상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.
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방법 논문
쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경근 접합부 (NMJ)는 운동 뉴런에서 골격근으로의 신호 전달을 담당하는 복잡한 구조이며 시냅스 전 운동 축삭 말단, 시냅스 후 니코틴 아세틸 콜린 수용체 (AchRs) 및 시냅스 주위 슈완 세포 (PSCs)의 세 가지 필수 조직 학적 구성 요소로 구성됩니다. NMJ의 형태학적 특성을 입증하기 위하여, 래트 내측 위장관근을 표적 조직으로 선정하고, 운동 신경 섬유 및 이들의 시냅스 전 말단에 대한 뉴로필라멘트 200(NF200) 및 수포성 아세틸콜린 수송체(VAChT)를 포함하는 다양한 종류의 바이오마커와 함께 다중 형광 염색을 사용하여 시냅스 후 니코틴 AchRs에 대한 알파-분가로톡신(α-BTX)을 조사하고, 및 PSC에 대한 S100. 이 연구에서, 염색은 두 그룹으로 수행되었다: 첫 번째 그룹에서, 샘플은 NF200, VAChT, 및 α-BTX로 염색되었고, 두 번째 그룹에서는 샘플을 NF200, α-BTX 및 S100으로 염색하였다. 두 프로토콜 모두 NMJ의 상세한 구조를 효과적으로 입증할 수 있음을 보여주었다. 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체 및 PSC의 형태 학적 특성을 관찰하고 Z 스택 이미지를 입체 패턴으로 재구성하여 다른 라벨링 간의 공간 상관 관계를 추가로 분석했습니다. 방법론의 관점에서, 이들 프로토콜은 생리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 조사하기 위한 유용한 참고문헌을 제공하며, 이는 또한 말초 신경 손상 및 재생과 같은 NMJ의 병리학적 변경을 평가하는데 적합할 수 있다.
서론
신경 근 접합부(NMJ)1,2,3,4의 3가지 필수 구조적 성분으로서, 시냅스 전 운동 축삭 말단의 형태학적 측면, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AchRs)를 함유하는 시냅스 후 막, 및 시냅스 주위 슈완 세포(PSCs)가 광범위하게 조사되었다. 골격근의 얇은 절편 및 전체 탑재 표본은 전자 현미경 5,6, 공초점 현미경 7,8 및 광 시트 현미경 9,10과 같은 다른 조직학적 기술로 검사되었습니다. NMJ의 형태학적 특성이 상이한 측면에서의 이들 기술에 의해 입증되었지만, 비교로서, 공초점 현미경은 여전히 NMJ의 상세한 형태학의 이미징을 위한 이상적인 선택이다.
최근에는 NMJ의 구조적 성분을 보여주기....
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프로토콜
이 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (승인 번호 2021-04-15-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트(Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 사용하였다. 쥐는 온도와 습도가 조절되고 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 12 시간의 빛 / 어두운주기에 보관되었습니다. 이 연구를 위한 장비 및 재료는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 관류
- 쥐의 안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg 트리브로모 에탄올 용액을 복강내 주입하십시오.
- 호흡이 멈추면 흉강을 열어 가위와 포셉을 사용하여 심장에 접근하십시오. 왼쪽 심장 심실에서 대동맥쪽으로 정맥 내 카테터를 삽입 한 다음 오른쪽 귀를 자릅니다.
- 실험용 쥐를 후드에 퍼퓨즈하십시오. 우측 귀에서 빠져 나오는 혈액이 맑을 때까지 0.9% 정상 식염수 100mL로 관류한 다음, 꼬리가 구부러지기 어려울 때까지 약 1....
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결과
다중 형광 염색 후, 상응하는 표지는 NF200 양성 신경 섬유, VAChT 양성 시냅스 전 시냅스 말단, α-BTX 양성 시냅스 후 AchRs, S100 양성 PSCs, 팔로이드 양성 근육 섬유, 및 DAPI 표지된 세포 핵을 갖는 래트 내측 위장관 근육의 80 μm 두께 절편에서 질서 정연하게 입증되었다 (도 3 및 도 4).
NF200 양성 신경 섬유가 다발로 달리고 VAChT 양성 사전 시냅스 말단에 분기하여 α-BTX 양성 후 시냅스 후 AchRs와 미러 관계를 형성하는 것으로 나타났습니다 (그림 3). 또한, S100 양성 PSCs는 시냅스 전 말단에 가까운 NF200 양성 신경 섬유 주위에서 검출되었다(도 4).
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토론
우리는 근육 절편의 성공적인 다중 염색을 수행하고 쥐 내측 위장관 근육의 두꺼운 절편에서 NMJ의 형태학적 특성을 드러내기 위한 형광 면역조직화학의 사용에 필요한 기술적 세부사항을 기술하였다. 이 접근법을 사용함으로써, PSCs와 사전 및 사후 시냅스 요소의 미세한 세부 사항 및 공간 상관관계가 공초점 현미경 하에서 분석되고 평가될 수 있고, 입체 패턴으로 추가로 재구성될 수 있다. 여기서, NMJ의 형태학적 특성을 밝히기 위해 다양한 종류의 바이오마커가 사용되었는데, 여기서, NF200은 수초화된 축삭 20,21 상에서 고도로 발현되고, 시냅스 전 말단(22)에서 축적된 VAChT는 α시냅스 후 AchRs 23,24, 및 S100은 PSCs 25,26에 도시되어 있다........
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 CACMS 혁신 기금 (아니오. CI2021A03407), 중국 국립자연과학재단(제82004299호), 중앙공공복지연구소 기초연구기금(제호. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로 | ThermoFisher | D3571 | |
| 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 | 올림푸스 | FV1200 | |
| 당나귀 안티 치킨 AF488 | 잭슨 | 149973 (703-545-155) | |
| 당나귀 안티 염소 AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| 당나귀 안티 토끼 AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| 당나귀 안티 토끼 AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| 냉동 단면 매체 | ThermoFisher | Neg-50 | 무색 |
| 현미경 커버 유리 | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | 토끼 |
| 뉴로 필라멘트 200 | Abcam | ab4680 | 닭 |
| 일반 당나귀 혈청 | 잭슨 면역 연구소 | 017-000-12 | 10ml |
| 일반 식염수 | 산동 Hualu 제약 Co.Ltd | H37022750 250ml | |
| 파라포름알데히드 | 맥클린 | P804536 | 500g |
| 팔로이딘 AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| 정밀 연동 펌프 | 더 긴 | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | 토끼 |
| 인산나트륨 dbasic 십이수화물 | 맥클린 | S818118 | 500g |
| 인산나트륨 일염기성 이수화물 | 맥클린 | S817463 | 500g |
| 자당 | 맥클린 | S818046 | 500g |
| Superfrost plus 현미경 슬라이드 | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| 트리톤 X-100 | Solarbio 생명 과학 | 9002-93-1 | 100 ml |
| 소포 아세틸 콜린 수송체 | Milipore | ANB100 | 염소 |
| 및 알파; - bungarotoxin AF647 접합체 | ThermoFisher | B35450 |
참고문헌
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K.
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재인쇄 및 허가
