Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis

Summary

A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.

Abstract

A membrana do porão (ML) – uma folha especializada de matriz extracelular presente no lado basal das células epiteliais – é fundamental para o estabelecimento e manutenção da morfologia do tecido epitelial e da morfogênese do órgão. Além disso, o BM é essencial para a modelagem tecidual, servindo como uma plataforma de sinalização, e fornecendo forças externas para moldar tecidos e órgãos. Apesar dos muitos papéis importantes que o BM desempenha durante o desenvolvimento normal e as condições patológicas, as vias biológicas que controlam o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e como a secreção basal leva à deposição polarizada das proteínas BM são mal compreendidas. O epitélio folicular do ovário Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar a deposição basal de proteínas de membrana BM, pois produz e secreta todos os principais componentes do ovário BM. A imagem confocal e super-resolução combinada com o processamento de imagens em tecidos fixos permite a identificação e caracterização de fatores celulares especificamente envolvidos no tráfico intracelular e na deposição de proteínas BM. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para coloração e imagem de vesículas contendo BM e BM depositado usando proteínas marcadas endogenosamente no epitélio folicular do ovário de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado para abordar questões qualitativas e quantitativas e foi desenvolvido para acomodar a triagem de alto rendimento, permitindo a identificação rápida e eficiente dos fatores envolvidos no tráfico intracelular polarizado e secreção de vesículas durante o desenvolvimento do tecido epitelial.

Introduction

A membrana do porão (BM) é uma fina folha de matriz extracelular aderente a células em camadas (ECM) crítica para estrutura epitelial e morfogênese¹. Compreende ~50 proteínas e é encontrado onipresentemente subjacente às células epiteliais e endoteliais, e células esqueléticas, lisas e cardíacas e adipócitos ^1,2,3. Os três principais componentes do BM no lado basal das células epiteliais são Colágeno IV, Perlecan e Laminins. O BM está por trás das células epiteliais e é responsável por muitas funções, incluindo separação e barreira tecidual, crescimento e suporte, e polarização celular 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Seu papel como plataforma de sinalização regula a morfologia e diferenciação de células e tecidos epiteliais durante o desenvolvimento ^3,13,14. Além disso, a má regulação do BM e/ou uma violação de sua integridade são as principais causas de muitas condições patológicas, incluindo a metástase tumoral ^2,15,16. Apesar das funções essenciais desempenhadas pelo MMC durante a morfogênese tecidual e de órgãos, os componentes da via biológica dedicada ao tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas BM são vagamente conhecidos.

Para estudar o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e a secreção de proteínas BM por células epiteliais, o epitélio folicular (FE) do ovário de Drosophila é um poderoso sistema modelo (Figura 1). Um ovário de Drosophila compreende 16-20 estruturas longas, semelhantes a tubos, chamadas ovários (Figura 1A,B)17,18,19. Cada ovário pode ser considerado como uma linha de montagem de ovos, com a progressão de idade das câmaras de ovos (que cada uma dá origem a um ovo) que começa na extremidade anterior e se move posteriormente, até que o ovo maduro saia através do oviduto. Cada câmara de ovo é encapsulada pela FE, uma monocamada de células folículos somáticas (FCs), que circunda as células germinais centrais (GCs). O FE é altamente polarizado com uma distinta polaridade apical-basal onde o domínio apical enfrenta a germinal, e as proteínas BM são secretas basally ^18,19. Os FCs secretam ativamente todos os principais componentes do BM, incluindo Colágeno IV, Perlecan e Laminins^20,21. Em células epiteliais como FCs, os componentes de BM são produzidos e requerem um caminho de secreção polarizada especializada para sua deposição extracelularmente. Por exemplo, no caso do componente mais abundante do BM, Colágeno IV (Coll IV), os detalhes em torno de seu tráfico intracelular polarizado e secreção são vagos, apesar de sua produção e deposição serem o foco de muitos estudos. A coll IV é traduzida no ânticulo endoplasmático (ER), que também é onde cada fibril – composto por três polipeptídeos (duas cadeias α1 e uma cadeia α2) – é montado em uma hélice tripla²². A dobra e a função adequadas coll IV requerem acompanhantes e enzimas ER, incluindo lysyl e prolyl-hidroxilases como Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Essas enzimas pós-transacionais regulam a classificação do ER de Coll IV, pois a perda de cada uma faz com que o Coll IV fique preso no ER basal 20,23,24,25,26. Em seguida, o recém-sintetizado Coll IV sai do ER para o Golgi em vesículas revestidas de COPII. O receptor de carga Tango1 auxilia na embalagem de collagens em vesículas consideráveis ligadas a Golgi que podem acomodar grandes proteínas multiméricas^20,27. Uma vez que Coll IV é embalado em vesículas exocóis exocóis intracelulares, é especificamente secretado basalmente de células epiteliais. Para direcionar a deposição de BM para o lado basal, as células epiteliais requerem outro conjunto de fatores especificamente dedicados à secreção polarizada de BM. Usando o FE do ovário Drosophila, alguns componentes deste novo processo celular foram caracterizados, incluindo os fatores de troca de nucleotídeos (GEFs) Crag e Stratum, os GTPases Rab8 e Rab10, bem como os níveis do fosfoinostito PI(4,5)P2, e Kinesin 1 e 3 proteínas motoras 20,28,29, ^30,31 . Esses componentes são fundamentais para garantir a distribuição polarizada das proteínas BM.

Para monitorar a localização intracelular de proteínas BM no FE, proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente (armadilhas proteicas), como Viking-GFP (Vkg-GFP ou α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP) podem ser utilizadas ^32,33. Estas linhas de armadilhas proteicas têm sido demonstradas para refletir com precisão a distribuição endógena das proteínas BM e permitir uma detecção mais sensível do tráfico vesicular^28,30. Os componentes envolvidos na deposição polarizada de BM no FE foram caracterizados pela primeira vez utilizando linhas de armadilha de proteína para Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Armadilhas proteicas podem ser usadas em diferentes origens genéticas, incluindo mutantes e linhas Gal4 ³⁴. Além disso, armadilhas proteicas podem ser usadas em combinação com corantes fluorescentes e/ou imunostaining de fluorescência, permitindo uma caracterização precisa da localização de proteínas BM ao comparar condições do tipo selvagem e mutantes³⁵.

Avaliar com precisão e eficiência a distribuição e localização de vesículas contendo proteínas BM, microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) e técnicas de imagem de super resolução apresentam uma vantagem significativa para outras abordagens de imagem. Estas abordagens acoplam imagens de alta resolução com relativa facilidade de uso. CLSM é uma técnica de microscopia que permite uma melhor resolução óptica escaneando a amostra com um laser em uma maneira de varredura raster usando galvanômetros. A abertura do pinhole é um componente central de um microscópio confocal. Bloqueando os sinais fora de foco provenientes de cima ou abaixo do plano focal, a abertura do pinhole resulta em uma resolução altamente superior no eixo z³⁶. Isso também permite obter uma série de imagens no plano z, chamada de pilha z, correspondente a uma série de seções ópticas. z-stacks posteriormente criar uma imagem 3D do espécime, através de reconstrução 3D, com o auxílio de software de imagem. Microscópios convencionais de epifluorescência (widefield), ao contrário dos microscópios confocal, permitem que a luz fora de foco contribua para a qualidade da imagem, diminuindo a resolução da imagem e o contraste^36,37. Isso torna a microscopia de epifluorescência um candidato menos atraente ao estudar localização ou colocalização de proteínas.

Embora o CLSM seja uma abordagem adequada para várias aplicações, incluindo imagem e caracterização do tráfico intracelular de proteínas BM, ele ainda apresenta um problema quando amostras de imagem abaixo do limite de difração de luz de Abbe (200-250 nm). Ao fotografar tais amostras, a microscopia confocal, especialmente quando se utiliza um objetivo de óleo, pode resultar em alta resolução. No entanto, as técnicas de super-resolução ultrapassam o limite da microscopia confocal. Existem várias abordagens para alcançar microscopia de super-resolução, cada uma com limites de resolução específicos, e cada uma apropriada para diferentes análises. Essas abordagens incluem microscopia de localização fotoativada (PALM) ou microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de esgotamento de emissões estimulada (STED), microscopia de iluminação estruturada (SIM) e microscopia airyscana (super-resolução) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Embora o Airyscan tenha uma resolução mais grosseira que PALM/STORM, STED e SIM, ele ainda pode alcançar uma resolução de até ~120 nm (cerca de duas vezes a resolução do CLSM). Além disso, essa abordagem de microscopia de super resolução tem mostrado ter uma vantagem sobre o SIM e outras técnicas de super-resolução ao fotografar amostras grossas e amostras com uma baixa relação sinal-ruído^47,48.

Airyscan é uma tecnologia de microscopia confocal relativamente nova⁴⁶. Ao contrário dos CLSMs tradicionais, que usam o pinhole e os detectores de ponto único para rejeitar a luz fora de foco, esta abordagem de super-resolução usa um detector de área de tubo de arsultipto de arsênio de 32 canais (GaAsP) que coleta toda a luz em cada posição de varredura⁴⁵. Cada um dos 32 detectores funciona como um pequeno pinhole, reduzindo o tamanho do pinhole da tradicional Unidade Aérea 1.0 (A.U.) para um 0,2 A.U., permitindo uma resolução ainda maior e relação sinal-ruído, mantendo a eficiência de um diâmetro de 1,25 A.U.^{, 45}. Além disso, a desconvolução linear usada pelo Airyscan resulta em até um aumento de 2x na resolução⁴⁵. Levando isso em consideração, o CLSM, e especificamente a microscopia de super resolução, são adequados para estudar proteínas e proteínas de BM que regulam a deposição basal das proteínas BM, pois podem produzir imagens de alta resolução para estudos de localização e colocalização, fornecendo assim novas percepções nos eventos espaciais, temporais e moleculares que controlam esses processos.

Uma abordagem alternativa à microscopia confocal que pode ser usada para realizar experimentos de localização é a desconvolução de imagens. Uma vez que a microscopia widefield permite que a luz fora de foco atinja os detectores, algoritmos matemáticos e de desconvolução computacional podem ser aplicados para remover ou recoltir a luz fora de foco das imagens obtidas pela microscopia de campo largo, melhorando assim a resolução e o contraste da imagem⁴⁹. Algoritmos de desconvolução também podem ser aplicados a imagens confocal para aumentar ainda mais a resolução e o contraste, produzindo imagens finais quase comparáveis à da microscopia de super resolução⁵⁰. Airyscan faz uso da desconvolução baseada em filtro Weiner, juntamente com a redesignação de pixels de Sheppard, resultando em uma resolução espacial altamente melhorada e relação sinal-ruído. Em comparação com a microscopia confocal, observa-se um aumento de 2x em resolução nas três dimensões espaciais (120 nm em x e y, e 350 nm em z) ao utilizar esta técnica de microscopia de super resolução^45,51.

Este manuscrito fornece protocolos detalhados e otimizados para manchar, adquirir e visualizar o tráfico intracelular e a deposição de proteínas BM utilizando o FE do ovário Drosophila como um sistema modelo aliado à microscopia confocal e super-resolução. As linhas de drosophila que expressam proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente, por exemplo, Vkg-GFP e Pcan-GFP, são ferramentas eficientes e precisas para visualizar o tráfico e a secreção de proteínas BM. Além disso, eles podem ser facilmente usados em diferentes origens genéticas, incluindo as linhas mutante e Gal4/UAS ³⁴. Embora proteínas de membrana de porão marcadas endógenamente sejam recomendadas, o uso de anticorpos contra proteínas BM específicas também é compatível com os protocolos descritos. Esses protocolos são particularmente úteis para cientistas interessados em estudar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas BM em tecido epitelial intacto usando imagens confocal e super-resolução. Além disso, a capacidade de combinar a análise do tecido epitelial com as ferramentas expansivas da genética drosophila torna essa abordagem especialmente poderosa. Finalmente, esses protocolos poderiam ser facilmente adaptados para estudar o tráfico vesicular e a triagem de outras proteínas de interesse.

Protocol

1. Preparação de moscas para dissecções de ovário Coloque 10-15 moscas fêmeas de melanogaster Drosophila (1-2 dias de idade) do genótipo desejado em um frasco estreito contendo ~8 mL de mosca drosophila granulado com uma pequena quantidade de levedura granulada 2-3 dias antes da dissecção a 25 °C. Adicionar alguns machos ao frasco pode aumentar a produção de câmara de ovos. No entanto, certifique-se de que o número total de moscas não exceda 20, pois isso pode …

Representative Results

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para imagem eficiente e precisa e caracterizar o tráfico intracelular e secreção de proteínas BM em células epiteliais polarizadas, como a FE do ovário de Drosophila . Em seguida, fornecemos resultados antecipados obtidos usando os métodos descritos, bem como conselhos úteis e potenciais armadilhas. Para isso, é utilizado O Vkg-GFP, um Vkg com etiqueta endógena (Drosophila Col IV). No entanto, os mesmos resultados podem ser alcançados com outras…

Discussion

O BM é fundamental para morfogênese embrionária e de órgãos, e funções fisiológicas adultas. Além disso, o BM atua como uma plataforma de sinalização para o estabelecimento e manutenção da polaridade epitelial e fornece tecidos com suporte². No entanto, os mecanismos que regulam a colocação adequada das proteínas BM são mal compreendidos. Uma melhor compreensão das vias biológicas dedicadas ao tráfico intracelular e à secreção polarizada das proteínas BM requer uma análise…

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing