Summary
يوضح البروتوكول طريقة لفحص الارتباط المكاني بين المحطات الطرفية قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، وخلايا شوان شبه المشبكية في عضلة المعدة الإنسية للفئران باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية مع مؤشرات حيوية مختلفة ، وهي الخيوط العصبية 200 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي ، ألفا بونغاروتوكسين ، و S100.
Abstract
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي بنية معقدة تعمل على توصيل الإشارة من الخلية العصبية الحركية إلى العضلات الهيكلية وتتكون من ثلاثة مكونات نسيجية أساسية: أطراف المحور العصبي الحركي قبل المشبكي ، ومستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية بعد المشبكي (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). من أجل إثبات الخصائص المورفولوجية ل NMJ ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف وفحصها باستخدام تلطيخ فلورسنت متعدد مع أنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية ، بما في ذلك الخيوط العصبية 200 (NF200) وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT) للألياف العصبية الحركية ومحطاتها قبل المشبكية ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) ل AchRs النيكوتينية بعد المشبكية ، و S100 ل PSCs. في هذه الدراسة ، تم إجراء التلطيخ في مجموعتين: في المجموعة الأولى ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و VAChT و α-BTX ، وفي المجموعة الثانية ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و α-BTX و S100. وقد تبين أن كلا البروتوكولين يمكن أن يظهرا بفعالية الهيكل التفصيلي لل NMJ. باستخدام المجهر البؤري ، شوهدت الخصائص المورفولوجية للمحطات الطرفية ما قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، و PSC ، وتم إعادة بناء صور مكدسات Z الخاصة بهم في نمط ثلاثي الأبعاد لمواصلة تحليل الارتباط المكاني بين العلامات المختلفة. من منظور المنهجية ، توفر هذه البروتوكولات مرجعا قيما للتحقيق في الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الفسيولوجية ، والتي قد تكون مناسبة أيضا لتقييم التغيير المرضي ل NMJ ، مثل إصابة الأعصاب الطرفية وتجديدها.
Introduction
كثلاثة مكونات هيكلية أساسية للوصلة العصبية العضلية (NMJ) 1،2،3،4 ، تم التحقيق على نطاق واسع في الجوانب المورفولوجية لمحطات المحور الحركي قبل المشبكي ، والغشاء ما بعد المشبكي الذي يحتوي على مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). تم فحص المقاطع الرقيقة والعينات الكاملة من عضلات الهيكل العظمي باستخدام تقنيات نسيجية مختلفة ، مثل المجهر الإلكتروني 5,6 ، والمجهر البؤري7,8 ، والمجهر الضوئي 9,10. على الرغم من أن الخصائص المورفولوجية ل NMJ قد تم إثباتها من خلال هذه التقنيات من جوانب مختلفة ، على سبيل المقارنة ، لا يزال المجهر البؤري خيارا مثاليا لتصوير المورفولوجيا التفصيلية ل NMJ.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات الجديدة لإظهار المكونات الهيكلية ل NMJ. على سبيل المثال ، تم استخدام الفئران الفلورية المعدلة وراثيا الخاصة بك 1-YFP مباشرة لمراقبة محاور المحرك ولوحات نهاية المحرك في الجسم الحي وفي المختبر10,11. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحقن الوريدي للفلورسنت α-BTX للكشف عن التوزيع المكاني للوحات نهاية المحرك في العضلات الهيكلية الكاملة للفئران الفلورية من النوع البري والمعدلة وراثيا ، باستخدام علاج إزالة الأنسجة البصرية للفحص باستخدام المجهر الضوئي 9,12. ومع ذلك ، إلى جانب العناصر قبل وبعد المشبكية التي يمكن عرضها بواسطة هذه الأساليب المتقدمة ، لا يمكن إثبات PSCs في نفس الوقت.
تشير الأدلة المتراكمة إلى أن PSCs ، باعتبارها الخلايا الدبقية الطرفية ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأطراف ما قبل المشبكية التي تساهم في تطوير واستقرار NMJ ، وتعديل النشاط المشبكي ل NMJ في ظل الحالة الفسيولوجية ، وتجديد NMJ بعد إصابة الأعصاب13,14,15 . بالنظر إلى البنية الخلوية ل NMJ ، يعد هذا البروتوكول مرشحا مناسبا لتسمية PSCs في وقت واحد ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، ومن المحتمل أن يستخدم لتقييم سلامة ومرونة NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. على سبيل المثال ، قارن شدة NMJ ، ومورفولوجيا وحجم الألواح الطرفية الحركية بعد المشبكي ، وتعصيب وإزالة NMJ ، وعدد PSCs في عضلات الحالة الفسيولوجية والمرضية.
العضلة المعدية هي أكبر عضلة تشكل الانتفاخ في ربلة الساق ، والتي يتم تشريحها بسهولة عن طريق إزالة الجلد وعضلة عظم الفخذ ذات الرأسين من الطرف. غالبا ما يتم اختيار العضلات لتقييم ضمور العضلات ، والتنكس العصبي العضلي ، وأداء العضلات ، وقوة الوحدة الحركية خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي16،17،18. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية مناسبة أيضا للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ من مختلف العضلات الهيكلية. في الوقت نفسه ، يمكن أن تكشف أقسام العضلات السميكة عن مورفولوجيا وكمية أكثر اكتمالا من NMJ مقارنة بالأقسام الرقيقة 7,8 وألياف العضلات الضايقة19.
تمشيا مع هذه الدراسات ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف في هذه الدراسة وتم تقطيعها بسماكة 80 ميكرومتر لتلطيخ الفلورسنت المتعدد بأنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية وفقا للمكونات الهيكلية ل NMJ. هنا ، تم استخدام الخيوط العصبية 200 (NF200) 20,21 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT)22 ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) 23,24 ، و S100 25,26 لتسمية الألياف العصبية ، والمحطات الطرفية قبل المشبكية ، و AchRs بعد المشبكية ، و PSCs على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم مواجهة خلفية الأنسجة العضلية والنوى الخلوية بشكل أكبر مع phalloidin و DAPI.
في هذه الدراسة ، نتوقع تطوير بروتوكول مكرر لتلطيخ البنية الخلوية ل NMJ في وقت واحد مع المؤشرات الحيوية المقابلة لها على عينات ثابتة أكثر سمكا ، وهو أكثر ملاءمة للاستخدام في الفحص المجهري البؤري ويساعد على الحصول على مزيد من المعلومات حول البنية التفصيلية ل PSCs ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، وكذلك ارتباطها المكاني ببعضها البعض. من منظور المنهجية ، قد يفيد هذا البروتوكول في تقييم الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في معهد الوخز بالإبر والكى ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الموافقة رقم 2021-04-15-1). وأجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن العاصمة، 1996). تم استخدام ثلاثة فئران ذكور بالغة (Sprague-Dawley ، الوزن 230 ± 15 جم). تم إيواء الفئران في دورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة مع درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها ومع حرية الوصول إلى الطعام والماء. يتم عرض الأدوات والمواد اللازمة لهذه الدراسة في الشكل 1.
1. التروية
- حقن 250 مغ/كغ من محلول ثلاثي برومو الإيثانول داخل الصفاق للحث على القتل الرحيم للفئران.
- بمجرد توقف التنفس ، افتح التجويف الصدري للوصول إلى القلب باستخدام المقص والملقط. أدخل قسطرة وريدية من البطين القلبي الأيسر باتجاه الشريان الأورطي، ثم اقطع الأذن اليمنى.
- تخلل الفئران التجريبية في غطاء محرك السيارة. ابدأ بالنفخ مع 100 مل من محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ حتى يصبح الدم الخارج من الأذن اليمنى واضحا ، ثم استمر في الذوبان مع 250-300 مل من 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M الفوسفات العازل (PB ، الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يصعب ثني الذيل.
2. التشريح الإقليمي
- بعد التروية، قم بإزالة جلد الطرف الخلفي الثنائي باستخدام شفرة جراحية (الشكل 2A) وكشف العصب الوركي الثنائي وعضلة المعدة الوسطى الإنسية (الشكل 2B).
- تشريح العضلة المعدية الإنسية الثنائية بعناية من الطرف الخلفي باستخدام شفرة (الشكل 2C) وبعد إصلاح العضلة بأكملها في 10 مل من 4٪ paraformaldehyde في 0.1 M PB لمدة 2 ساعة.
- قم بإزالة العضلات من المحلول وقم بالتبريد بحماية العضلات في 10 مل من السكروز بنسبة 25٪ في 0.1 M PB لمدة يوم واحد عند 4 درجات مئوية حتى يتم غمر العضلات بالكامل في المحلول.
3. الاستئصال بالتبريد للعضلة
- بمجرد غمر الأنسجة العضلية في المحلول ، قم بإصلاحها في مرحلة التجميد لنظام microtome المنزلق باستخدام وسط مقطع مجمد. قم بتقطيع العضلة أفقيا على طول المحور الطويل للعضلة بسماكة 80 ميكرومتر.
- ضع سبعة أقسام تبريد لكل بئر بطريقة منظمة في لوحة استزراع من ستة آبار مع 10 مل من 0.1 م PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) باستخدام فرشاة.
ملاحظة: يتم ترتيب الأقسام بحيث تكون الأقسام في الآبار المختلفة متجاورة ، مما يجعل الأقسام المستخدمة للبقع المختلفة أكثر اتساقا.
4. تلطيخ الفلورسنت متعددة مع NF200 ، VAChT ، α-BTX ، و Pha
ملاحظة: تم تطبيق تلطيخ الفلورسنت المتعدد باستخدام NF200 و VAChT و α-BTX و Pha للكشف عن الألياف العصبية ، وأطراف ما قبل المشبكي ، ومستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية بعد المشبكية ، والألياف العضلية ، على التوالي.
- احتضان أربعة أقسام لكل بئر مع 1.5 مل من 0.1 M PB تحتوي على 75 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100 (0.5٪) و 45 ميكرولتر من مصل الحمير العادي (3٪) على شاكر مداري عند 20 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
- انقل الأقسام إلى 1.5 مل من محلول مختلط من الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على أرنب مضاد NF200 (1:1000) ، والماعز المضاد ل VAChT (1:500) في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع مصل الحمير العادي بنسبة 1٪ ، و 0.5٪ Triton X-100 ، واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام 3x لمدة 5 دقائق لكل منها في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) على شاكر مداري عند 20 دورة في الدقيقة.
- احتضان الأقسام في 1.5 مل من محلول مختلط من الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الحمار المضاد للأرانب AF488 (1:500) والحمار المضاد للماعز AF546 (1:500) ، وكذلك المؤشرات الحيوية α-BTX و AF647 (1:500) و phalloidin 350 (1:500) في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على 1٪ مصل الحمار العادي و 0.5٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. حماية من الضوء.
- بعد غسل 3x لمدة 5 دقائق لكل منها في 0.1 M PB (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر. ضع زجاج الغطاء على الأقسام باستخدام 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر للمراقبة.
5. تلطيخ الفلورسنت متعددة مع NF200 ، S100 ، α-BTX ، و DAPI
ملاحظة: الإجراءات مماثلة لتلك الواردة في الخطوة 4؛ الفرق الرئيسي هو بين الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية المقابلة لها.
- استخدم الأجسام المضادة الأولية التالية: الدجاج المضاد NF200 (1:6,000) ، الأرنب المضاد S100 (1:2,500) في الخطوة 4.2 والأجسام المضادة الثانوية المقابلة لها: الحمار المضاد للدجاج AF488 (1:500) والحمار المضاد للأرانب AF546 (1:500) ، بالإضافة إلى المؤشرات الحيوية α-BTX AF647 (1:500) و DAPI (1:50000) في الخطوة 4.3.
6. الملاحظة والتحليلات
- راقب العينة والتقط الصور باستخدام نظام تصوير متحد البؤرة مجهز بعدسات موضوعية التالية: عدسة 20x مع عدسة NA من 0.75 وعدسة 40x مع NA من 0.95.
- استخدم الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات من 350 نانومتر (Pha) ، 488 نانومتر (NF200) ، 546 نانومتر (VAChT و S100) ، 647 نانومتر (α-BTX) ، أو DAPI المقابلة لتلطيخ الفلورسنت المتعدد. اضبط دقة التقاط الصور على 640 × 640 بكسل.
ملاحظة: يتم اختيار دقة 640 × 640 بكسل لأنه تم التقاط الصور في مكدسات Z. تؤدي الدقة 1024 × 1024 بكسل إلى التصوير البطيء والتبييض الضوئي في مكدسات Z. - اضبط المستوى البؤري للبدء والمستوى البؤري للنهاية. اضبط حجم الخطوة على 1 ميكرومتر أو 2 ميكرومتر. اختر نمط العمق والتقاط الصور وسلسلة Z.
- بالنسبة لصور التكبير الأقل التي تم التقاطها بمعدل 20 ضعفا، التقط 40 صورة (مكدسات Z) بحجم خطوة 2 ميكرومتر من كل مقطع بسمك 80 ميكرومتر باستخدام ثقب 105 ميكرومتر. اختر وضع الإسقاط/التضاريس وإسقاط الكثافة على المحور Z لدمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد.
- للحصول على صور تكبير أعلى تم التقاطها بمعدل 40 ضعفا، التقط 80 صورة (مكدسات Z) بحجم خطوة 1 ميكرومتر من كل مقطع بسمك 80 ميكرومتر مع ضبط التكبير/التصغير على 2 وثقب 105 ميكرومتر. ادمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد.
- أعد بناء الصور في النمط ثلاثي الأبعاد باستخدام نظام معالجة الصور كما هو موضح سابقا في27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد تلطيخ الفلورسنت المتعدد ، تم عرض العلامات المقابلة بشكل منظم على الأقسام التي يبلغ سمكها 80 ميكرومتر من عضلة المعدة الإنسية للفئران مع ألياف عصبية إيجابية NF200 ، وأطراف ما قبل المشبك إيجابية VAChT ، و AchRs إيجابية α BTX ، و PSCs إيجابية S100 ، وألياف عضلية إيجابية الفيلويدين ، ونوى خلوية تحمل علامة DAPI (الشكل 3 والشكل 4).
وقد تبين أن الألياف العصبية الموجبة NF200 تعمل في حزمة وتعطي فروعا للأطراف الطرفية المشبكية قبل المشبكية الموجبة ل VAChT والتي شكلت علاقة مرآة مع AchRs α-BTX الإيجابية بعد المشبكية (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن PSCs إيجابية S100 حول الألياف العصبية الإيجابية NF200 بالقرب من المحطات الطرفية قبل المشبكية (الشكل 4).
من خلال الاستفادة من إعادة بناء الصورة ، تم عرض الارتباط المكاني للألياف العصبية ، ومحطات ما قبل المشبكي ، و PSCs ، و AchRs بعد المشبكية في نمط ثلاثي الأبعاد يوضح الخصائص المورفولوجية التفصيلية ل NMJ من وجهات نظر مختلفة (الشكل 3C ، C1 والشكل 4C ، C1).
الشكل 1. صور لخطوات البروتوكول المختلفة. (أ) تغطى الفئران في غطاء المحرك. (ب) تشريح عضلة المعدة الإنسية للفئران. (ج) قطع الأنسجة العضلية في مرحلة التجمد من نظام microtome المنزلق. (د) جمع أجزاء الأنسجة بشكل منظم في طبق من ستة آبار. (ه) تلطيخ الفلورسنت على الشاكر. (و) تركيب الأقسام على شرائح المجهر. (ز) ضع أغطية على الأقسام التي تحتوي على 50٪ من الجلسرين. (ح) مراقبة العينات باستخدام نظام تصوير متحد البؤرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. إجراء التشريح الإقليمي لتشريح عضلة الجرذ المعدية الإنسية. (أ) الرؤية الخارجية للعضلات في الطرف الخلفي للفئران. (ب) منظر داخلي للعضلة المعدية الإنسية وتعصيبها. (ج) تشريح عضلة الفئران المعدية الإنسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الارتباط المكاني للألياف العصبية ، والطرفيات قبل المشبكية ، ومستقبلات أستيل كولين النيكوتينية بعد المشبكية ، والألياف العضلية على عضلة المعدة الإنسية للفئران. (أ ) صورة تمثيلية من عضلة المعدة الإنسية للفئران تظهر تلطيخ الفلورسنت المتعدد بالخيوط العصبية 200 (NF200) ، وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT) ، وألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) ، والفيلويدين (Pha). (ب ) الصورة المكبرة من اللوحة A (رأس السهم) التي تعرض الملصقات المختلفة بالتفصيل. B1-B4: اللوحة B تظهر بشكل منفصل مع NF200 (B1) وVAChT (B2) و α-BTX (B3) و Pha (B4). (C) الصور المعدلة من اللوحة B مع الإطار الذي يظهر العرض الأمامي لنمط 3D في (C) والعرض الخلفي في (C1). نفس شريط المقياس ل B1-B4 كما هو الحال في B. يرجى النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. الارتباط المكاني للألياف العصبية، وخلايا شوان شبه المشبكي، ومستقبلات الأستيل كولين بعد النيكوتينية بعد المشبكي، والنوى الخلوية على عضلة المعدة الإنسية للفئران. (أ) صورة تمثيلية من عضلة المعدة الإنسية للفئران تظهر تلطيخ الفلورسنت المتعدد بالخيوط العصبية 200 (NF200) ، وعلامة خلية شوان (S100) ، وألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) ، وعلامة النواة الخلوية 4'،6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). (ب) الصورة المكبرة من اللوحة A (رأس السهم) التي تعرض الملصقات المختلفة بالتفصيل. B1-B4: اعرض اللوحة B بشكل منفصل باستخدام NF200 (B1) وS100 (B2) و α-BTX (B3) وDAPI (B4). (C) الصور المعدلة من اللوحة B مع الإطار في نمط ثلاثي الأبعاد في (C) والعرض بدون وضع علامة S100 في (C1). نفس شريط المقياس ل B1-B4 كما هو الحال في B. يرجى النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد وصفنا التفاصيل التقنية المطلوبة لإجراء تلطيخ متعدد ناجح لشرائح العضلات واستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ على الأقسام السميكة من عضلة المعدة الإنسية للفئران. باستخدام هذا النهج ، يمكن تحليل التفاصيل الدقيقة والارتباط المكاني ل PSCs والعناصر قبل وبعد المشبكية وتقديرها تحت المجهر البؤري ، وإعادة بنائها في نمط ثلاثي الأبعاد. هنا ، تم استخدام أنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ ، حيث يتم التعبير عن NF200 بشكل كبير على المحاور النخاعية 20,21 ، VAChT المتراكمة في المحطات الطرفية قبل المشبكي22 ، يتم عرض α-BTX على AchRs23,24 بعد المشبكي ، ويظهر S100 على PSCs 25,26 . تشير النتائج التي توصلنا إليها ونتائج الدراسات السابقة إلى أنه يمكن الجمع بين هذه المؤشرات الحيوية بحرية لتسمية العناصر الهيكلية ل NMJ وفقا للتصميم التجريبي لتقييم علاقتها المكانية ببعضها البعض 1,28,29.
للحصول على تصوير مثالي باستخدام هذه التقنية ، يعد وقت ما بعد الإصلاح مشكلة مهمة يجب الانتباه إليها لأن التثبيت الزائد قد يتسبب في خلفية عالية. لذلك ، يوصى بعدم تجاوز وقت ما بعد الإصلاح 2 ساعة في حل الإصلاح. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل مراقبة المزيد من NMJ في الأقسام العضلية ، من الأهمية بمكان تقطيع العضلات أفقيا على طول المحور الطويل بسماكة 80 ميكرومتر ، والتي يمكن أن توضح بشكل شامل الارتباط المكاني للمحطات الطرفية ما قبل المشبكية ، و AchRs بعد المشبكي ، و PSCs في NMJ. هنا ، يجب التأكيد على أن الميكروتوم المنزلق هو أداة مريحة لتقطيع الأنسجة العضلية. وبالمثل ، يمكن أيضا استخدام cryostat و vibratome للحصول على أقسام سميكة.
باختصار ، تمت دراسة الخصائص المورفولوجية ل NMJ على نطاق واسع من الأقسام النسيجية ثنائية الأبعاد إلى الأنسجة ثلاثية الأبعاد الكاملة باستخدام تقنيات مختلفة. بالنظر إلى علاجات الأنسجة الشاقة والمستهلكة للوقت للفحص باستخدام المجهر الإلكتروني والمجهر الضوئي ، لا يزال تلطيخ الفلورسنت المتعدد على قسم الأنسجة الأكثر سمكا نهجا مناسبا لاستكشاف البنية النمطية ل NMJ بشكل فعال باستخدام المجهر البؤري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من قبل صندوق الابتكار CACMS (No. CI2021A03407)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004299)، وصناديق البحوث الأساسية للمعاهد المركزية لبحوث الرفاه العام (رقم ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E.
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J.
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
