoptosis. 12 (5), 815-833 (2007).
  2. Szabó, I., Zoratti, M. The mitochondrial megachannel is the permeability transition pore. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 24, 111-117 (1992).
  3. Brand, M., Ferguson, S., Nunnari, J., Kühlbrandt, W. Molecular Biology of the Cell. Alberts, B., et al. 14, Garland Science. Chapter 14 767-830 (2002).
  4. Perez, M. J., Quintanilla, R. A. Development or disease: duality of the mitochondrial permeability transition pore. Developmental Biology. 426 (1), 1-7 (2017).
  5. Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metabolism. 21 (2), 206-214 (2015).
  6. Javadov, S., Kuznetsov, A. Mitochondrial permeability transition and cell death: the role of cyclophilin d. Frontiers in Physiology. 4, 76 (2013).
  7. Dorn, G. W. Mechanisms of non-apoptotic programmed cell death in diabetes and heart failure. Cell Cycle. 9 (17), 3442-3448 (2010).
  8. Boyman, L., et al. Dynamics of the mitochondrial permeability transition pore: Transient and permanent opening events. Archives of Biochemistry and Biophysics. 666, 31-39 (2019).
  9. Hom, J. R., et al. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte differentiation. Developmental Cell. 21 (3), 469-478 (2011).
  10. Hou, Y., et al. Mitochondrial superoxide production negatively regulates neural progenitor proliferation and cerebral cortical development. Stem Cells. 30 (11), 2535-2547 (2012).
  11. Elrod, J. W., et al. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca(2+) exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3680-3687 (2010).
  12. Bonora, M., Giorgi, C., Pinton, P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2021).
  13. Bernardi, P. Modulation of the mitochondrial cyclosporin A-sensitive permeability transition pore by the proton electrochemical gradient. Evidence that the pore can be opened by membrane depolarization. Journal of Biological Chemistry. 267 (13), 8834-8839 (1992).
  14. Petronilli, V., et al. The voltage sensor of the mitochondrial permeability transition pore is tuned by the oxidation-reduction state of vicinal thiols. Increase of the gating potential by oxidants and its reversal by reducing agents. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16638-16642 (1994).
  15. Giorgio, V., et al. Ca(2+) binding to F-ATP synthase beta subunit triggers the mitochondrial permeability transition. European Molecular Biology Organization Reports. 18 (7), 1065-1076 (2017).
  16. Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y., Connern, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and membrane potential modulate the mitochondrial permeability transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide translocase. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3346-3354 (1997).
  17. Szabo, I., Bernardi, P., Zoratti, M. Modulation of the mitochondrial megachannel by divalent cations and protons. Journal of Biological Chemistry. 267 (5), 2940-2946 (1992).
  18. Karch, J., et al. Inhibition of mitochondrial permeability transition by deletion of the ANT family and CypD. Science Advances. 5 (8), (2019).
  19. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  20. Antoniel, M., et al. The unique histidine in OSCP subunit of F-ATP synthase mediates inhibition of the permeability transition pore by acidic pH. European Molecular Biology Organization Reports. 19 (2), 257-268 (2018).
  21. Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Archives of Biochemistry and Biophysics. 195 (2), 460-467 (1979).
  22. Halestrap, A. P., Connern, C. P., Griffiths, E. J., Kerr, P. M. Cyclosporin A binding to mitochondrial cyclophilin inhibits the permeability transition pore and protects hearts from ischaemia/reperfusion injury. Molecular and Cellular Biochemistry. 174 (1-2), 167-172 (1997).
  23. Giorgio, V., Fogolari, F., Lippe, G., Bernardi, P. OSCP subunit of mitochondrial ATP synthase: role in regulation of enzyme function and of its transition to a pore. British Journal of Pharmacology. 176 (22), 4247-4257 (2019).
  24. Fontaine, E., Ichas, F., Bernardi, P. A ubiquinone-binding site regulates the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Biological Chemistry. 273 (40), 25734-25740 (1998).
  25. Griffiths, K. K., et al. Inefficient thermogenic mitochondrial respiration due to futile proton leak in a mouse model of fragile X syndrome. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 34 (6), 7404-7426 (2020).
  26. Barajas, M., et al. The newborn Fmr1 knockout mouse: a novel model of excess ubiquinone and closed mitochondrial permeability transition pore in the developing heart. Pediatric Research. 89 (3), 456-463 (2021).
  27. Parks, R. J., Murphy, E., Liu, J. C. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 11 187-196 (2018).
  28. Carraro, M., Bernardi, P. Measurement of membrane permeability and the mitochondrial permeability transition. Methods in Cell Biology. 155, 369-379 (2020).
  29. Affourtit, C., Wong, H., Brand, M. D. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 9 157-170 (2018).
  30. Teodoro, J. S., Palmeira, C. M., Rolo, A. P. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and ProtocolsMethods in Molecular Biology. Palmeira, C. M., Moreno, A. J. , The Humana Press. Chapter 6 109-119 (2018).
  31. Neginskaya, M. A., Pavlov, E. V., Sheu, S. S. Electrophysiological properties of the mitochondrial permeability transition pores: Channel diversity and disease implication. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1862 (3), 148357 (2021).
  32. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241 (2), 139-176 (1995).
  33. Yajuan, X., Xin, L., Zhiyuan, L. A comparison of the performance and application differences between manual and automated patch-clamp techniques. Current Chemical Genomics. 6, 87-92 (2012).
  34. Petronilli, V., et al. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophysical Journal. 76 (2), 725-734 (1999).

Tags

Biologia Numero 184
Valutazione della probabilità aperta del poro di transizione della permeabilità mitocondriale nel setting dell'eccesso di coenzima Q
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. … More

Griffiths, K. K., Wang, A., Levy, R. J. Assessment of Open Probability of the Mitochondrial Permeability Transition Pore in the Setting of Coenzyme Q Excess. J. Vis. Exp. (184), e63646, doi:10.3791/63646 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter