초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징
Summary
기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.
Abstract
기저막 (BM) – 상피 세포의 기저 측에 존재하는 세포 외 매트릭스의 특수 시트 – 상피 조직 형태학 및 장기 형태 형성의 확립 및 유지에 중요합니다. 또한, BM은 조직 모델링에 필수적이며, 신호 전달 플랫폼 역할을하며, 조직과 장기를 형성하기위한 외부 힘을 제공합니다. BM이 정상적인 발달 및 병리학적 조건 동안 수행하는 많은 중요한 역할에도 불구하고, BM 함유 소포의 세포내 밀매를 조절하는 생물학적 경로와 기저 분비가 BM 단백질의 양극화 된 침착으로 이어지는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 초파리 난소의 여포 상피는 BM의 모든 주요 성분을 생산하고 분비하기 때문에 BM 막 단백질의 기초 침착을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 공초점 및 초해상도 이미징은 고정 된 조직에서의 이미지 처리와 결합하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착에 특히 관여하는 세포 요인의 식별 및 특성화를 가능하게합니다. 이 기사는 초파리 난소의 여포 상피에서 내인성 태그가 지정된 단백질을 사용하여 BM 함유 소포 및 침착된 BM을 염색 및 이미징하기 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 질적 및 양적 질문을 모두 해결하기 위해 적용될 수 있으며 고처리량 스크리닝을 수용하기 위해 개발되어 상피 조직 개발 중에 편광 된 세포 내 밀매 및 소포 분비와 관련된 요인을 신속하고 효율적으로 식별 할 수 있습니다.
Introduction
기저막(BM)은 상피 구조 및 형태형성에 중요한 층상 세포-부착성 세포외 매트릭스(ECM)의 얇은 시트이다1. 그것은 ∼50 개의 단백질을 포함하며 상피 및 내피 세포의 기초가되는 유비쿼터스하게 발견되며, 골격, 평활 및 심장 근육 세포 및 지방 세포 1,2,3을 감싸고 있습니다. 상피 세포의 기저부에서 BM의 세 가지 주요 구성 요소는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌입니다. BM은 상피 세포의 기초가되며 조직 분리 및 장벽, 성장 및 지원, 세포 분극 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12를 포함한 많은 기능을 담당합니다. . 신호 전달 플랫폼으로서의 그의 역할은 발달 동안 상피 세포 및 조직의 형태학 및 분화를 조절한다 3,13,14. 더욱이, BM의 잘못된 조절 및/또는 그 완전성의 위반은 종양 전이 2,15,16을 포함한 많은 병리학적 상태의 주요 원인이다. 조직 및 기관 형태형성 동안 BM에 의해 수행되는 필수적인 기능에도 불구하고, 편광된 세포내 밀매 및 BM 단백질의 분비에 전념하는 생물학적 경로(들)의 성분들은 모호하게 알려져 있다.
BM 함유 소포의 세포 내 밀매와 상피 세포에 의한 BM 단백질의 분비를 연구하기 위해, 초파리 난소의 여포 상피 (FE)는 강력한 모델 시스템입니다 (그림 1). 초파리 난소는 난소라고 불리는 16-20 개의 긴 튜브 형 구조로 구성됩니다 (그림 1A, B) 17,18,19. 각 난소는 난자 조립 라인으로 생각할 수 있으며, 성숙한 난자가 난관을 통해 빠져 나올 때까지 앞쪽 끝에서 시작하여 후방으로 움직이는 계란 챔버 (각각 계란을 발생시킵니다)의 연령 진행과 함께 알 조립 라인으로 생각할 수 있습니다. 각 달걀 챔버는 중앙 생식 세포(GCs)를 둘러싸고 있는 체세포 모낭 세포(FCs)의 단층인 FE에 의해 캡슐화된다. FE는 정점 도메인이 생식계열을 향하는 뚜렷한 정점-기저 극성으로 고도로 편광되고, BM 단백질은 기저18,19로 분비된다. FC는 콜라겐 IV, 펄레칸 및 라미닌20,21을 포함한 BM의 모든 주요 성분을 적극적으로 분비합니다. FCs와 같은 상피 세포에서, BM 성분은 생산되고 그들의 세포외 침착을 위한 특수한 편광 분비 경로를 필요로 한다. 예를 들어, BM의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV(Coll IV)의 경우, 그의 편광된 세포내 밀매와 분비를 둘러싼 세부사항은 그것의 생산 및 침착이 많은 연구의 초점임에도 불구하고 모호하다. Coll IV는 소포체(ER)로 번역되며, 이는 또한 여기서 각각의 피브릴-세 개의 폴리펩티드(2개의 α1 쇄 및 하나의 α2 쇄)로 구성된-삼중 나선(22)으로 조립된다. 적절한 Coll IV 폴딩 및 기능에는 Plod 및 PH4αEFB 20,22,23,24,25,26과 같은 리실 및 프롤릴-히드록실라제를 포함하는 ER 샤페론 및 효소가 필요합니다. 이러한 번역 후 효소는 Coll IV의 ER 분류를 조절하는데, 각각의 손실로 인해 Coll IV가 기 저 ER20,23,24,25,26에 갇히게 됩니다. 이어서, 새로 합성된 Coll IV는 COPII 코팅된 소포체에서 골지에 대한 ER을 빠져나간다. 화물 수용체 Tango1은 큰 다량체 단백질20,27을 수용 할 수있는 상당한 골지 결합 소포로 콜라겐을 포장하는 데 도움을줍니다. 일단 Coll IV가 세포내 외래 소포로 포장되면, 그것은 상피 세포로부터 기저로 특이적으로 분비된다. BM 침착을 기저측으로 지시하기 위해, 상피 세포는 편광된 BM 분비에 특별히 전념하는 또 다른 인자 세트를 필요로 한다. 초파리 난소의 FE를 사용하여, 뉴클레오티드 교환 인자 (GEFs) Crag 및 Stratum, GTPases Rab8 및 Rab10뿐만 아니라 포스포이노시타이드 PI (4,5) P2, 및 Kinesin 1 및 3 모터 단백질 20,28,29,30,31의 수준을 포함하여이 새로운 세포 과정의 몇 가지 구성 요소가 특성화되었습니다. . 이러한 성분은 BM 단백질의 편광 분포를 보장하는 데 중요합니다.
FE 내의 BM 단백질의 세포내 국소화를 모니터링하기 위해, 내인성 태깅된 기저막 단백질(단백질 트랩), 예컨대 바이킹-GFP(Vkg-GFP 또는 α2 Coll IV-GFP) 및 펄레칸-GFP(Pcan-GFP)32,33이 사용될 수 있다. 이러한 단백질 트랩 라인은 BM 단백질의 내인성 분포를 정확하게 반영하고 수포 밀매28,30의 더 민감한 검출을 허용하는 것으로 나타났다. FE에서 BM의 편광 증착에 관여하는 성분들은 먼저 Vkg-GFP 및 Pcan-GFP 20,28,29,30에 대한 단백질 트랩 라인을 사용하여 특성화되었다. 단백질 트랩은 돌연변이체 및 Gal4 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 사용될 수 있다. 더욱이, 단백질 트랩은 형광 염료 및/또는 형광 면역염색과 함께 사용될 수 있어, 야생형 및 돌연변이 조건(35)을 비교할 때 BM 단백질의 국소화의 정밀한 특성화를 가능하게 한다.
BM 단백질 함유 소포의 분포 및 국재화를 정확하고 효율적으로 평가하기 위해, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 및 초분해능 이미징 기술은 다른 이미징 접근법에 상당한 이점을 제시한다. 이러한 접근 방식은 고해상도 이미징과 상대적으로 사용하기 쉬운 방법을 결합합니다. CLSM은 갈바노미터를 사용하여 래스터 스캔 방식으로 레이저로 시편을 스캔하여 광학 분해능을 향상시킬 수 있는 현미경 기술입니다. 핀홀 조리개는 공초점 현미경의 핵심 구성 요소입니다. 초점면의 위 또는 아래에서 오는 초점이 맞지 않는 신호를 차단함으로써, 핀홀 조리개는 z축(36)에서 매우 우수한 분해능을 가져온다. 이것은 또한 일련의 광학 섹션에 해당하는 z-스택이라고 불리는 z-평면에서 일련의 이미지를 얻을 수있게합니다. z-스택은 이후 이미징 소프트웨어의 도움으로 3D 재구성을 통해 시편의 3D 이미지를 생성합니다. 기존의 에피형광(와이드필드) 현미경은 공초점 현미경과 달리 초점이 맞지 않는 빛이 이미지 품질에 기여하여 이미지 해상도와 콘트라스트(36,37)를 감소시킵니다. 이것은 epifluorescence 현미경을 단백질 국소화 또는 공동 국소화를 연구 할 때 덜 매력적인 후보로 만듭니다.
CLSM은 BM 단백질의 세포 내 밀매의 이미징 및 특성화를 포함한 다양한 응용에 적합한 접근법이지만, 아베의 빛의 회절 한계 (200-250 nm) 이하의 샘플을 이미징 할 때 여전히 문제가 있습니다. 이러한 샘플을 이미징 할 때, 공초점 현미경 검사, 특히 오일 목표를 사용할 때 높은 해상도를 초래할 수 있습니다. 그러나 초분해능 기술은 공초점 현미경의 한계를 뛰어 넘습니다. 초분해능 현미경을 달성하기 위한 다양한 접근법이 있으며, 각 현미경에는 특정 분해능 한계가 있으며 각 현미경은 서로 다른 분석에 적합합니다. 이러한 접근법에는 광활성화 국소화 현미경 (PALM) 또는 확률 적 광학 재구성 현미경 (STORM), 자극 방출 고갈 현미경 (STED), 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 및 Airyscan (초해상도) 현미경 38,39,40,41,42,43,44,45,46이 포함됩니다. . Airyscan은 PALM / STORM, STED 및 SIM보다 거친 해상도를 가지고 있지만 최대 ~ 120nm (CLSM의 약 두 배)의 해상도를 달성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 초분해능 현미경 접근 방식은 낮은 신호 대 잡음비47,48로 두꺼운 샘플 및 샘플을 이미징할 때 SIM 및 기타 초분해능 기술에 비해 이점이 있는 것으로 나타났습니다.
Airyscan은 비교적 새로운 초분해능 공초점 현미경 기술(46)이다. 핀홀 및 단일 포인트 검출기를 사용하여 초점이 맞지 않는 광을 거부하는 기존의 CLSM과는 달리, 이 초분해능 접근법은 모든 스캔 위치(45)에서 모든 광을 수집하는 32채널 갈륨 비소 포스피드(GaAsP) 광승수 튜브 영역 검출기를 사용합니다. 32개의 검출기 각각은 작은 핀홀로 작동하여 핀홀 크기를 기존 1.0 Airy Unit(A.U.)에서 향상된 0.2A.U.로 줄여 1.25A.U. 직경45의 효율을 유지하면서 더 높은 분해능과 신호 대 잡음비를 실현합니다. 또한, Airyscan이 사용하는 선형 디컨볼루션은 해상도(45)에서 최대 2배 증가를 초래한다. 이를 고려하여 CLSM, 특히 초분해능 현미경은 BM 단백질의 기초 침착을 조절하는 BM 단백질 및 단백질을 연구하는 데 매우 적합하며, 이는 국소화 및 공국재화 연구를 위한 매우 고해상도 이미지를 생성할 수 있기 때문에 이러한 과정을 제어하는 공간적, 시간적, 분자적 사건에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.
국소화 실험을 수행하는 데 사용할 수 있는 공초점 현미경에 대한 대안적인 접근법은 이미지 디컨볼루션입니다. 광시야 현미경 검사는 초점이 맞지 않는 빛이 검출기에 도달할 수 있게 하기 때문에, 수학적 및 전산 디컨볼루션 알고리즘을 적용하여 광역 현미경에 의해 획득된 이미지로부터 초점이 맞지 않는 광을 제거하거나 재할당할 수 있고, 이로써 이미지(49)의 해상도 및 대비를 향상시킬 수 있다. Deconvolution 알고리즘은 또한 공초점 이미지에 적용되어 해상도와 콘트라스트를 더욱 증가시킬 수 있으며, 초해상도 현미경(50)의 최종 이미지와 거의 유사한 최종 이미지를 생성할 수 있다. Airyscan은 Weiner 필터 기반 디컨볼루션과 셰퍼드의 픽셀 재할당을 사용하여 공간 분해능과 신호 대 잡음비를 크게 향상시킵니다. 공초점 현미경과 비교하여, 이 초분해능 현미경 기술45,51을 사용할 때 세 가지 공간 차원(x 및 y에서 120nm, z에서 350nm) 모두에서 분해능이 2배 증가한 것이 관찰됩니다.
이 원고는 공초점 및 초분해능 현미경과 결합 된 모델 시스템으로 초파리 난소의 FE를 사용하여 BM 단백질의 세포 내 밀매 및 침착을 염색, 획득 및 시각화하기위한 상세하고 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질, 예를 들어, Vkg-GFP 및 Pcan-GFP를 발현하는 초파리 라인은 BM 단백질 밀매 및 분비를 가시화하는 효율적이고 정확한 도구이다. 또한, 이들은 돌연변이 및 Gal4/UAS 라인(34)을 포함하는 상이한 유전적 배경에서 용이하게 사용될 수 있다. 내인성으로 태그된 기저막 단백질이 권장되지만, 특정 BM 단백질에 대한 항체의 사용은 또한 기술된 프로토콜과 양립가능하다. 이러한 프로토콜은 공초점 및 초해상도 이미징을 사용하여 손상되지 않은 상피 조직에서 세포 내 밀매 및 BM 단백질 분비를 연구하는 데 관심이있는 과학자들에게 특히 유용합니다. 또한, 상피 조직 분석을 초파리 유전학의 광범위한 도구와 결합 할 수있는 능력은이 접근법을 특히 강력하게 만듭니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 수포 밀매 및 관심있는 다른 단백질의 분류를 연구하기 위해 쉽게 적응 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM은 배아 및 장기 형태 형성 및 성인 생리 기능에 중요합니다. 또한, BM은 상피 극성의 확립 및 유지를 위한 신호 전달 플랫폼 역할을 하며 조직에 지지체2를 제공한다. 그러나 BM 단백질의 적절한 배치를 조절하는 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. BM 단백질의 세포 내 밀매 및 양극화 된 분비에 전념하는 생물학적 경로를 더 잘 이해하려면 이러한 경로의 구성 요소와 BM 처리에?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 줄리 머클 (Julie Merkle)이 원고에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R15GM137236에 의해 O.D.에 지원되었습니다. 공초점 및 초해상도 이미지는 NSF MRI 보조금 2018748로 구입 한 Airyscan 2와 함께 Zeiss LSM 900을 사용하여 획득했습니다.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
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