Summary
Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue.
Abstract
La motilità gastrointestinale (GI) è fondamentale per la normale digestione e assorbimento. Nell'intestino tenue, che assorbe i nutrienti, la motilità ottimizza la digestione e l'assorbimento. Per questo motivo, alcuni dei modelli di motilità nell'intestino tenue includono la segmentazione per la miscelazione dei contenuti luminali e la peristalsi per la loro propulsione. Le proprietà fisiche dei contenuti luminali modulano i modelli di motilità dell'intestino tenue. La stimolazione meccanica dei circuiti meccanosensoriali GI mediante il transito dei contenuti luminali e della motilità intestinale sottostante avvia e modula complessi schemi motori GI. Tuttavia, i meccanismi meccanosensoriali che guidano questo processo rimangono poco conosciuti. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di strumenti per sezionare come l'intestino tenue gestisce materiali di diverse proprietà fisiche. Per studiare come l'intestino tenue gestisce particelle di varie dimensioni, abbiamo modificato un metodo stabilito in vivo per determinare il transito dell'intestino tenue. Gavage topi vivi con liquido fluorescente o minuscole perline fluorescenti. Dopo 30 minuti, sezioniamo le viscere per visualizzare la distribuzione del contenuto fluorescente su tutto il tratto gastrointestinale. Oltre alle misurazioni ad alta risoluzione del centro geometrico, utilizziamo il binning di dimensioni variabili e l'analisi spettrale per determinare in che modo i diversi materiali influenzano il transito dell'intestino tenue. Abbiamo esplorato come un meccanismo di "tocco intestinale" recentemente scoperto influisce sulla motilità dell'intestino tenue usando questo approccio.
Introduction
Il tratto gastrointestinale umano (GI) è un sistema di organi lungo più piedi, approssimativamente approssimato come un tubo di varie dimensioni e proprietà fisiche1. Mentre il contenuto si muove attraverso la sua lunghezza, la funzione primaria del tratto gastrointestinale è quella di assorbire sostanze critiche per la vita. L'intestino tenue è specificamente responsabile dell'assorbimento dei nutrienti. Il transito dell'intestino tenue è strettamente regolato per abbinare le funzioni di digestione e assorbimento, con conseguente vari modelli di motilità. Bayliss e Starling descrissero la "legge dell'intestino"2 nel 1899, mostrando il programma di propulsione contrattile nell'intestino noto oggi come riflesso peristaltico; Il segmento prossimale al bolo alimentare si contrae per spingerlo in avanti e il segmento distale si rilassa per riceverlo. In teoria, questo modello da solo potrebbe essere sufficiente per trasportare materiale abortivamente, ma oltre un secolo di ricerca ha dipinto un quadro più complesso dell'attività contrattile nel tratto gastrointestinale. Nell'uomo sono riconosciuti tre periodi di motilità dell'intestino tenue: il complesso motorio migrante (MMC), il periodo di digiuno e il periodo postprandiale3. Gli stessi modelli sono stati riportati nei topi 4,5. La MMC è un modello motorio ciclico conservato nella maggior parte dei mammiferi 6,7. La MMC ha un caratteristico pattern a quattro fasi che funge da utile marcatore clinico nei disturbi gastrointestinali funzionali7. Le quattro fasi, in ordine di occorrenza, sono (I) quiescenza, (II) contrazioni irregolari a bassa ampiezza, (III) contrazioni regolari ad alta ampiezza e (IV) periodo di rampa dell'attività decrescente7. L'MMC segna il principale modello motorio del periodo di digiuno3. Le MMC del periodo di digiuno chiariscono il contenuto dell'intestino tenue in preparazione del pasto successivo.
I modelli motori del periodo postprandiale sono ottimizzati per le funzioni digestive e assorbenti3. Indipendentemente dalla composizione calorica, il transito iniziale è rapido lungo l'intestino tenue, il contenuto viene distribuito lungo la lunghezza dell'intestino e il transito successivamente rallenta8. L'assorbimento è ottimizzato aumentando la superficie di contatto e rallentandola per aumentare il tempo di permanenza. Una volta che i nutrienti sono all'interno del lume, il modello dominante consiste in contrazioni ravvicinate (<2 cm di distanza) non coordinate (contrazioni segmentanti), con alcune contrazioni sovrapposte di grande ampiezza che coprono l'intera lunghezza dell'intestino tenue (contrazioni peristaltiche)9. Le contrazioni segmentanti mescolano i contenuti intraluminali in posizione. Le occasionali grandi contrazioni peristaltiche spingono il contenuto verso il colon.
La tempistica di questa transizione verso MMC dipende dal volume del cibo e dalla composizione calorica10. Pertanto, l'intestino tenue campiona segnali luminali per regolare quando passare tra i periodi di motilità. I segnali meccanici, come le proprietà fisiche del contenuto luminale11, il volume luminale e la tensione della parete, impegnano le cellule meccanorecettrici nella parete GI 12,13,14,15,16. Infatti, aumentare la componente solida di un pasto porta ad un aumento del transito dell'intestino tenue17. Ipotizziamo che le proprietà fisiche, come lo stato liquido o solido dei contenuti intraluminali, debbano impegnare diversi meccanorecettori a causa delle varie forze che generano sulla parete GI18.
Il gold standard per misurare il transito GI in vivo nell'uomo, come nei topi, è l'uso di traccianti radioattivi misurati mediante scintigrafia mentre escono dallo stomaco o transitano lungo il colon19,20. Nei mammiferi, l'intestino tenue si muove in modi imprevedibili rendendo l'intestino tenue difficile da visualizzare in vivo in modo affidabile, ma si stanno facendo progressi21. Inoltre, attualmente mancano strumenti per quantificare come l'intestino tenue gestisce particolati di varie proprietà e dimensioni. Il punto di partenza qui è stata una tecnica gold standard che standardizza lo studio del transito dell'intestino tenue 22,23,24 e della funzione barriera 22. Consiste nel gavagare topi con un materiale fluorescente, in attesa della motilità gastrointestinale per trasportare il materiale, asportando il tratto gastrointestinale, segmentandolo in diverse sezioni dallo stomaco al colon, sezionando e omogeneizzando il contenuto intraluminale per la quantificazione della fluorescenza. Abbiamo apportato due miglioramenti. In primo luogo, abbiamo modificato la composizione del contenuto gavaged per includere perline microscopiche fluorescenti per determinare come l'intestino tenue distribuisce il particolato fisico. In secondo luogo, abbiamo migliorato la risoluzione spaziale visualizzando l'intero tratto gastrointestinale dallo stomaco al colon ex vivo e abbiamo utilizzato il binning di dimensioni variabili per standardizzare la nostra analisi tra gli animali. Ipotizziamo che questo riveli nuove intuizioni sull'equilibrio delle contrazioni propulsive rispetto a quelle segmentanti durante la fase postprandiale.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Mayo Clinic.
1. Configurazione
- Topi veloci da 8 a 10 settimane per 4 ore. Fornire ai topi l'accesso all'acqua.
NOTA: Utilizziamo topi C57BL / 6J maschi wild-type per tutti gli esperimenti presentati qui, ma possono essere eseguiti su topi di qualsiasi ceppo, sesso e genotipo. - Raffreddare 15 mL di acqua distillata in un tubo conico da 50 mL in frigorifero a 4 °C.
- Riscaldare altri 15 ml di acqua distillata in un becher utilizzando una piastra riscaldante con una barra di agitazione magnetica a circa 80-90 °C.
- Misura 0,5% metilcellulosa per un totale di 30 ml (0,15 g).
- Aggiungere delicatamente la metilcellulosa a 15 ml di acqua calda in modo che non si aggreghi. La soluzione di metilcellulosa sarà torbida durante questo processo.
- Una volta sciolto, rimuovere il becher dalla piastra riscaldante e aggiungere i 15 ml di acqua refrigerata al becher caldo.
- Mettere in frigorifero a 4 °C fino a quando la soluzione è limpida, circa 15-20 min.
- Quando limpido, pesare 3 mg di isotiocianato di rodamina (RITC)-destrano per 5 ml di soluzione di metilcellulosa allo 0,5% e mescolare per combinare. Questa è la condizione liquida nella sezione Risultati rappresentativi .
- In alternativa, pesare 25 mg di microsfere fluorescenti di polietilene e mescolare con 200 μL della soluzione di metilcellulosa fino a quando non è ben incorporato. L'incorporazione completa delle microsfere è assicurata dal vortice prima del gavage. Lo sperimentatore deve visualizzare una distribuzione omogenea delle microsfere sospese nella miscela.
- Poiché la soluzione RITC-destrano è sensibile alla luce, refrigerare la soluzione. Preparare in anticipo la soluzione RITC-destrano e la miscela di microshpere e utilizzare entro 2 mesi. Risospendere la miscela di microsfere prima dell'uso.
NOTA: Microsfere di varie dimensioni vengono utilizzate per studiare la manipolazione gastrointestinale di materiali diversi. Nella sezione Risultati rappresentativi , dimostriamo i risultati dell'utilizzo di microsfere piccole (diametro: 75-90 μm) e più grandi (diametro: 180-212 μm).
2. Gavage del contenuto intraluminale
- Preparare la sonda gastrica collegando un tubo di alimentazione da 18 Ga x 50 mm a una siringa da 1 mL e aspirando 200 μL di soluzione RITC o soluzione di microsfere.
- Trattenere manualmente l'animale a digiuno usando la tecnica di ritenuta con una sola mano25. Fare riferimento alle informazioni dell'istituzione sulle corrette tecniche di contenzione murina.
- Inserire delicatamente il tubo di alimentazione attraverso la bocca e l'esofago del topo fino a quando non entra nello stomaco.
NOTA: il passaggio gavage è fondamentale per un esperimento di successo. Richiede mani esperte in grado di inserire costantemente il tubo all'incirca alla stessa distanza in ciascun mouse. Questo passaggio deve essere standardizzato dagli sperimentatori che eseguono il protocollo. Lo stesso sperimentatore dovrebbe sondare tutte le coorti di topi che saranno confrontate tra loro. - Espellere lentamente il contenuto della siringa nello stomaco e rimuovere con attenzione il tubo dal mouse.
- Dopo il gavage, riportare il topo nella gabbia.
- Smaltire il tubo di gavage.
- Ripetere il processo secondo necessità per il numero desiderato di animali.
3. Dissezione intestinale
- Prima di iniziare le dissecazioni, accendere lo strumento di imaging in vivo per consentirgli di raggiungere la temperatura.
- Sacrificare il mouse 30 minuti dopo il gavage. Utilizzare l'inalazione di anidride carbonica per sacrificare il topo, seguita da dislocazione cervicale per garantire il successo dell'eutanasia.
- Dopo aver confermato il successo dell'eutanasia, posiziona il topo in posizione supina su uno stadio di dissezione e appunta le sue quattro appendici sul palco per avere accesso all'addome. Bagnare la superficie dell'addome con etanolo al 70% per bagnare i peli addominali.
- Utilizzare una pinza da micro-dissezione # 5 per tirare la pelle e acquisire forbici chirurgiche affilate per fare un'incisione trasversale 1 cm sopra l'ano. Per esporre la cavità intraperitoneale, continuare l'incisione verticalmente sull'addome fino alla gabbia toracica.
- Spostare delicatamente il cieco a sinistra con la pinza da micro-dissezione per esporre il colon distale.
- Tagliare il colon distale con le forbici da microdissezione appena prossimali al retto.
- Sbrogliare delicatamente il colon, il cieco e l'intestino tenue tirando lentamente nella direzione opposta.
NOTA: Mantenere le viscere sezionate in un segmento continuo creerà la massima facilità per lo sperimentatore. Strappe e strappi lungo il segmento renderanno più difficili i passaggi successivi. - Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare prossimalmente allo stomaco.
- Utilizzare una pinza per trasferire le viscere sezionate sul foglio di misurazione (Figura 1). Posizionare lo stomaco a 0 mm e disporre le viscere lungo il righello fino a 200 mm. Utilizzare forbici da microdissezione per tagliare a 200 mm. Ripeti questo processo di allineamento delle viscere da 0 mm a 200 mm lungo i righelli rimanendo sicuro che l'orientamento delle viscere non si confonda.
- Fai attenzione a evitare di allungare le viscere mentre ti allinei ai righelli.
- Una volta che il tessuto è disposto sul righello, disporre il cieco in modo che sia parallelo al tessuto ma non in contatto diretto con esso (se si trova una fluorescenza all'interno di quella regione, allora sarà necessaria una chiara distinzione di differenza tra il cieco e l'intestino).
- Posizionare il foglio di misurazione con il tessuto sezionato in un'area scura in modo che la fluorescenza possa essere conservata fino al momento dell'immagine.
4. Imaging ex vivo
- Aprire il software di imaging in vivo e accedere.
- Inizializzare lo strumento di imaging in modo che sia pronto per l'acquisizione delle immagini.
- Impostare i campi 'Eccitazione' ed 'Emissione' sul colore corrispondente utilizzato per il tallone o il gavage RTC. Rosso (liquido): eccitazione 535 nm / emissione 600 nm. Verde (microsfere): eccitazione 465 nm / emissione 520 nm.
- Imposta l'esposizione su "Auto".
- Selezionare il campo visivo.
- Prima di inserire il foglio di misurazione nello strumento, assicurarsi che l'intestino non si sia spostato durante il trasporto.
- Posizionare il foglio di misura nello strumento all'interno del campo visivo.
- Chiudere saldamente lo sportello dello strumento e selezionare Istantanea per fotografare il campo visivo.
- Salva le immagini raccolte su un'unità flash per l'analisi. Salva le singole acquisizioni delle immagini fluorescenti e fotografiche. Una sovrapposizione della fotografia e della fluorescenza indica la posizione del materiale fluorescente nel tratto gastrointestinale (Figura 1).
NOTA: si consiglia di salvare i file nel formato Tag Image File (.tif) per l'elaborazione a valle.
5. Analisi
- Aprire i file di immagine fluorescenti e fotografati in un software di modifica delle immagini.
- Regola la dimensione in pixel di entrambe le immagini in modo che abbiano esattamente le stesse dimensioni (la nostra convenzione era di impostare entrambe le immagini su 1280 pixel per 850 pixel [altezza x larghezza]).
- Chiudere il file della fotografia. I passaggi seguenti riguardano solo l'immagine fluorescente.
- Utilizzare uno strumento gomma per rimuovere lo sfondo e renderlo trasparente. Potrebbe essere necessaria una gomma per rimuovere le patch dello sfondo rimanente.
- Create un nuovo livello. Rendilo uno sfondo completamente nero per il segnale fluorescente. Ciò può essere ottenuto scegliendo un riempimento nero sul livello e trascinando il livello sotto il livello con l'immagine fluorescente.
- Salvate la nuova immagine fluorescente, contenente solo il segnale fluorescente su sfondo nero, come nuovo file .tif.
- Aprire le nuove immagini fluorescenti e fotografare in ImageJ.
- Trasforma ogni immagine in un'immagine a 32 bit scegliendo Immagine > Digitare > 32 bit.
- Create un'immagine unita di entrambi scegliendo Immagine > Colore > Unisci canali. Nella finestra di dialogo visualizzata, selezionate il file della fotografia per il canale grigio e il file fluorescente sotto i canali colorati.
- Disattivate la scala dell'immagine unita selezionando Analizza > Imposta scala > Fare clic per rimuovere scala.
- Selezionare lo strumento "Rettangolo" in ImageJ.
- Disegna un rettangolo attorno a una sezione dell'intestino tenue. Presta molta attenzione all'ampiezza di questa regione di interesse (ROI), poiché dovrebbe rimanere costante tra tutti i ROI. Il valore nominale non è essenziale, solo che è mantenuto coerente tra tutti i ROI disegnati su questa immagine [poiché l'intestino tenue occupa diverse righe, i singoli ROI verranno disegnati su ciascuna sezione dell'intestino tenue in una riga diversa (Figura 1)]. Nella Figura 2 viene illustrata la posizione del valore della larghezza nella barra degli strumenti di ImageJ.
- Duplica il ROI selezionando Immagine > Duplica. Selezionare solo il canale corrispondente al canale colorato.
- Usa di nuovo lo strumento rettangolo per disegnare un ROI su tutta la nuova immagine.
- Recuperare un profilo della fluorescenza selezionando Analizza > Profilo di tracciatura. Il grafico risultante traccia sull'asse y l'intensità media per ciascun pixel lungo la lunghezza del ROI. Questo è stato selezionato nel passaggio 5.12 per essere la lunghezza della sezione analizzata dell'intestino tenue
- Apri l'elenco dei valori e copiali in un software per fogli di calcolo.
- Ripetere i passaggi 5.12-5.16 per ogni sezione dell'intestino tenue su una riga di righello diversa. Continua a incollare i valori sullo stesso file di foglio di calcolo immediatamente sotto ogni set precedente di valori, in modo che tutte le righe continue in quella colonna contengano il valore di intensità media per l'intera lunghezza dell'intestino tenue.
- Nel software del foglio di calcolo, moltiplicare ogni valore di intensità media per la larghezza costante del rettangolo ROI creato nel passaggio 5.12. Questo produrrà il valore di intensità reale lungo l'intestino tenue in ogni punto.
NOTA: diversi animali avranno lievi variazioni sulla lunghezza dell'intestino tenue. Per evitare che le differenze di lunghezza influiscano sul risultato dell'analisi dei dati a valle, la stringa di valori di intensità deve essere collegata in un numero consistente di contenitori in tutti i campioni sperimentali (i risultati della Figura 3, della Figura 4 e della Figura 5 visualizzano i risultati per tre dimensioni dei contenitori). - Dividere il numero di valori di intensità per il numero di contenitori desiderati. Il quoziente S risultante determina il numero di valori di intensità inclusi in ciascun contenitore.
- Determinare il contenitore in cui andrà ogni valore di intensità non elaborato utilizzando una formula di arrotondamento. Questo passaggio inserisce ogni valore di intensità non elaborato in un contenitore. Ogni valore di intensità grezzo è indicizzato cronologicamente con il numero intero N. Il quoziente N/S determina il numero di bin assegnato a ciascun valore non elaborato. La formula di arrotondamento deve arrotondare questo quoziente a un numero intero senza decimali.
- Generare il valore per ogni raccoglitore utilizzando una formula averageif. L'obiettivo è fare la media dei valori grezzi assegnati a un contenitore specifico nel passaggio 5.20. Quindi, gli argomenti nella formula dovrebbero essere: (1) contenitori assegnati generati nel passaggio 5.20, (2) numero di bin, (3) valori di intensità grezzi.
NOTA: La prima analisi che possiamo eseguire sui dati binned è un'analisi geometrica del centro, che quantifica fino a che punto osserviamo la massima intensità fluorescente lungo l'intestino tenue (Figura 4). - Normalizzare ogni valore di intensità sull'intensità fluorescente totale. In altre parole, dividere ogni valore di intensità per la somma di tutte le intensità.
- Moltiplicare ogni valore normalizzato per il numero bin. Il prodotto riflette il peso relativo di ciascun contenitore, contribuendo all'intensità totale della fluorescenza.
- Sommando tutti i valori generati nel passaggio 5.23 si ottiene il numero bin al centro del segnale fluorescente. Dividere per il numero di contenitori per esprimere il centro geometrico come la frazione di intestino tenue percorsa dal centro fluorescente.
NOTA: Per riflettere la distribuzione spaziale del segnale, il passo successivo consiste nel generare lo spettro di potenza del set di dati sull'intensità binned (Figura 5). - Aprire una procedura guidata FFT (Fast Fourier Transform) nel software del foglio di calcolo. Selezionare l'input come set di dati associato e l'output come set vuoto dello stesso numero di righe dei raccoglitori.
- Estrarre il componente del valore reale della FFT.
- Aumentare ogni valore reale della FFT alla seconda potenza. Questo produce un set di dati di spettri di potenza.
- Selezionare la prima metà del set di dati degli spettri di potenza e spostarlo in modo che si trovi al di sotto della seconda metà. Questo ha l'effetto di centrare gli spettri di potenza attorno alla frequenza centrale quando viene tracciata nel passo successivo.
- Tracciare gli spettri di potenza sull'asse y di un grafico x-y dove i valori dell'asse x sono l'intervallo da -1 x (numero di bin/2) a (numero di bin/2) -1. Nel caso di 1000 contenitori, i valori degli assi sarebbero compresi tra -500 e 499.
- Gli spettri di potenza per ciascun animale dovrebbero essere confrontati sulla base della diffusione di picchi diversi da zero e delle altezze di questi picchi diversi da zero.
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Representative Results
Mostriamo risultati rappresentativi dalla fase 3 in poi. La figura 1 mostra le viscere espiantate intatte, con misurazioni fluorescenti sovrapposte. Lo stomaco (viola) è disposto lungo lo stesso asse dell'intestino tenue (arancione), ma preferiamo spostare il cieco (blu) di lato per evitare sovrapposizioni con l'intestino crasso (arancione). Come evidenziato nel pannello di sinistra, questo non è sempre possibile a causa delle dimensioni dell'organo. Tagliamo l'intestino tenue a ~ 200 mm per massimizzare la copertura di segmenti continui, ma questo non è sempre possibile a causa del mesentere che limita la capacità di dispiegare l'intestino e la nostra preferenza di non tagliare strutture come pellet fluorescenti o cieco. L'intensità rossa nel pannello sinistro della Figura 1 e le intensità verdi dei pannelli centrale e destro sono ordinate in contenitori di dimensioni diverse per generare la Figura 3. Solo le intensità all'interno dei ROI arancioni (intestino tenue) vengono estratte per l'analisi. L'intera lunghezza dell'intestino tenue (ogni ROI arancione in ciascun pannello) viene estratta per l'analisi. I ROI arancioni hanno la stessa larghezza, come mostrato in ImageJ (Figura 2). Sono cuciti insieme posizionando tutte le intensità in sequenza prima del binning. La figura 3 mostra la traccia fluorescente media ± SEM per coorte; Vedere la legenda della figura per le specifiche.
Le ultime due figure dimostrano i risultati delle analisi: centro geometrico e spettro di potenza. Il centro geometrico misura la posizione media dei segnali fluorescenti nella Figura 3, pesando la media per la potenza del segnale di ciascun contenitore. Quindi, picchi più alti nella traccia avvicinano la media alla posizione di quel picco. Il centro geometrico non riesce a caratterizzare completamente la distribuzione spaziale dei contenuti intraluminali. Ad esempio, lo stesso centro geometrico può essere ottenuto da un bolo concentrato in un singolo punto e un segnale diffuso centrato attorno allo stesso punto. Questa limitazione della misura del centro geometrico è evidente nel confronto tra liquidi e perline più grandi (Figura 3 e Figura 4). La maggior parte della traccia fluorescente liquida è centrata attorno a due picchi precoci, mentre le perle più grandi mostrano picchi multipli lungo l'intera lunghezza dell'intestino tenue (Figura 3, pannelli sinistro e destro). La traccia fluorescente delle perle più grandi è più distribuita, ma ha una media di un punto simile a quella del liquido, indipendentemente dalla granularità del binning, che evidenzia il limite di concentrarsi esclusivamente sul centro geometrico (Figura 4). Per tenere conto della natura distributiva delle contrazioni dell'intestino tenue, abbiamo incorporato un'analisi spettrale di potenza nel protocollo. L'analisi dello spettro di potenza funziona decostruendo la distribuzione della fluorescenza nello spazio in più curve sinusoidi di diverse frequenze spaziali. Ogni frequenza spaziale riflette la distanza tra due punti selezionati casualmente nella traccia di fluorescenza. Alcune di queste distanze si verificano più frequentemente di altre, quindi a ciascuna viene attribuita una forza (potere). La potenza è correlata alla frequenza con cui due punti casuali sono separati da quella distanza. Tracciando lo spettro di potenza (Figura 5), possiamo dimostrare quante frequenze spaziali contribuiscono al segnale misurato (diffusione dello spettro) e confrontare la forza relativa di tali contributi (altezza dello spettro). Questo ci permette di descrivere quantitativamente la diffusione della fluorescenza lungo il tratto gastrointestinale.
Figura 1. Le viscere sezionate vengono espiantate e poste su carta righello laminata prima della fotografia e della misurazione della fluorescenza. L'intensità della fluorescenza è sovrapposta e pseudocolorata per corrispondere alla fluorescenza nativa del materiale gavagato. A sinistra: isotiocianato di rodamina liquida (RITC) fluorescente nello spettro rosso; Al centro: piccole (diametro: 75-90 μm) e a destra: più grandi (diametro: 180-212 μm) perline entrambe fluorescenti nello spettro verde. Le caselle viola, arancioni, blu e rosa circondano le regioni di interesse (ROI) rispettivamente nello stomaco, nell'intestino tenue, nel cieco e nel colon in ciascun campione. L'ampiezza di ciascun ROI viene mantenuta coerente tra le righe per evitare confusione durante il calcolo dell'intensità di fluorescenza grezza durante l'analisi a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Posizione della larghezza dell'area di interesse (in pixel) nella barra degli strumenti ImageJ (sottolineatura gialla). Per ribadire, la larghezza viene visualizzata in pixel solo se la scala è stata rimossa (Passo 5.10). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Tracce di fluorescenza lungo la lunghezza dell'intestino tenue. La linea indica la fluorescenza media in un dato contenitore. L'area ombreggiata indica l'errore standard della media (SEM). La distribuzione del materiale fluorescente varia in base alle proprietà del materiale del contenuto intraluminale (colonne). A sinistra: distribuzione liquida (n = 7 topi) su alcuni segmenti dell'intestino tenue 30 minuti dopo la caga. Al centro e a destra: le perle piccole (n = 6 topi) e più grandi (n = 5 topi) si distribuiscono più ampiamente lungo l'intestino tenue 30 minuti dopo la carica. L'aumento del numero di contenitori utilizzati per ordinare gli stessi set di dati grezzi rivela funzionalità di traccia granulari irrisolvibili con un numero inferiore di contenitori (righe). I contenitori più piccoli riducono l'incertezza di misura, aumentano la risoluzione spaziale e riflettono meglio la componente distributiva delle contrazioni dell'intestino tenue. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Il centro geometrico della distribuzione della fluorescenza nell'intestino tenue 30 min dopo la sonda gastrica con RTC liquido, perline piccole (75-90 μm) e perle più grandi (180-212 μm) (media ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, ANOVA unidirezionale con correzione Bonferroni). La dimensione del contenitore non influisce sull'interpretazione del transito secondo cui le piccole perle vengono trasportate più distalmente dei liquidi 30 minuti dopo il gavage, ma le perle più grandi si distribuiscono così ampiamente che non ci sono differenze significative nel loro centro geometrico rispetto sia ai liquidi che alle piccole perle (*P < 0,05. ns = non statisticamente significativo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Gli spettri di potenza sono classificati in base alla proprietà del materiale (colonne) e alla dimensione del contenitore (righe). I miglioramenti nella risoluzione spaziale e nel binning più piccolo sono evidenti. Riga superiore: poche differenze possono essere distinte negli spettri ampiamente legati. Fila in basso: man mano che le dimensioni dei contenitori si riducono, possiamo apprezzare frequenze dominanti significative presenti nello spettro delle perle più grandi ma non in quello delle perle piccole. Alcune, ma non tutte, di queste frequenze dominanti aggiuntive, sono presenti nello spettro liquido. Utilizzando gli spettri della riga inferiore, possiamo confrontarli con le tracce fluorescenti nella Figura 3. Nella Figura 3, la traccia fluorescente liquida mostra due picchi prominenti, che sono correlati con alcuni picchi dominanti nello spettro di potenza. La traccia delle piccole perle nella Figura 3 mostra un singolo picco dominante, che è correlato a un singolo picco dominante nello spettro di potenza. La traccia delle perle più grandi nella Figura 3 mostra picchi più dominanti. Di conseguenza, lo spettro di potenza mostra un numero maggiore di frequenze dominanti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il tratto gastrointestinale, come altri organi tubulari, come i vasi sanguigni, richiede sensori meccanici ed effettori per mantenere l'omeostasi26,27,28. Tuttavia, il tratto gastrointestinale è unico in quanto le proprietà fisiche dei materiali che lo attraversano non sono costanti tra i pasti. Contenuti intraluminali di varie proprietà fisiche (solido, liquido e gas) transitano nell'intestino, generando diversi input meccanici ai meccanorecettori GI. Infatti, diversi stimoli meccanici nel colon sono rilevati e trasmessi da percorsi distinti29.
Questo protocollo è tecnicamente accessibile a chiunque esegua lavori di routine con il mouse, ma alcuni passaggi critici richiedono molta attenzione. Riteniamo che i topi a digiuno siano importanti prima di iniziare lo studio, poiché rimuove il contributo dei pasti precedenti diluendo il segnale fluorescente. Inoltre, i topi alimentati con una dieta standard mostrano fluorescenza intraluminale dai componenti della dieta, in particolare la componente clorofilliana30. Con il digiuno e la selezione dei fluorofori, impediamo alla fluorescenza di chow di interferire con le condizioni controllate degli esperimenti delineati in questo protocollo. Raccomandiamo agli sperimentatori di confermare in modo indipendente che il periodo di digiuno selezionato è sufficiente per eliminare la fluorescenza non specifica nell'intestino tenue, poiché questa può variare in base allo sforzo, all'età o al sesso. Lo sperimentatore dovrebbe valutare visivamente la distribuzione omogenea del contenuto gavagato. Altrimenti, ci sarà incertezza nella loro consegna e nei risultati dello studio. Gavages dovrebbe essere eseguito costantemente dallo stesso sperimentatore, preferibilmente qualcuno che ha sviluppato esperienza con la tecnica. Lo sperimentatore dovrebbe mirare alla consegna coerente del contenuto allo stomaco. Trovare fluorescenza nell'esofago o esclusivamente nello stomaco sono motivi per escludere un animale dall'analisi, in quanto non è certo se l'intestino tenue abbia avuto lo stesso accesso al contenuto gassato. Dopo il gavaging, i tempi di attesa possono essere ridotti a 15 minuti o estesi a 90 minuti, a seconda che le fasi di transito anticipate o tardive siano di interesse22. Il protocollo originale che utilizzava il gavage liquido ha dimostrato che la maggior parte del materiale risiede nell'intestino tenue dopo 30 minuti. Inoltre, mentre è fondamentale lavorare con fretta durante la fase di dissezione, è necessario prestare attenzione a non disturbare la posizione del contenuto intraluminale e non rompere il tratto gastrointestinale.
Questo protocollo si è evoluto da approcci precedentemente pubblicati che legavano fisicamente l'intestino tenue tagliandolo in cinque a 10 segmenti e omogeneizzando il contenuto intraluminale prima della misurazione di fluorescenza / radioattività22,23,24. L'approccio precedente era significativo perché standardizzava la misurazione del transito dell'intestino tenue. L'intestino tenue notoriamente si avvolge in schemi complicati e imprevedibili all'interno della cavità addominale. Gli studi di transito basati sull'imaging sono impegnativi indipendentemente dalla specie31,32. Mentre il nostro protocollo rimane un esperimento terminale che non può essere esteso agli esseri umani, miglioriamo significativamente la risoluzione spaziale e cogliamo quel miglioramento per risolvere i transiti regionali e tradurli in una misurazione imparziale della diffusione all'interno dell'intestino tenue (spettro di potenza).
In questo protocollo, la risoluzione spaziale è limitata dalla risoluzione della telecamera nel sistema di imaging. Poiché il binning normalizza la lunghezza dell'intestino tenue tra gli animali, possiamo confrontare direttamente la posizione media del contenuto intraluminale. La Figura 3 mostra chiaramente il drastico livellamento, l'aumento dell'incertezza e la diminuzione della risoluzione derivanti dal dimensionamento dei contenitori di grandi dimensioni. Il centro geometrico quantifica il centro di fluorescenza lungo il tratto gastrointestinale (Figura 4). Come previsto, questa misurazione non è influenzata in modo significativo dalla dimensione del contenitore. Lo spettro di potenza è un metodo imparziale e complementare che standardizza l'analisi dei picchi e delle diffusioni nelle tracce fluorescenti della Figura 3. Il miglioramento della risoluzione migliora gli spettri calcolati, rendendo possibile dimostrare differenze visibili tra le tracce fluorescenti (Figura 5). A bassa risoluzione (10 contenitori), sarebbe difficile distinguere tra liquidi e perle più grandi, sia dal centro geometrico che dalle valutazioni dello spettro, anche se è chiaro osservando le tracce fluorescenti che non sono distribuite in modo simile nello spazio. A una risoluzione più elevata (1000 contenitori), i centri geometrici sono ancora simili (a causa del fatto che il centro geometrico è una misura media), ma lo spettro di potenza può essere utilizzato in modo affidabile per differenziare tra entrambe le coorti. Vale la pena notare che le tracce fluorescenti sono suscettibili di altri tipi di analisi, come le misurazioni all'avanguardia. I cambiamenti previsti nel centro geometrico possono essere utilizzati durante i calcoli delle dimensioni del campione prima di intraprendere gli esperimenti. Sapendo che i liquidi hanno un centro geometrico di circa 0,4-0,518, abbiamo usato almeno cinque topi in ciascun gruppo per risolvere statisticamente i cambiamenti fino al 45%.
Abbiamo ampliato l'ambito e utilizzato questo protocollo per studiare il transito dei solidi all'interno dell'intestino tenue. Come con i liquidi, abbiamo gavagato le microsfere solide nello stomaco. Lo sfintere pilorico si trova nella transizione stomaco-intestino tenue. Questo sfintere funziona come un filtro di esclusione delle dimensioni. Nei topi, il cutoff delle dimensioni è a ~ 300 μm, con particelle < 300 μm che non incontrano resistenza nell'entrare nell'intestino tenue33, ma questo approccio funziona anche con particelle leggermente più grandi che abbiamo usato in un recente studio18. Abbiamo scelto le nostre dimensioni delle microsfere qui per fornire una gamma di dimensioni che completano il recente studio. Abbiamo utilizzato due preparati di sfere fluorescenti commerciali che hanno diametri di 75-90 μm e 180-212 μm. La Figura 1 mostra densità di fluorescenza e profili simili nello stomaco tra le coorti, suggerendo che né i liquidi né il particolato sono trattenuti in modo differenziale dallo stomaco. I dati originali presentati qui dimostrano come l'intestino tenue dei topi selvatici gestisca i liquidi e i solidi microscopici in modo diverso. Finora, abbiamo usato perline di una gamma di dimensioni per esperimento indipendente. Studi futuri possono concentrarsi su come vengono gestite miscele di particelle di diverse dimensioni e mescolare fluidi fluorescenti di varie proprietà fisiche con perle fluorescenti per determinare come le miscele di chimo più realistiche vengono gestite dall'intestino tenue.
Le differenze di distribuzione qui riportate suggeriscono una differenza nei modelli di motilità attivati da materiali di proprietà diverse. Ipotizziamo che l'equilibrio tra segmentazione e contrazioni propulsive determini quanto lontano e quanto omogeneamente i materiali transitano nell'intestino tenue. Il centro geometrico per le piccole perle è più lontano lungo l'intestino tenue rispetto ai liquidi, suggerendo che le piccole particelle solide impegnano contrazioni propulsive. D'altra parte, mentre il centro geometrico per le perle più grandi è simile a un liquido, l'analisi spettrale mostra differenze significative nella distribuzione spaziale, che potrebbero essere il risultato di contrazioni più segmentate nell'impostazione delle perline più grandi. Ipotizziamo che l'intestino tenue utilizzi la discriminazione delle dimensioni, un tipo di circuito meccanosensoriale, come uno degli input che alimentano la decisione sull'equilibrio tra i tipi di contrazione. Ad esempio, i neuroni di Dogiel di tipo II sono neuroni meccanosensoriali che si ipotizza svolgano un ruolo nel dirigere il passaggio dalle contrazioni propulsive a quelle segmentanti16,34. Queste intriganti speculazioni richiedono ulteriori ricerche per determinare i meccanismi con cui il tratto gastrointestinale percepisce le proprietà fisiche e le trasduce in output fisiologici come le contrazioni.
Riteniamo che questo protocollo sarà utile come strumento aggiuntivo per colmare il divario tra molecole e cellule e funzione d'organo. Abbiamo riconosciuto che i meccanorecettori epiteliali gastrointestinali condividono somiglianze evolutive e strutturali con i meccanorecettori cutanei35. Utilizzando il protocollo sopra delineato, abbiamo contribuito a dimostrare il ruolo sensoriale del "tocco intestinale" in cui questi meccanorecettori epiteliali gastrointestinali rilevano stimoli meccanici leggeri e partecipano alla sensibilità tattile intrinseca18. Prevediamo che questo protocollo si rivelerà altrettanto utile per studiare come altri circuiti sensoriali contribuiscono al transito dell'intestino tenue.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Ringraziamo la signora Lyndsay Busby per l'assistenza amministrativa e il signor Joel Pino per il supporto dei media. Le sovvenzioni NIH hanno sostenuto questo lavoro: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 e Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
References
- Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
