Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila
Summary
La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.
Abstract
La membrana basal (BM), una lámina especializada de matriz extracelular presente en el lado basal de las células epiteliales, es crítica para el establecimiento y mantenimiento de la morfología del tejido epitelial y la morfogénesis de los órganos. Además, el BM es esencial para el modelado de tejidos, sirviendo como una plataforma de señalización y proporcionando fuerzas externas para dar forma a los tejidos y órganos. A pesar de los muchos papeles importantes que desempeña el BM durante el desarrollo normal y las condiciones patológicas, las vías biológicas que controlan el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y cómo la secreción basal conduce a la deposición polarizada de las proteínas BM son poco conocidas. El epitelio folicular del ovario de Drosophila es un excelente sistema modelo para estudiar la deposición basal de proteínas de membrana BM, ya que produce y secreta todos los componentes principales del BM. Las imágenes confocales y de superresolución combinadas con el procesamiento de imágenes en tejidos fijos permiten la identificación y caracterización de factores celulares específicamente involucrados en el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM. Este artículo presenta un protocolo detallado para teñir y obtener imágenes de vesículas que contienen BM y BM depositadas utilizando proteínas marcadas endógenamente en el epitelio folicular del ovario de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar para abordar cuestiones cualitativas y cuantitativas y fue desarrollado para acomodar el cribado de alto rendimiento, lo que permite la identificación rápida y eficiente de los factores involucrados en el tráfico intracelular polarizado y la secreción de vesículas durante el desarrollo del tejido epitelial.
Introduction
La membrana basal (BM) es una lámina delgada de matriz extracelular adherente a células en capas (ECM) crítica para la estructura epitelial y la morfogénesis1. Comprende ~ 50 proteínas y se encuentra ubicuamente subyacente a las células epiteliales y endoteliales, y entuba las células esqueléticas, lisas y del músculo cardíaco y los adipocitos 1,2,3. Los tres componentes principales de la BM en el lado basal de las células epiteliales son el colágeno IV, el perlecano y las lamininas. El BM subyace a las células epiteliales y es responsable de muchas funciones, incluida la separación y barrera tisular, el crecimiento y el soporte, y la polarización celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Su papel como plataforma de señalización regula la morfología y diferenciación de las células epiteliales y tejidos duranteel desarrollo 3,13,14. Además, la mala regulación de la BM y/o una brecha en su integridad son las causas primarias de muchas afecciones patológicas, incluida la metástasis tumoral 2,15,16. A pesar de las funciones esenciales realizadas por el BM durante la morfogénesis de tejidos y órganos, los componentes de la(s) vía(s) biológica(s) dedicada(s) al tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas BM son vagamente conocidos.
Para estudiar el tráfico intracelular de vesículas que contienen BM y la secreción de proteínas BM por las células epiteliales, el epitelio folicular (FE) del ovario de Drosophila es un poderoso sistema modelo (Figura 1). Un ovario de Drosophila comprende 16-20 estructuras largas, en forma de tubo, llamadas ovarioles (Figura 1A, B)17,18,19. Cada ovariole se puede considerar como una línea de ensamblaje de huevos, con la progresión de edad de las cámaras de huevos (que cada una da lugar a un huevo) que comienza en el extremo anterior y se mueve hacia atrás, hasta que el óvulo maduro sale a través del oviducto. Cada cámara de óvulos está encapsulada por la FE, una monocapa de células foliculares somáticas (FC), que rodea las células de la línea germinal central (GC). La FE está altamente polarizada con una distinta polaridad apical-basal donde el dominio apical se enfrenta a la línea germinal, y las proteínas BM se secretan basalmente18,19. Los FC secretan activamente todos los componentes principales del BM, incluyendo Colágeno IV, Perlecan y Lamininas20,21. En las células epiteliales como las FC, los componentes BM se producen y requieren una vía de secreción polarizada especializada para su deposición extracelular. Por ejemplo, en el caso del componente más abundante del BM, el colágeno IV (Coll IV), los detalles que rodean su tráfico intracelular polarizado y su secreción son vagos a pesar de que su producción y deposición son el foco de muchos estudios. Coll IV se traduce en el retículo endoplásmico (RE), que es también donde cada fibrilla, compuesta de tres polipéptidos (dos cadenas α1 y una cadena α2), se ensambla en una triple hélice22. El plegamiento y la función adecuados de Coll IV requieren chaperonas y enzimas ER, incluidas lisil y prolil-hidroxilasas como Plod y PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Estas enzimas posttraduccionales regulan la clasificación ER de Coll IV, ya que la pérdida de cada una hace que Coll IV quede atrapado en el ER basal 20,23,24,25,26. Luego, el Coll IV recién sintetizado sale de la sala de emergencias para el Golgi en vesículas recubiertas de COPII. El receptor de carga Tango1 ayuda a empaquetar colágenos en vesículas de Golgi de gran tamaño que pueden acomodar grandes proteínas multiméricas20,27. Una vez que Coll IV se empaqueta en vesículas exocíticas intracelulares, se secreta específicamente basalmente de las células epiteliales. Para dirigir la deposición de BM al lado basal, las células epiteliales requieren otro conjunto de factores específicamente dedicados a la secreción de BM polarizada. Utilizando la FE del ovario de Drosophila, se han caracterizado algunos componentes de este novedoso proceso celular, incluidos los factores de intercambio de nucleótidos (GEFs) Crag y Stratum, las GTPasas Rab8 y Rab10, así como los niveles de fosfoinositida PI(4,5)P2, y las proteínas motoras Kinesin 1 y 3 20,28,29,30,31 . Estos componentes son críticos para asegurar la distribución polarizada de las proteínas BM.
Para monitorizar la localización intracelular de las proteínas BM en la FE, se pueden utilizar proteínas de membrana basal marcadas endógenamente (trampas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) y Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. Se ha demostrado que estas líneas trampa de proteínas reflejan con precisión la distribución endógena de las proteínas BM y permiten una detección más sensible del tráfico vesicular28,30. Los componentes implicados en la deposición polarizada de BM en la FE se caracterizaron por primera vez utilizando líneas trampa de proteínas para Vkg-GFP y Pcan-GFP 20,28,29,30. Las trampas de proteínas se pueden usar en diferentes orígenes genéticos, incluidos mutantes y líneas Gal4 34. Además, las trampas de proteínas se pueden utilizar en combinación con colorantes fluorescentes y/o inmunotinción de fluorescencia, lo que permite una caracterización precisa de la localización de proteínas BM al comparar condiciones de tipo salvaje y mutante35.
Para evaluar de manera precisa y eficiente la distribución y localización de las vesículas que contienen proteínas BM, la microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y las técnicas de imagen de superresolución presentan una ventaja significativa para otros enfoques de imágenes. Estos enfoques combinan imágenes de alta resolución con relativa facilidad de uso. CLSM es una técnica de microscopía que permite una resolución óptica mejorada mediante el escaneo de la muestra con un láser de una manera de escaneo ráster utilizando galvanómetros. La abertura estenopeica es un componente central de un microscopio confocal. Al bloquear las señales desenfocadas que vienen de arriba o por debajo del plano focal, la apertura estenopeica da como resultado una resolución muy superior en el eje z36. Esto también permite obtener una serie de imágenes en el plano z, llamadas z-stack, correspondientes a una serie de secciones ópticas. Posteriormente, las pilas z crean una imagen 3D de la muestra, a través de la reconstrucción 3D, con la ayuda de un software de imágenes. Los microscopios convencionales de epifluorescencia (campo ancho), a diferencia de los microscopios confocales, permiten que la luz desenfocada contribuya a la calidad de la imagen, disminuyendo la resolución de la imagen y el contraste36,37. Esto hace que la microscopía de epifluorescencia sea un candidato menos atractivo cuando se estudia la localización o colocalización de proteínas.
Aunque CLSM es un enfoque adecuado para diversas aplicaciones, incluidas las imágenes y la caracterización del tráfico intracelular de proteínas BM, todavía presenta un problema cuando se toman imágenes de muestras por debajo del límite de difracción de luz de Abbe (200-250 nm). Al obtener imágenes de tales muestras, la microscopía confocal, especialmente cuando se utiliza un objetivo de aceite, puede dar como resultado una alta resolución. Sin embargo, las técnicas de superresolución superan el límite de la microscopía confocal. Existen varios enfoques para lograr la microscopía de superresolución, cada uno con límites de resolución específicos y cada uno apropiado para diferentes análisis. Estos enfoques incluyen microscopía de localización fotoactivada (PALM) o microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED), microscopía de iluminación estructurada (SIM) y microscopía Airyscan (superresolución) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Aunque Airyscan tiene una resolución más gruesa que PALM / STORM, STED y SIM, aún puede lograr una resolución de hasta ~ 120 nm (aproximadamente el doble de la resolución de CLSM). Además, se ha demostrado que este enfoque de microscopía de superresolución tiene una ventaja sobre la SIM y otras técnicas de superresolución al obtener imágenes de muestras gruesas y muestras con una baja relación señal-ruido47,48.
Airyscan es una tecnología de microscopía confocal de superresolución relativamente nueva46. A diferencia de los CLSM tradicionales, que utilizan los detectores estenopeicos y de un solo punto para rechazar la luz desenfocada, este enfoque de superresolución utiliza un detector de área de tubo fotomultiplicador de 32 canales de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) que recoge toda la luz en cada posición de escaneo45. Cada uno de los 32 detectores funciona como un pequeño agujero de alfiler, reduciendo el tamaño del agujero de la unidad aireada (U.A.) tradicional 1.0 a un 0.2 A.U. mejorado, lo que permite una resolución aún mayor y una relación señal-ruido, al tiempo que mantiene la eficiencia de un diámetro45 de 1.25 A.U. Además, la deconvolución lineal utilizada por Airyscan da como resultado un aumento de hasta 2 veces en la resolución45. Teniendo esto en cuenta, CLSM, y específicamente la microscopía de superresolución, son muy adecuados para estudiar las proteínas BM y las proteínas que regulan la deposición basal de las proteínas BM, ya que pueden producir imágenes de muy alta resolución para estudios de localización y colocalización, proporcionando así nuevos conocimientos sobre los eventos espaciales, temporales y moleculares que controlan estos procesos.
Un enfoque alternativo a la microscopía confocal que se puede utilizar para realizar experimentos de localización es la deconvolución de imágenes. Dado que la microscopía de campo ancho permite que la luz desenfocada llegue a los detectores, se pueden aplicar algoritmos matemáticos y computacionales de deconvolución para eliminar o reasignar la luz desenfocada de las imágenes obtenidas por microscopía de campo ancho, mejorando así la resolución y el contraste de la imagen49. Los algoritmos de deconvolución también se pueden aplicar a imágenes confocales para aumentar aún más la resolución y el contraste, produciendo imágenes finales casi comparables a las de la microscopía de superresolución50. Airyscan hace uso de la deconvolución basada en el filtro Weiner junto con la reasignación de píxeles de Sheppard, lo que resulta en una resolución espacial altamente mejorada y una relación señal-ruido. En comparación con la microscopía confocal, se observa un aumento de 2x en la resolución en las tres dimensiones espaciales (120 nm en x e y, y 350 nm en z) cuando se utiliza esta técnica de microscopía de superresolución45,51.
Este manuscrito proporciona protocolos detallados y optimizados para teñir, adquirir y visualizar el tráfico intracelular y la deposición de proteínas BM utilizando la FE del ovario de Drosophila como sistema modelo junto con microscopía confocal y de superresolución. Las líneas de Drosophila que expresan proteínas de membrana basal marcadas endógenamente, por ejemplo, Vkg-GFP y Pcan-GFP, son herramientas eficientes y precisas para visualizar el tráfico y la secreción de proteínas BM. Además, se pueden usar fácilmente en diferentes antecedentes genéticos, incluidas las líneas mutantes y Gal4 / UAS 34. Aunque se recomiendan las proteínas de la membrana basal marcadas endógenamente, el uso de anticuerpos contra proteínas BM específicas también es compatible con los protocolos descritos. Estos protocolos son particularmente útiles para los científicos que están interesados en estudiar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas BM en el tejido epitelial intacto utilizando imágenes confocales y de superresolución. Además, la capacidad de combinar el análisis del tejido epitelial con las herramientas expansivas de la genética Drosophila hace que este enfoque sea especialmente poderoso. Finalmente, estos protocolos podrían adaptarse fácilmente para estudiar el tráfico vesicular y la clasificación de otras proteínas de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
El BM es crítico para la morfogénesis embrionaria y de órganos, y las funciones fisiológicas adultas. Además, el BM actúa como plataforma de señalización para el establecimiento y mantenimiento de la polaridad epitelial y proporciona soporte a los tejidos2. Sin embargo, los mecanismos que regulan la colocación adecuada de las proteínas BM son poco conocidos. Una mejor comprensión de las vías biológicas dedicadas al tráfico intracelular y la secreción polarizada de las proteínas BM …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Julie Merkle por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la subvención R15GM137236 de los NIH a O.D. Las imágenes confocales y de superresolución se adquirieron utilizando un Zeiss LSM 900 con Airyscan 2, comprado con la subvención NSF MRI 2018748.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
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