Konfokal och superupplöst avbildning av polariserad intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner under Drosophila Oogenesis

Summary

Källarmembranet är viktigt för vävnads- och organmorfogenes under utvecklingen. För att bättre förstå mekanismerna som leder till korrekt placering av denna struktur beskriver det presenterade protokollet metoder för att visualisera och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av källarmembranproteiner i epitelceller med hjälp av konfokal och superupplösningsmikroskopi.

Abstract

Källarmembranet (BM) – ett specialiserat ark av extracellulär matris närvarande vid basalsidan av epitelceller – är avgörande för etablering och underhåll av epitelvävnadsmorfologi och organmorfogenes. Dessutom är BM avgörande för vävnadsmodellering, som fungerar som en signalplattform och ger yttre krafter för att forma vävnader och organ. Trots de många viktiga roller som BM spelar under normal utveckling och patologiska tillstånd, är de biologiska vägarna som styr den intracellulära handeln med BM-innehållande vesiklar och hur basalsekretion leder till polariserad avsättning av BM-proteiner dåligt förstådda. Follikulärt epitel av Drosophila-äggstocken är ett utmärkt modellsystem för att studera den basala avsättningen av BM-membranproteiner, eftersom den producerar och utsöndrar alla huvudkomponenter i BM. Konfokal och superupplösningsavbildning i kombination med bildbehandling i fasta vävnader möjliggör identifiering och karakterisering av cellulära faktorer som är specifikt involverade i intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner. Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för färgning och avbildning av BM-innehållande vesiklar och deponerad BM med användning av endogent märkta proteiner i follikulärt epitel i Drosophila-äggstocken . Detta protokoll kan tillämpas för att ta itu med både kvalitativa och kvantitativa frågor och det utvecklades för att tillgodose screening med hög genomströmning, vilket möjliggör snabb och effektiv identifiering av faktorer som är involverade i polariserad intracellulär handel och utsöndring av vesiklar under epitelvävnadsutveckling.

Introduction

Källarmembranet (BM) är ett tunt ark av skiktad cellanhängande extracellulär matris (ECM) som är kritisk för epitelstruktur och morfogenes¹. Den består av ~ 50 proteiner och finns allestädes närvarande under epitel- och endotelcellerna och ensheathing skelett-, slät- och hjärtmuskelceller och adipocyter ^1,2,3. De tre huvudkomponenterna i BM vid epitelcellernas basala sida är kollagen IV, perlekan och lamininer. BM ligger till grund för epitelcellerna och ansvarar för många funktioner, inklusive vävnadsseparation och barriär, tillväxt och stöd och cellpolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dess roll som signalplattform reglerar morfologin och differentieringen av epitelceller och vävnader under utveckling ^3,13,14. Dessutom är felreglering av BM och / eller ett brott mot dess integritet de främsta orsakerna till många patologiska tillstånd, inklusive tumörmetastas ^2,15,16. Trots de väsentliga funktioner som utförs av BM under vävnads- och organmorfogenes är komponenterna i de biologiska vägarna som är avsedda för den polariserade intracellulära handeln och utsöndringen av BM-proteiner vagt kända.

För att studera intracellulär handel med BM-innehållande vesiklar och utsöndringen av BM-proteiner genom epitelceller är follikulärt epitel (FE) i Drosophila-äggstocken ett kraftfullt modellsystem (Figur 1). En Drosophila-äggstock består av 16-20 långa, rörliknande strukturer, kallade ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Varje ovariol kan ses som en äggmonteringslinje, med åldersprogressionen för äggkammare (som var och en ger upphov till ett ägg) som börjar vid den främre änden och rör sig bakåt tills det mogna ägget går ut genom äggledaren. Varje äggkammare är inkapslad av FE, ett monolager av somatiska follikelceller (FC), som omger de centrala könscellerna (GCs). FE är starkt polariserad med en distinkt apikal-basal polaritet där den apikala domänen vetter mot könslinjen och BM-proteinerna utsöndras basalt^18,19. FC utsöndrar aktivt alla huvudkomponenter i BM, inklusive kollagen IV, perlekan och lamininer^20,21. I epitelceller såsom FC produceras BM-komponenterna och kräver en specialiserad polariserad utsöndringsväg för deras avsättning extracellulärt. Till exempel, när det gäller den vanligaste komponenten i BM, Kollagen IV (Coll IV), är detaljerna kring dess polariserade intracellulära handel och utsöndring vaga trots att dess produktion och avsättning är i fokus för många studier. Coll IV översätts i endoplasmatisk retikulum (ER), vilket också är där varje fibril – bestående av tre polypeptider (två α1-kedjor och en α2-kedja) – monteras i en trippelhelix²². Korrekt Coll IV-vikning och funktion kräver ER-chaperoner och enzymer, inklusive lysyl- och prolyl-hydroxylaser såsom Plod och PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Dessa posttranslationella enzymer reglerar ER-sorteringen av Coll IV, eftersom förlusten av var och en gör att Coll IV fångas i basal ER 20,23,24,25,26. Sedan lämnar nyligen syntetiserade Coll IV ER för Golgi i COPII-belagda vesiklar. Lastreceptorn Tango1 hjälper till att förpacka kollagener i stora Golgi-bundna vesiklar som rymmer stora multimera proteiner^20,27. När Coll IV har förpackats i intracellulära exocytiska vesiklar utsöndras den specifikt basalt från epitelceller. För att rikta BM-avsättning till basalsidan kräver epitelceller en annan uppsättning faktorer som är specifikt dedikerade till polariserad BM-utsöndring. Med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken har några komponenter i denna nya cellulära process karakteriserats, inklusive nukleotidutbytesfaktorerna (GEFs) Crag och Stratum, GTPaserna Rab8 och Rab10, liksom nivåerna av fosfoinositid PI (4,5) P2 och Kinesin 1 och 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Dessa komponenter är avgörande för att säkerställa polariserad fördelning av BM-proteiner.

För att övervaka den intracellulära lokaliseringen av BM-proteiner i FE kan endogent märkta källarmembranproteiner (proteinfällor), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) och Perlecan-GFP (Pcan-GFP) användas^32,33. Dessa proteinfälllinjer har visat sig exakt återspegla den endogena fördelningen av BM-proteiner och möjliggör mer känslig upptäckt av vesikulär handel^28,30. Komponenterna som är involverade i den polariserade avsättningen av BM i FE karakteriserades först med hjälp av proteinfälllinjer för Vkg-GFP och Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfällor kan användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutanter och Gal4-linjer ³⁴. Dessutom kan proteinfällor användas i kombination med fluorescerande färgämnen och / eller fluorescensimmunfärgning, vilket möjliggör exakt karakterisering av lokaliseringen av BM-proteiner vid jämförelse av vildtyp och mutantförhållanden³⁵.

För att exakt och effektivt bedöma distribution och lokalisering av BM-proteininnehållande vesiklar utgör konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) och superupplösande bildtekniker en betydande fördel för andra avbildningsmetoder. Dessa tillvägagångssätt kopplar samman högupplöst avbildning med relativ användarvänlighet. CLSM är en mikroskopiteknik som möjliggör en förbättrad optisk upplösning genom att skanna provet med en laser på ett rasterskanningssätt med galvanometrar. Pinhålets bländare är en kärnkomponent i ett konfokalmikroskop. Genom att blockera de ofokuserade signalerna som kommer uppifrån eller under fokalplanet resulterar hålöppningen i en mycket överlägsen upplösning i z-axeln³⁶. Detta gör det också möjligt att få en serie bilder i z-planet, kallad en z-stack, motsvarande en serie optiska sektioner. z-stacks skapar därefter en 3D-bild av exemplaret, via 3D-rekonstruktion, med hjälp av bildprogramvara. Konventionella epifluorescensmikroskop (widefield), till skillnad från konfokalmikroskop, tillåter ljus utanför fokus att bidra till bildkvalitet, minska bildupplösningen och^{kontrasten 36,37}. Detta gör epifluorescensmikroskopi till en mindre attraktiv kandidat när man studerar proteinlokalisering eller samlokalisering.

Även om CLSM är ett lämpligt tillvägagångssätt för olika applikationer, inklusive avbildning och karakterisering av intracellulär handel med BM-proteiner, utgör det fortfarande ett problem när avbildningsprover under Abbes diffraktionsgräns för ljus (200-250 nm). Vid avbildning av sådana prover kan konfokalmikroskopi, särskilt vid användning av ett oljemål, resultera i hög upplösning. Superupplösningstekniker överskrider dock gränsen för konfokalmikroskopi. Det finns olika tillvägagångssätt för att uppnå superupplösningsmikroskopi, var och en med specifika upplösningsgränser, och var och en lämplig för olika analyser. Dessa tillvägagångssätt inkluderar fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimulerad emissionsutarmningsmikroskopi (STED), strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) och Airyscan (superupplösning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Även om Airyscan har en grövre upplösning än PALM/STORM, STED och SIM, kan den fortfarande uppnå en upplösning på upp till ~120 nm (ungefär dubbelt så hög upplösning som CLSM). Dessutom har denna superupplösande mikroskopimetod visat sig ha en fördel jämfört med SIM och andra superupplösningstekniker vid avbildning av tjocka prover och prover med ett lågt signal-brusförhållande^47,48.

Airyscan är en relativt ny superupplöst konfokalmikroskopiteknik⁴⁶. Till skillnad från traditionella CLSM, som använder pinhåls- och enpunktsdetektorer för att avvisa ljus som inte är i fokus, använder denna superupplösningsmetod en 32-kanals galliumarsenidfosfid (GaAsP) fotomultiplikatorrörsdetektor som samlar allt ljus vid varje skanningsposition⁴⁵. Var och en av de 32 detektorerna fungerar som ett litet hål, vilket minskar hålstorleken från den traditionella 1.0 Airy Unit (A.U.) till en förbättrad 0.2 A.U., vilket möjliggör en ännu högre upplösning och signal-brusförhållande, samtidigt som effektiviteten hos en 1.25 A.U. diameter⁴⁵ bibehålls. Dessutom resulterar den linjära dekonvolutionen som används av Airyscan i upp till 2x ökning av upplösning⁴⁵. Med hänsyn till detta är CLSM, och specifikt superupplösningsmikroskopi, väl lämpade för att studera BM-proteiner och proteiner som reglerar den basala avsättningen av BM-proteiner, eftersom de kan producera mycket högupplösta bilder för lokaliserings- och samlokaliseringsstudier, vilket ger nya insikter i de rumsliga, tidsmässiga och molekylära händelser som styr dessa processer.

Ett alternativt tillvägagångssätt för konfokalmikroskopi som kan användas för att utföra lokaliseringsexperiment är bilddekonvolution. Eftersom widefield-mikroskopi tillåter out-of-focus-ljus att nå detektorerna, kan matematiska och beräkningsmässiga dekonvolutionsalgoritmer tillämpas för att ta bort eller omtilldela ljus utanför fokus från bilder som erhållits genom widefield-mikroskopi, vilket förbättrar upplösningen och kontrasten i bilden⁴⁹. Dekonvolutionsalgoritmer kan också tillämpas på konfokala bilder för att ytterligare öka upplösningen och kontrasten, vilket ger slutliga bilder nästan jämförbara med superupplösningsmikroskopi⁵⁰. Airyscan använder weiner-filterbaserad dekonvolution tillsammans med Sheppards pixelomplacering, vilket resulterar i en mycket förbättrad rumslig upplösning och signal-brusförhållande. Jämfört med konfokalmikroskopi observeras en ökning med 2x i upplösning i alla tre rumsliga dimensioner (120 nm i x och y och 350 nm i z) när man använder denna superupplösande mikroskopiteknik^45,51.

Detta manuskript ger detaljerade och optimerade protokoll för att fläcka, förvärva och visualisera intracellulär handel och avsättning av BM-proteiner med hjälp av FE för Drosophila-äggstocken som ett modellsystem i kombination med konfokal och superupplösande mikroskopi. Drosophila-linjer som uttrycker endogent märkta källarmembranproteiner, t.ex. Vkg-GFP och Pcan-GFP, är effektiva och exakta verktyg för att visualisera BM-proteinhandel och utsöndring. Dessutom kan de enkelt användas i olika genetiska bakgrunder, inklusive mutant- och Gal4 / UAS-linjer ³⁴. Även om endogent märkta källarmembranproteiner rekommenderas, är användningen av antikroppar mot specifika BM-proteiner också kompatibel med de beskrivna protokollen. Dessa protokoll är särskilt användbara för forskare som är intresserade av att studera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i intakt epitelvävnad med hjälp av konfokal och superupplösningsavbildning. Dessutom gör förmågan att kombinera epitelvävnadsanalys med de expansiva verktygen för Drosophila-genetik detta tillvägagångssätt särskilt kraftfullt. Slutligen kan dessa protokoll enkelt anpassas för att studera vesikulär handel och sortering av andra proteiner av intresse.

Protocol

1. Flugberedning för äggstocksdissektioner Lägg 10-15 Drosophila melanogaster honflugor (1-2 dagar gamla) av önskad genotyp i en smal injektionsflaska innehållande ~ 8 ml Drosophila flugmedium strös med en liten mängd granulerad bagerijäst 2-3 dagar före dissektion vid 25 ° C. Att lägga till några hanar i injektionsflaskan kan öka äggkammarens utbyte. Se dock till att det totala antalet flugor inte överstiger 20 eftersom detta kan påverka äggstocksutvecklinge…

Representative Results

Metoderna som beskrivs häri kan användas för att effektivt och exakt avbilda och karakterisera intracellulär handel och utsöndring av BM-proteiner i polariserade epitelceller, såsom FE hos Drosophila-äggstocken . Därefter ger vi förväntade resultat som erhållits med hjälp av de beskrivna metoderna, samt användbara råd och potentiella fallgropar. För att göra det används Vkg-GFP, en endogent märkt Vkg (Drosophila Col IV). Samma resultat kan dock uppnås med andra endogent märkta BM-pro…

Discussion

BM är avgörande för embryonal och organmorfogenes och vuxna fysiologiska funktioner. Dessutom fungerar BM som en signalplattform för etablering och underhåll av epitelpolaritet och ger vävnader stöd². Ändå är mekanismerna som reglerar korrekt placering av BM-proteiner dåligt förstådda. En bättre förståelse av de biologiska vägarna som är dedikerade till intracellulär handel och polariserad utsöndring av BM-proteiner kräver en noggrann analys av komponenterna i dessa vägar och…

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing