Summary
Denne protokollen beskriver isolering av preadipocytter fra mus fra subkutant fett, deres differensiering i modne adipocytter og induksjon av insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved fosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalveien gjennom western blot. Denne metoden tillater direkte bestemmelse av insulinresistens/følsomhet i primære adipocytter.
Abstract
Insulinresistens er en redusert effekt av insulin på målcellene, vanligvis avledet fra redusert insulinreseptorsignalering. Insulinresistens bidrar til utvikling av diabetes type 2 (T2D) og andre fedmeavledede sykdommer med høy prevalens over hele verden. Derfor er forståelse av mekanismene bak insulinresistens av stor relevans. Flere modeller har blitt brukt til å studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter representerer et attraktivt alternativ for å studere mekanismene for insulinresistens og identifisere molekyler som motvirker denne tilstanden og de molekylære målene for insulinsensibiliserende legemidler. Her har vi etablert en insulinresistensmodell ved bruk av primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Adipocytter forløper celler (APCs), isolert fra kollagenase-fordøyd mus subkutant fettvev ved magnetisk celle separasjon teknologi, er differensiert i primære adipocytter. Insulinresistens induseres deretter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin som reduserer tyrosinfosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalkaskaden. Redusert fosforylering av insulinreseptor (IR), insulinreseptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantifiseres av western blot. Denne metoden gir et utmerket verktøy for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i fettvev.
Introduction
Insulin er et anabole hormon produsert av bukspyttkjertelen holme β-celler og nøkkelen regulator av glukose og lipid metabolisme. Blant de mange funksjonene regulerer insulin glukoseopptak, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det første molekylære signalet etter insulininteraksjon med reseptoren (IR) er aktiveringen av den inneboende tyrosinproteinkinaseaktiviteten til IR2, noe som resulterer i dens autofosforylering3 og den påfølgende aktiveringen av en familie av proteiner kjent som insulinreseptorsubstrater (IRS), som binder seg til adaptorproteiner som fører til aktivering av en kaskade av proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveier: fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). Den førstnevnte utgjør et hovedgrenpunkt eller node 4,5 for aktivering av mange nedstrøms effektorer involvert i ulike fysiologiske funksjoner, inkludert regulering av drivstoffhomeostase, mens sistnevnte regulerer cellevekst og differensiering 4,6. Insulinvirkninger avhenger til slutt av celletype og fysiologisk kontekst7.
Et av de viktigste insulinresponsive metabolske vevene er fettvevet. Hvitt fettvev er den mest tallrike typen fett hos mennesker og gnagere, fordelt på subkutant fett (mellom hud og muskler) og visceralt fett (rundt organene i bukhulen). Gitt deres store volum er adipocytter eller fettceller den mest tallrike celletypen i fettvev. Disse fettcellene kan være brune/beige (termogene), rosa (i brystkjertelen) og hvite 8,9. Hvite adipocytter holder de viktigste energireserver i kroppen i form av triglyserider, en insulinavhengig prosess. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hemmer lipolyse eller lipidnedbrytning 7,10. Det letter også differensieringen av preadipocytter i adipocytter - de modne fettlagrende cellene11.
Insulinresistens oppstår når et normalt insulinnivå gir en svekket biologisk respons, noe som resulterer i kompenserende hyperinsulinemi12. Insulinresistens er en tilstand assosiert med overvekt og fedme5, som når kombinert fører til type 2 diabetes (T2D) og andre metabolske sykdommer13. Hyperinsulinemi kompenserer insulinresistens i perifert vev for å opprettholde normale blodsukkernivåer14. Eventuelt tap eller utmattelse av β celler, sammen med forverret insulinresistens, fører imidlertid til forhøyede blodsukkernivåer forenlig med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinemi bidra til utvikling av fedme-avledede metabolske sykdommer15. Videre kan fedme forårsake kronisk lavgradig lokal betennelse som fremmer insulinresistens i fettvev15,16,17. I tillegg fører fedme-avledede endringer i fettvev, som fibrose, betennelse og redusert angiogenese og adipogenese, til lavere adiponektin serumnivåer (en insulinsensibilisator) og økt sekresjon av faktorer som plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1), frie fettsyrer og eksosomer i blodet, forverrer insulinresistens17.
Mange aspekter som ligger til grunn for insulinresistens forblir ukjente. In vitro og in vivo modeller er utviklet for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i viktige målvev, inkludert fettvev. Fordelen med in vitro-modeller er at forskerne har mer kontroll over miljøforholdene og kan evaluere insulinresistens i bestemte celletyper. Spesielt har adipocyttforløperceller (APCer) den individuelle fenotypen til donorvevet, noe som kan reflektere fysiologi bedre enn adipocyttcellelinjer. En hovedfaktor som induserer insulinresistens in vitro er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin som skilles ut av adipocytter og makrofager i fettvev18. Selv om det er nødvendig for riktig remodellering og ekspansjon av fettvev19, induserer langvarig eksponering for TNF-α insulinresistens i fettvev in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α-behandling av flere celletyper fører til økt serinfosforylering av både IR og IRS-1, og fremmer dermed redusert tyrosinfosforylering21. Økt fosforylering av IRS-1 på serinrester hemmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en av nøkkelmekanismene som kronisk TNF-α-behandling svekker insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veier som involverer serin/treoninkinasehemmeren av nukleær faktor ĸB kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK induserer et komplekst proinflammatorisk transkripsjonsprogram, men også direkte fosforylerer IRS-16.
Å forstå patogenesen av insulinresistens har blitt stadig viktigere for å veilede utviklingen av fremtidige terapier mot T2D. APCer har vist seg å være en utmerket modell for studier av fettcellebiologi, inkludert følsomhet og motstand mot insulin, og for å identifisere de inneboende egenskapene til adipocytter uavhengig av det systemiske miljøet. APCer kan enkelt fås fra forskjellige fettdepoter, og under passende forhold, differensiert til modne adipocytter. Med denne metoden kan direkte effekter på insulinresistens/sensitivitet evalueres i adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gnagereksperimenter ble godkjent av bioetikkomiteen ved Institutt for nevrobiologi ved UNAM, protokollnummer 075.
1. Isolering av forløperceller til mus
- Avlive 8-10 uker gamle C57BL/6-hannmus (f.eks. ved CO 2-innånding og påfølgende cervikal dislokasjon) (fire dyr per isolasjon). Desinfiser musene ved å gni med 70% etanol og oppnå fettvevet umiddelbart etter ofring.
MERK: Etter eutanasi av gnagere, isoler fettvevet umiddelbart og utfør alle trinnene inne i en steril laminær strømningshette. Mus holdes under 12 timers lyse / mørke sykluser med fri tilgang til mat og vann. - Dissekere det inguinale subkutane fettvevet fra hver mus. Fjern bare fettvevet, unngå fjerning av muskler, hud eller annet vev, og samle det i et 50 ml konisk rør inneholdende 15 ml kollagenaseoppløsning type 1 (1,5 mg / ml) på is. Løs opp type 1 kollagenase i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) høy glukose-1% bovint serumalbumin (BSA) og filtrer gjennom 0,2 μm sprøytefiltre.
- Klipp fettvevet i små biter med steril kirurgisk saks og fordøy prøvene ved inkubasjon med type 1 kollagenaseoppløsning ved 37 °C i en orbital shaker (150 rpm) i 30 minutter (plasser røret som inneholder fett og kollagenase i horisontal stilling for en større ristende overflate). Kontroller fordøyelsen hvert 10. minutt for å sikre at den fungerer (vevsnedbrytning er synlig) og for å forhindre overfordøyelse (se tilleggsfigur S1).
- Filtrer ved hjelp av en 200 μm maskesprøyte (tidligere autoklavert) for å eliminere vev som ikke fordøyes med kollagenase. Før filteret over kanten av røret for å drenere så mange celler som mulig inn i løsningen. Tilsett 15 ml kald DMEM-1% BSA for å stoppe fordøyelsen og sentrifuge ved 400 × g i 10 minutter ved 4 °C.
- Aspirer topplaget som inneholder modne adipocytter og det meste av væskelaget; Unngå å berøre eller forstyrre pelleten. Tilsett 20 ml kaldfosfatbufret saltvann (PBS)-2% fosterbovint serum (FBS) og resuspender pelleten. Sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, aspirerer først det øvre laget for å eliminere de resterende adipocytter og fett. Resuspender pelleten i 1 ml ammoniumkloridkalium (ACK) lyseringsbuffer (for å lyse røde blodlegemer) og inkuber på is i 5 minutter. Tilsett 10 ml PBS-2% FBS, bland og sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 200 μL anti-Fc-løsning (renset rotteantimus CD16/CD32 fortynnet i PBS-2% FBS [1:150]) for å redusere Fc-reseptormediert binding av antistoffer av interesse. Inkuber på is i 5 min. Overfør cellesuspensjonen til et 5 ml rør som passer inn i de forkjølte stativene til en magnetisk celleseparator og sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten, tilsett 200 μL av blandingen av CD31 (PECAM-1) monoklonalt antistoff (390) -biotin (1:100) og CD45 monoklonalt antistoff (30-F11) -biotin (1:100), bland godt og inkuber på is i 15 minutter (forbered antistofffortynninger i anti-Fc-løsning; se tabell 1). Tilsett 400 μL PBS-2% FBS og sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
MERK: CD31 og CD45 er markører for henholdsvis endotelceller og hematopoietiske celler. - Aspirer supernatanten og inkuber i 100 mikroliter antibiotinmikroperler (1:5) i 15 minutter på is (klargjør antistofffortynninger i anti-Fc-løsning, se tabell 1). Tilsett 400 μL PBS-2% FBS og sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 350 μL PBS-2% FBS. Fjern celleaggregater eller store partikler fra enkeltcellesuspensjonene med et preseparasjonsfilter (70 μm). Aktiver først filteret med 100 μL PBS-2% FBS, pass cellesuspensjonen gjennom filteret (samle i et rent rør), og vask til slutt filteret med 100 μL PBS-2% FBS.
- Utfør magnetisk separasjon av celler ved hjelp av den negative separasjonsstrategien med en magnetisk celleseparator.
- Plasser prøven i posisjon A på kjølestativet (sørg for at stativet er forkjølt) og to tomme rør i posisjon B og C for å gjenopprette henholdsvis de ikke-merkede og merkede cellene.
- Legg vaskebufferen og løpebufferen i de tilsvarende flaskene før du slår på utstyret. Programmer utstyret til å utføre magnetisk separasjon av celler med DEPLETE-protokollen .
MERK: Denne protokollen er for uttømming i standardmodus for fjerning av celler med normalt antigenuttrykk (i dette tilfellet celler merket med anti-CD31 og anti-CD45), hvis utvinning er høyeste prioritet. - I separasjonsdelen velger du antall prøver som skal separeres, og velger DEPLETE-protokollen. Trykk på Kjør og start separasjonen. På slutten av programmet, gjenvinn de umerkede cellene og sentrifugen ved 400 × g i 5 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 500 mikrol vekstmedium (tabell 1).
- Frø APCene i en brønn av en 12-brønnsplate som tidligere er belagt med 2,5% kjellermembranmatrise (ca. 50.000-75.000 celler oppnås). Tilsett 400 μL 2,5% kjellermembranmatrise for å dekke hele overflaten av hver brønn. Umiddelbart etter å ha fjernet overflødig oppløsning og bare etterlatt et lite lag, la platen tørke (uten lokk) inne i den laminære strømningshetten i minst 1 time. Inkuber ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære. Bytt medium hver 48. time til cellene når 80% samløp.
- Ved 80% sammenløp, fjern mediet helt og vask med 350 μL PBS-2% FBS. Høst cellene med 350 μL 0,05% trypsin-EDTA i 2 minutter ved 37 °C. Tilsett 2 ml vekstmedium og samle cellene i et nytt 50 ml konisk rør, deretter sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter.
- Pass APCene til 12-brønnsplater (10.000-20.000 celler per brønn) tidligere belagt med 2.5% kjellermembranmatrise. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2. Bytt medium hver 48. time til cellene når 80% samløp.
MERK: APCer kan passeres en gang. Deretter mister de sin evne til å spre seg og differensiere. Se arbeidsflyten for APCs isolasjonsprosess i tilleggsfigur S2.
2. Adipocytterdifferensiering og induksjon av insulinresistens
MERK: Vedlikehold celler ved 37 °C i 5% CO2 og utfør trinn som involverer bytte av medium og behandlinger med TNF-α og insulin inne i en steril hette.
- Ved 80% samløp, begynn differensieringsprosessen; aspirer av vekstmedium og erstatt det med 500 μL differensieringsmedium (tabell 1) som inneholder 3,3 nM benmorfogenetisk protein (BMP4) i hver brønn.
- Etter 48 timer, erstatt mediet med differensieringsmediet (500 μL per brønn) og differensieringscocktailen (tabell 1).
- Fjern mediet 72 timer senere og tilsett 100 nM insulin i 500 μL friskt differensieringsmedium.
MERK: Cellene begynner å vise et rundt utseende med små lipiddråper inni. - Aspirer av et differensieringsmedium og erstatt det med 500 μL enkelt medium-2% FBS (tabell 1) 48 timer senere. Indusere insulinresistens med 4 ng / ml TNF-α. Inkluder kontrollbrønner uten TNF-α behandling.
- Etter 24 timers inkubasjon, tilsett 4 ng / ml TNF-α i enkle medium-0% FBS (tabell 1). Oppretthold kontrollbrønner uten TNF-α behandling.
- Aktiver insulinsignalveien 24 timer senere ved å tilsette 100 nM insulin og inkuber i 15 minutter ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære. Fjern mediet og vask med 500 μL PBS. Inkluder kontrollbrønner uten insulinbehandling.
3. Evaluering av insulinsignalveien ved western blot
- Proteinekstraksjon og kvantifisering
- Vask hver brønn av celler med 500 μL PBS og hold på is for å lyse cellene i 50 μL RIPA-buffer (tabell 1) som inneholder 1% proteasehemmercocktail tilsatt like før prøveisolering. Skrap hele overflaten av brønnen med en spiss og overfør lysatet til et 0,6 ml mikrosentrifugerør (hold på is).
- Inkuber i 1 time ved 4 °C i en roterende shaker, bland med virvel og sentrifuge ved 8000 × g i 15 minutter ved 4 °C og gjenvinn supernatanten (hold på is).
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-analysen (ikke fortynn prøven for å kvantifisere).
- Ta nødvendig volum tilsvarende 40-60 μg og denaturer med 6x Laemmli-buffer (tabell 1) ved å inkubere ved 97 °C i 15 minutter mens du rister ved 550 o / min. Frys til bruk.
- SDS-polyakrylamidgelelektroforese
- Utfør SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) med en 7,5% polyakrylamidgel med 1,5 mm tykkelse. Sett gelen inn i tanken og fyll på løpende buffer (tabell 1).
- Tilsett 3 μL prestained proteinstandard til den første brønnen i gelen og last hver prøve i etterfølgende brønner.
- Kjør gelen på 80 V i ca. 15 minutter for å sikre at prøven kommer inn i polyakrylamidkonsentratorgelmatrisen. Deretter øker du spenningen til 90 V i 2,5 timer eller til 37 kDa molekylvektmarkøren kan ses i bunnen av gelen.
- Overfør proteinene fra gelen til en nitrocellulosemembran i et halvtørt kammer i 35 minutter ved 25 V. Senk gelen, membranen og filtrene i overføringsbuffer (tabell 1) på forhånd i noen minutter.
- Western blot
- Etter overføring, vask membranen med Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (tabell 1) i 3 minutter med risting ved 30 rpm.
- Blokker membranen med blokkeringsløsning (tabell 1) ved 4 °C i 1 time i konstant rotasjon.
- Skjær membranen i tre deler i henhold til molekylvektmarkøren for å inkubere over natten med forskjellige primære antistoffer (fortynnet i blokkeringsløsning) ved 4 ° C i konstant rotasjon: Fosfo-IRS1 (Tyr608) antistoff (1: 1,000), forventet bånd ved 180 kDa; Fosfo-insulinreseptor β (Tyr1150/1151) antistoff (1:1000), forventet bånd ved 95 kDa; Fosfo-Akt (Ser473) antistoff (1:1000), forventet bånd ved 60 kDa.
- Vask membranene 5x i 5 min hver med TBS-T 0,1%.
- Inkuber membranene med det tilsvarende peroksidasekoblede sekundære antistoffet (fortynnet i blokkeringsløsning) i 2 timer ved romtemperatur i konstant rotasjon: peroksidase affiniPure esel-antikanin IgG (H + L) (1: 5,000).
- Vask membranene 5x i 5 min hver med TBS-T 0,1%.
- Oppdag proteinene ved hjelp av kjemiluminescensdeteksjonssystemet. Forbered underlaget i henhold til produsentens instruksjoner.
- Legg flekken i en plastpose og tilsett 200 μL kjemiluminescerende substrat for å dekke membranen helt. Tøm overflødig underlag og fjern eventuelle luftbobler.
- Eksponer hver flekk i 30-60 s i et høyytelses bildesystem som er kompatibelt med kjemiluminescens.
- Strip membranene (trinn 10-13 i den vestlige blotseksjonen) for å bryte antistoff-antigen-interaksjonene og dermed tillate nitrocellulosemembraner å bli blottet igjen. Gjenvinn membranene og vask 3x i 5 minutter hver med TBS-T 1% ved 50 o / min.
- Inkuber i 7 minutter med 10 ml 0,2 M NaOH ved 50 o / min.
- Vask 3x i 5 min hver med vann fra springen ved 50 o / min.
- Vask i 10 min med TBS-T 1% ved 50 o / min.
- Gjenta trinn 2-9 i den vestlige blotseksjonen for å inkubere membranen med anti-beta tubulin (55 kDa) som lastekontroll ved bruk av 1:1000 fortynning.
- Utfør densitometrisk analyse25 for hvert protein ved hjelp av ImageJ-programvare (https://imagej.nih.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I løpet av de siste årene har den økte forekomsten av fedme og T2D ført til en intens søken etter mekanismene som medierer insulinresistens i fettvev. Med protokollen beskrevet her, kan APCer differensieres til modne adipocytter for å evaluere insulinresistens og følsomhet. Når APCene når samløp, tar det 10 dager å fullføre differensieringen til modne adipocytter og deres TNF-α-medierte induksjon av insulinresistens (figur 1).
APCer viser en fibroblastlignende morfologi, karakterisert ved deres flate og langstrakte form og deres vedheft til platen fullført 48 timer etter såing (figur 2A). APCer tar 2-5 dager for å nå 80% sammenløp (avhengig av antall frøede celler), en tid hvor differensieringsprosessen startes ved eksponering for differensierende cocktail (figur 2A). Eldre adipocytter begynner å vises i de følgende 6-8 dagene. Differensierte adipocytter er preget av en rund morfologi og intracellulær akkumulering av lipiddråper. Opptil 80% av cellene er differensiert ved slutten av differensieringsprosessen (figur 2B).
Insulinresistens induseres i primære adipocytter ved TNF-α-behandling (4 ng / ml) i 48 timer; denne konsentrasjonen av TNF-α endrer ikke cellens levedyktighet (tilleggsfigur S3). Deretter aktiveres insulinsignalveien ved å tilsette 100 nM insulin i 15 minutter, og fosforyleringen av hovedsignalmolekyler (IR, IRS-1 og AKT) måles ved western blot. Insulin stimulerer fosforyleringen av disse tre molekylene (figur 3) sammenlignet med kontroll, ikke-behandlede differensierte adipocytter. TNF-α reduserer insulinindusert fosforylering av IR (30%), IRS-1 (20%) og AKT (45%) (figur 3). Insulinresistente celler viser mindre aktivering av insulinsignalveien sammenlignet med insulinfølsomme celler. Videre reduserer TNF-α-behandling mRNA-ekspresjonen av kjente insulinfølsomhetsmarkører: Insr, Irs2, Glut4 og Adipoq (tilleggsfigur S4). Disse funnene bekrefter at TNF-α reduserer virkningen av insulin i primære adipocytter, og derved induserer insulinresistens.
Figur 1: Skjematisk tidslinje som representerer prosessen med adipocyttforløpercelledifferensiering og induksjon av insulinresistens. APCer isoleres fra subkutant fettvev ved hjelp av kollagenasebehandling og magnetisk celleseparasjonsteknologi. Deretter gjennomgår de en 7-dagers differensieringsprosess for å oppnå primære adipocytter. Deretter induseres insulinresistens med TNF-α i 48 timer, de første 24 timene i medium inneholder 2% FBS og de neste 24 timene med serumfritt medium for å forhindre aktivering av insulinsignalveien. Signalkaskaden aktiveres med insulin og protein ekstraheres for western blot-analyse 10 dager etter start av differensieringsprosessen for å evaluere fosforylering / aktivering av IR, IRS-1 og AKT. Forkortelser: APCs = adipocytt forløper celler; BMP4 = Bone morfogenetisk protein; IBMX = 3-isobutyl-1-metylxantin; TNF-α = tumornekrosefaktor-α; FBS = føtalt bovint serum; IR = insulinreseptor; IRS = insulinreseptorsubstrat; AKT = proteinkinase B; Tx = behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Morfologi av adipocyttforløperceller og modne adipocytter. (A) Subkutane APCer ved 80 % konfluens før differensiering induseres i 12-brønnskulturplater. (B) Subkutane primære adipocytter etter 7 dager med indusering av differensiering i 12-brønns kulturplater. Bildene ble tatt med 10x forstørrelse. Skalastenger = 100 μm. Forkortelse: APCs = adipocyttforløperceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Insulinresistens indusert av TNF-α i subkutane primære adipocytter vist ved redusert insulinindusert fosforylering av IR, IRS-1 og AKT. Subkutane adipocytter ble behandlet med TNF-α (4 ng/ml) i 48 timer og serumsultne de siste 24 timene. Etter stimulering med insulin (100 nM) i 15 minutter ble 40 μg totalt protein lastet på 7,5% gel og utsatt for SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner og blokkert i 4% fettfri melk i TBS-T 0,1%. Membranen ble undersøkt med antifosforylert IR (pIR), antifosforylert IRS-1 (pIRS-1) og antifosforylert AKT (pAKT), samt med et antikanin HRP sekundært antistoff. Signalet ble visualisert med kjemiluminescensdeteksjon og anti-β tubulin ble brukt som lastekontroll. (A) Representative flekker og (B) kvantifisering fra tre uavhengige eksperimenter. Data er gjennomsnittlige ± SEM; *, p < .05 versus kontroll. Forkortelser: TNF-α = tumor nekrose faktor-α; IR = insulinreseptor; IRS = insulinreseptorsubstrat; pX = fosforylert form av X; b-badekar = beta-tubulin; HRP = pepperrotperoksidase; Ctrl = kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Anti-Fc-løsning | renset rotte anti-mus CD16 / CD32 fortynnet i PBS-2% FBS [01:150] | |||
| TBS-T 0,1% | 0,01 m Tris-HCl (pH 8), 0,15 m NaCl, 0,1 % mellom 20 | |||
| Blokkerende løsning | 4% fettfri tørr melk fortynnet i TBS-T 0,1% | |||
| Vekst medium | 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM deksametason, 0,1 mM L-askorbinsyre 2-fosfat, 1x insulin, transferrin, natrium, selenitt (ITS) flytende media supplement, 1x linolsyre-albumin fra BSA, 10% FBS, 10 ng / ml epidermal vekstfaktor (EGF), 10 ng / ml leukemi hemmende faktor (LIF), 10 ng / ml blodplatederivert vekstfaktor BB (PDGF-BB), 5 ng/ml fibroblastvekstfaktor-basisk (bFGF) og 50 μg/ml normocin | |||
| Differensiering medium | 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM deksametason, 0,1 mM L-askorbinsyre 2-fosfat, 1x ITS flytende medietilskudd, 1x linolsyre-albumin fra BSA og 2% FBS | |||
| Differensiering cocktail | 0,5 μM 3-isobutyl-1-metylxanthin [IBMX], 1 μM deksametason, 10 μM rosiglitazon og 100 nM insulin | |||
| Enkel medium-2% FBS | 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin og 2% FBS | |||
| Enkel middels-0% FBS | 60% DMEM lav glukose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin | |||
| RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% oktylfenoksypoly (etylenoksy)etanol, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 og 0,26 M sakkarose | |||
| 6x Laemmli buffer | 1,2 g SDS, 6 mg bromfenolblå, 4,7 ml glyserol, 1,2 ml Tris base 0,5 M pH 6,8, 845 μL 2- merkaptoetanol og 2,1 ml H2O | |||
| Løpende buffer | 25 mM Tris base, 192 mM glycin, 1% SDS | |||
| Overføringsbuffer | 25 mM Tris-base, 192 mM glycin, 20% metanol | |||
Tabell 1: Løsninger som brukes i denne protokollen.
Tilleggsfigur S1: Subkutant fettvev fordøyd med kollagenase. Når fettvevet er fjernet, kuttes det i små biter med saks for å starte fordøyelsesprosessen (A), deretter inkuberes det i 30 minutter med kollagenase type 1 ved 37 ° C, 150 rpm (B). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Skjema for adipocyttforløpercelleisolasjonsprosessen. Dissekere det inguinale subkutane fettvevet og fordøye prøvene med kollagenase. Eliminer modne adipocytter ved sentrifugering og vask pelleten for å fjerne overflødig fett. Lyse de røde blodcellene og blokkere for å redusere uspesifikk binding. Merk endotelceller og makrofager med antistoffer koblet til magnetiske partikler. Utfør magnetisk separasjon av celler ved hjelp av den negative separasjonsstrategien med en magnetisk celleseparator. Frø-APCer (umerkede celler) i plater dekket med kjellermembranmatrise. Bytt medium hver 48. time til cellene når 80% samløp. Forkortelser: APCs = adipocytt forløper celler; BSA = bovint serumalbumin; FBS = føtalt bovint serum. Laget med Biorender.com. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Behandling med TNF-α for å indusere insulinresistens endrer ikke levedyktigheten til adipocytter. Levedyktigheten til modne adipocytter ble målt ved MTT-analysen etter behandling med 4 ng/ml TNF-α i 48 timer. Data er gjennomsnittlige ± SEM. Forkortelser: TNF-α = tumornekrosefaktor-α; Ctrl = kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S4: TNF-α-behandling i adipocytter reduserer ekspresjonen av insulinsensitivitetsmarkører. mRNA-ekspresjonen av Insr, Irs, Glut4 og Adipoq ble målt ved sanntids-PCR etter behandling med 4 ng/ml TNF-α i 48 timer. Data er gjennomsnittlige ± SEM; *, p < .05 versus kontroll. Forkortelser: TNF-α = tumor nekrose faktor-α; Ctrl = kontroll. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen gir en metode for å studere insulinresistens som bruker primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne modellen har fordelen at primære adipocytter kan dyrkes under definerte forhold i lange perioder med tett kontroll av cellulære miljøfaktorer26. Analysens varighet er 15-20 dager, selv om variasjoner i prosentandelen differensierte adipocytter kan forekomme mellom eksperimenter. Primære adipocytter har fordeler i forhold til cellelinjer siden de ikke har blitt kontinuerlig utvidet i kultur og nærmere fanger mangfoldet av vevet som de er avledet fra27. Videre tillater primære adipocytter å studere donorer under forskjellige fysio-patologiske sammenhenger, for eksempel mager mot overvektig, mann mot kvinne, ung mot gammel og celler fra forskjellige fettdepoter. En annen fordel med denne metoden er at cellelinjer fra CRE og knockoutmus kan genereres etter APCs isolasjon.
Et mulig problem under APCs isolasjon og differensiering er at disse cellene kan miste evnen til å differensiere, noe som sannsynligvis vil oppstå når 80% sammenløp overskrides ved starten av differensieringsprosessen. Mediet bør også endres veldig forsiktig, spesielt etter lipidakkumulering, siden differensierte adipocytter lett løsner fra kulturskålen. Videre må hvert parti kollagenase testes for fordøyelseseffektivitet, celleutbytte og cytotoksisitet26. Teknikker er utviklet for å identifisere og isolere APCer fra den stromovaskulære fraksjonen av hvitt fettvev, ved bruk av negative markører som CD31 og CD45, samt positive stamcellepopulasjonsmarkører som CD34 og Sca128,29. I denne protokollen utfører vi bare en negativ separasjon, eliminerer endotelceller og makrofager fra den stromovaskulære fraksjonen, og unngår dermed tap av preadipocytter i den positive separasjonen.
Selv om primære kulturer tillater studiet av donorvariabilitet og kompleksitet27,30, introduserer den eksperimentelle modellen begrensninger. For eksempel vil adipocytter isolert fra gamle dyr ha en lavere differensieringskapasitet og en høyere grad av lipotoksisitet sammenlignet med de fra unge dyr31,32. Protokollen kan også tilpasses for å bruke forskjellige celleseparasjonsteknikker. Hvis en automatisk magnetisk celleseparator ikke er tilgjengelig, kan manuell separasjon av cellene oppnås med kolonner eller FACS-sortering. Metoden beskrevet her for APCs isolasjon ved hjelp av en magnetisk celleseparator er en tilpasset og forenklet versjon av FACS-sorteringsprotokollen beskrevet av Macotela et al.28.
Flere inflammatoriske cytokiner har blitt brukt til å indusere insulinresistens i fettceller, inkludert TNF-α, IL-1β og IL-6 18,33,34,35,36. Dyrket 3T3-L1 adipocytter eksponert for TNF-α bli insulinresistente i løpet av flere dager, vurdert av insulinets reduserte evne til å stimulere glukoseopptak37. Disse resultatene viser at TNF-α reduserer insulinindusert fosforylering av IR, IRS-1 og AKT21,23, målt ved vestlig blot-deteksjon av totalt protein ekstrahert fra primære adipocytter. Imidlertid kan proteaser og fosfataser frigjort under cellelyse påvirke vestlig flekkdeteksjon. Den aktive tilstanden til proteiner bør bevares ved tilsetning av protease- og fosfatasehemmere til lysisbufferen og etter proteinkvantifisering ved å blande prøven med Laemmli buffer. Avslutningsvis gir denne metoden et nyttig verktøy for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i adipocytter differensiert fra muse-APCer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistanse, og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering av manuskriptet. Denne protokollen ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B.
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
- Petersen, M. C., Shulm, G. I.
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
- Cinti, S.
- Kahn, B. B., Flier, J. S.
- Klemm, D. J., et al.
- Wilcox, G.
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
