Summary
Detta protokoll beskriver isoleringen av muspreadipocyter från subkutant fett, deras differentiering till mogna adipocyter och induktion av insulinresistens. Insulinverkan utvärderas genom fosforylering/aktivering av medlemmar av insulinsignalvägen genom western blot. Denna metod möjliggör direkt bestämning av insulinresistens/känslighet i primära adipocyter.
Abstract
Insulinresistens är en minskad effekt av insulin på dess målceller, vanligtvis härledd från minskad insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrar till utvecklingen av typ 2-diabetes (T2D) och andra fetma-härledda sjukdomar med hög prevalens över hela världen. Därför är det av stor betydelse att förstå mekanismerna bakom insulinresistens. Flera modeller har använts för att studera insulinresistens både in vivo och in vitro; Primära adipocyter representerar ett attraktivt alternativ för att studera mekanismerna för insulinresistens och identifiera molekyler som motverkar detta tillstånd och de molekylära målen för insulinsensibiliserande läkemedel. Här har vi etablerat en insulinresistensmodell med hjälp av primära adipocyter i odling behandlade med tumörnekrosfaktor-α (TNF-α).
Adipocytprekursorceller (APC), isolerade från kollagenas-smält mus subkutan fettvävnad genom magnetisk cellseparationsteknik, differentieras till primära adipocyter. Insulinresistens induceras sedan genom behandling med TNF-α, ett proinflammatoriskt cytokin som minskar tyrosinfosforyleringen/aktiveringen av medlemmar i insulinsignalkaskaden. Minskad fosforylering av insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) och proteinkinas B (AKT) kvantifieras av western blot. Denna metod ger ett utmärkt verktyg för att studera mekanismerna som förmedlar insulinresistens i fettvävnad.
Introduction
Insulin är ett anabolt hormon som produceras av pankreas ö-β-celler och den viktigaste regulatorn för glukos och lipidmetabolism. Bland dess många funktioner reglerar insulin glukosupptag, glykogensyntes, glukoneogenes, proteinsyntes, lipogenes och lipolys1. Den initiala molekylära signalen efter insulininteraktion med dess receptor (IR) är aktiveringen av den inneboende tyrosinkinskinasaktiviteten hos IR2, vilket resulterar i dess autofosforylering3 och efterföljande aktivering av en familj av proteiner som kallas insulinreceptorsubstrat (IRS), som binder till adaptorproteiner vilket leder till aktivering av en kaskad av proteinkinaser4 . Insulin aktiverar två huvudsakliga signalvägar: fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K)-proteinkinas B (AKT) och Ras-mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK). Den förstnämnda utgör en viktig grenpunkt eller nod 4,5 för aktivering av många nedströmseffektorer som är involverade i olika fysiologiska funktioner, inklusive reglering av bränslehomeostas, medan den senare reglerar celltillväxt och differentiering 4,6. Insulinåtgärder beror i slutändan på celltyp och fysiologiskt sammanhang7.
En av de viktigaste insulinresponsiva metaboliska vävnaderna är fettvävnaden. Vit fettvävnad är den vanligaste typen av fett hos människor och gnagare, fördelat inom subkutant fett (mellan hud och muskler) och visceralt fett (runt organen i bukhålan). Med tanke på deras stora volym är adipocyter eller fettceller den vanligaste celltypen i fettvävnad. Dessa fettceller kan vara bruna/beige (termogena), rosa (i bröstkörteln) och vita 8,9. Vita adipocyter håller de viktigaste energireserverna i kroppen i form av triglycerider, en insulinberoende process. Insulin främjar glukostransport och lipogenes, medan det hämmar lipolys eller lipidnedbrytning 7,10. Det underlättar också differentieringen av preadipocyter till adipocyter - de mogna fettlagrande cellerna11.
Insulinresistens uppstår när en normal insulinnivå ger ett försvagat biologiskt svar, vilket resulterar i kompensatorisk hyperinsulinemi12. Insulinresistens är ett tillstånd som är förknippat med övervikt och fetma5, som i kombination leder till typ 2-diabetes (T2D) och andra metabola sjukdomar13. Hyperinsulinemi kompenserar insulinresistens i perifera vävnader för att upprätthålla normala blodsockernivåer14. Emellertid leder eventuell β-cellförlust eller utmattning, tillsammans med förvärrad insulinresistens, till förhöjda blodsockernivåer som överensstämmer med T2D5. Därför kan insulinresistens och hyperinsulinemi bidra till utvecklingen av fetma-härledda metaboliska sjukdomar15. Dessutom kan fetma orsaka kronisk låggradig lokal inflammation som främjar insulinresistens i fettvävnad15,16,17. Dessutom leder fetma-härledda förändringar i fettvävnad, såsom fibros, inflammation och minskad angiogenes och adipogenesis, till lägre adiponektinserumnivåer (en insulinsensibiliserare) och ökad utsöndring av faktorer såsom plasminogenaktivatorhämmare 1 (PAI-1), fria fettsyror och exosomer i blodomloppet, vilket förvärrar insulinresistens17.
Många aspekter som ligger bakom insulinresistens är fortfarande okända. In vitro- och in vivo-modeller har utvecklats för att studera mekanismerna som medierar insulinresistens i större målvävnader, inklusive fettvävnad. Fördelen med in vitro-modeller är att forskare har mer kontroll över miljöförhållandena och kan utvärdera insulinresistens i specifika celltyper. Särskilt, adipocytprekursorceller (APC) har den individuella fenotypen av givarvävnaden, vilket kan återspegla fysiologi bättre än adipocytcellinjer. En huvudfaktor som inducerar insulinresistens in vitro är tumörnekrosfaktor-α (TNF-α). TNF-α är ett proinflammatoriskt cytokin som utsöndras av adipocyter och makrofager i fettvävnad18. Även om det krävs för korrekt ombyggnad och expansion av fettvävnad19, inducerar långvarig exponering för TNF-α insulinresistens i fettvävnad in vivo och i adipocyter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling av flera celltyper leder till ökad serinfosforylering av både IR och IRS-1, vilket främjar minskad tyrosinfosforylering21. Ökad fosforylering av IRS-1 på serinrester hämmar IR-tyrosinkinasaktiviteten och kan vara en av de viktigaste mekanismerna genom vilka kronisk TNF-α behandling försämrar insulinverkan22,23. TNF-α aktiverar vägar som involverar serin/treoninkinashämmaren av kärnfaktorn ĸB-kinas β (IKKβ) och c-Jun N-terminalkinas (JNK)24. JNK inducerar ett komplext proinflammatoriskt transkriptionsprogram men fosforylerar också IRS-16 direkt.
Att förstå patogenesen av insulinresistens har blivit allt viktigare för att styra utvecklingen av framtida terapier mot T2D. APC har visat sig vara en utmärkt modell för studier av fettcellsbiologi, inklusive känslighet och resistens mot insulin, och för att identifiera de inneboende egenskaperna hos adipocyter oberoende av den systemiska miljön. APC kan lätt erhållas från olika fettdepåer och under lämpliga förhållanden differentieras till mogna adipocyter. Med denna metod kan direkta effekter på insulinresistens/känslighet utvärderas i adipocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla gnagarexperiment godkändes av bioetikkommittén vid UNAM: s institut för neurobiologi, protokollnummer 075.
1. Isolering av musens adipocytprekursorceller
- Avliva 8-10 veckor gamla manliga C57BL / 6-möss (t.ex. genom CO 2-inandning och efterföljande cervikal dislokation) (fyra djur per isolering). Desinficera mössen genom att gnugga med 70% etanol och få fettvävnaden omedelbart efter avlivning.
OBS: Efter avlivning av gnagare, isolera fettvävnaden omedelbart och utför alla steg inuti en steril laminär flödeshuv. Möss hålls under 12 h ljusa/mörka cykler med fri tillgång till mat och vatten. - Dissekera den inguinala subkutana fettvävnaden från varje mus. Ta endast bort fettvävnaden, undvik avlägsnande av muskler, hud eller annan vävnad och samla den i ett 50 ml koniskt rör innehållande 15 ml typ 1 kollagenaslösning (1,5 mg / ml) på is. Lös upp kollagenas av typ 1 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) högglukos-1% bovint serumalbumin (BSA) och filtrera genom 0,2 μm sprutfilter.
- Skär fettvävnaden i små bitar med steril kirurgisk sax och smält proverna genom inkubation med kollagenaslösning av typ 1 vid 37 °C i orbitalskakapparat (150 varv/min) i 30 minuter (placera röret som innehåller fett och kollagenas i horisontellt läge för en större skakyta). Kontrollera matsmältningen var 10:e minut för att se till att den fungerar (vävnadsnedbrytning är synlig) och för att förhindra övermatsmältning (se kompletterande figur S1).
- Filtrera med en 200 μm mesh-spruta (tidigare autoklaverad) för att eliminera vävnad som inte spjälkas med kollagenas. För filtret över rörets kant för att tömma så många celler som möjligt i lösningen. Tillsätt 15 ml kall DMEM-1% BSA för att stoppa matsmältningen och centrifugera vid 400 × g i 10 minuter vid 4 °C.
- Aspirera det övre lagret som innehåller mogna adipocyter och det mesta av vätskeskiktet; Undvik att röra eller störa pelleten. Tillsätt 20 ml kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS)-2% fetalt bovint serum (FBS) och suspendera pelleten igen. Centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten, aspirera först det övre lagret för att eliminera de återstående adipocyterna och fettet. Återsuspendera pelleten i 1 ml ammoniumkloridkalium (ACK) lyseringsbuffert (för att lysera röda blodkroppar) och inkubera på is i 5 minuter. Tillsätt 10 ml PBS-2% FBS, blanda och centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 200 μL anti-Fc-lösning (renad råtta anti-mus CD16/CD32 utspädd i PBS-2% FBS [1:150]) för att minska Fc-receptormedierad bindning av antikroppar av intresse. Inkubera på is i 5 min. Överför cellsuspensionen till ett 5 ml rör som passar in i de förkylda racken i en magnetisk cellseparator och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Eliminera supernatanten, tillsätt 200 μL av blandningen av CD31(PECAM-1) monoklonal antikropp (390)-biotin (1:100) och CD45 monoklonal antikropp (30-F11)-biotin (1:100), blanda väl och inkubera på is i 15 minuter (förbered antikroppsspädningar i anti-Fc-lösning; se tabell 1). Tillsätt 400 μL PBS-2% FBS och centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
OBS: CD31 och CD45 är markörer för endotelceller respektive hematopoetiska celler. - Aspirera supernatanten och inkubera i 100 μl antibiotinmikrokulor (1:5) i 15 minuter på is (förbered antikroppsspädningar i anti-Fc-lösning, se tabell 1). Tillsätt 400 μL PBS-2% FBS och centrifugera vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 350 μL PBS-2% FBS. Avlägsna cellaggregat eller stora partiklar från encellssuspensionerna med ett förseparationsfilter (70 μm). Aktivera först filtret med 100 μL PBS-2% FBS, passera cellsuspensionen genom filtret (samla i ett rent rör) och tvätta slutligen filtret med 100 μL PBS-2% FBS.
- Utför magnetisk separation av celler med hjälp av den negativa separationsstrategin med en magnetisk cellseparator.
- Placera provet i läge A på kylstället (se till att stället är förkylt) och två tomma rör i läge B och C för att återställa de omärkta respektive märkta cellerna.
- Fyll tvättbufferten och körbufferten i motsvarande flaskor innan du slår på utrustningen. Programmera utrustningen för att utföra magnetisk separation av celler med DEPLETE-protokollet .
OBS: Detta protokoll är för uttömning i standardläge för avlägsnande av celler med normalt antigenuttryck (i detta fall celler märkta med anti-CD31 och anti-CD45), om återhämtning är högsta prioritet. - I separationsavsnittet väljer du antalet prover som ska separeras och väljer DEPLETE-protokollet . Tryck på Kör och starta separationen. I slutet av programmet, återvinn de omärkta cellerna och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera pelleten på nytt i 500 μl odlingsmedium (tabell 1).
- Frö APC: erna i en brunn av en 12-brunnsplatta som tidigare belagts med 2,5% basalmembranmatris (cirka 50 000-75 000 celler erhålls). Tillsätt 400 μL 2,5% basalmembranmatris för att täcka hela ytan av varje brunn. Omedelbart efter avlägsnande av överskottslösningen och lämnar endast ett litet lager, låt plattan torka (utan lock) inuti den laminära flödeshuven i minst 1 timme. Inkubera vid 37 °C i en atmosfär på 5 %CO2 . Byt medium var 48: e timme tills cellerna når 80% sammanflöde.
- Vid 80% sammanflöde, ta bort mediet helt och tvätta med 350 μL PBS-2% FBS. Skörda cellerna med 350 μL 0,05% trypsin-EDTA i 2 min vid 37 °C. Tillsätt 2 ml odlingsmedium och samla cellerna i ett nytt 50 ml koniskt rör, centrifugera sedan vid 400 × g i 5 minuter.
- Passera APC: erna till 12-brunnsplattor (10 000-20 000 celler per brunn) som tidigare belagts med 2,5% basalmembranmatris. Inkubera vid 37 °C med 5 %CO2. Byt mediet var 48: e timme tills cellerna når 80% sammanflöde.
OBS: APC kan passeras en gång. Därefter förlorar de sin förmåga att föröka sig och differentiera. Se arbetsflödet för APC-isoleringsprocessen i kompletterande figur S2.
2. Adipocytdifferentiering och induktion av insulinresistens
OBS: Håll cellerna vid 37 °C i 5%CO2 och utför steg som involverar byte av medium och behandlingar med TNF-α och insulin inuti en steril huva.
- Vid 80% sammanflöde, börja differentieringsprocessen; aspirera bort vilket tillväxtmedium som helst och ersätt det med 500 μl differentieringsmedium (tabell 1) innehållande 3,3 nM benmorfogenetiskt protein (BMP4) i varje brunn.
- Efter 48 timmar ersätts mediet med differentieringsmediet (500 μl per brunn) och differentieringscocktailen (tabell 1).
- Ta bort mediet 72 timmar senare och tillsätt 100 nM insulin i 500 μL färskt differentieringsmedium.
OBS: Celler börjar visa ett runt utseende med små lipiddroppar inuti. - Aspirera bort valfritt differentieringsmedium och ersätt det med 500 μL enkelt medium-2% FBS (tabell 1) 48 timmar senare. Inducera insulinresistens med 4 ng/ml TNF-α. Inkludera kontrollbrunnar utan TNF-α behandling.
- Efter 24 timmars inkubation, tillsätt 4 ng/ml TNF-α i enkel medium-0% FBS (tabell 1). Underhålla kontrollbrunnar utan TNF-α behandling.
- Aktivera insulinsignalvägen 24 timmar senare genom att tillsätta 100 nM insulin och inkubera i 15 minuter vid 37 °C i en 5 %CO2-atmosfär . Ta bort mediet och tvätta med 500 μl PBS. Inkludera kontrollbrunnar utan insulinbehandling.
3. Utvärdering av insulinsignalväg med western blot
- Proteinutvinning och kvantifiering
- Tvätta varje cellbrunn med 500 μl PBS och lägg isen för att lysera cellerna i 50 μl Ripa-buffert (tabell 1) innehållande 1 % proteashämmarecocktail tillsatt strax före provisolering. Skrapa hela brunnens yta med en spets och överför lysatet till ett 0,6 ml mikrocentrifugrör (håll på is).
- Inkubera i 1 timme vid 4 °C i en roterande skak, blanda genom virvelfräsning och centrifugera vid 8 000 × g i 15 minuter vid 4 °C och återta supernatanten (förvaras på is).
- Bestäm proteinkoncentrationen med Bradford-testet (späd inte provet för att kvantifiera).
- Ta den volym som krävs motsvarande 40–60 μg och denaturera med 6x Laemmli buffert (tabell 1) genom att inkubera vid 97 °C i 15 minuter under skakning vid 550 rpm. Frys tills användning.
- SDS-polyakrylamidgelelektrofores
- Utför SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) med en 7,5% polyakrylamidgel med 1,5 mm tjocklek. Sätt in gelén i tanken och fyll med löpande buffert (tabell 1).
- Tillsätt 3 μL förfärgat proteinstandard till gelens första brunn och fyll varje prov i efterföljande brunnar.
- Kör gelen vid 80 V i cirka 15 minuter för att säkerställa att provet kommer in i polyakrylamidkoncentratorgelmatrisen. Öka därefter spänningen till 90 V i 2,5 timmar eller tills molekylviktmarkören 37 kDa kan ses i gelens nedre kant.
- Överför proteinerna från gelén till ett nitrocellulosamembran i en halvtorr kammare i 35 minuter vid 25 V. Sänk i förväg ner gelen, membranet och filtren i överföringsbuffert (tabell 1) i några minuter.
- Västra blot
- Tvätta membranet med Tris-buffrad saltlösning (TBS) innehållande 0,1 % Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (tabell 1) efter överföring i 3 minuter med skakning vid 30 rpm.
- Blockera membranet med blockeringslösning (tabell 1) vid 4 °C i 1 h vid konstant rotation.
- Skär membranet i tre delar enligt molekylviktmarkören för att inkubera över natten med olika primära antikroppar (utspädda i blockerande lösning) vid 4 °C i konstant rotation: Fosfo-IRS1 (Tyr608) antikropp (1:1 000), förväntat band vid 180 kDa; Fosfoinsulinreceptor β (Tyr1150/1151) antikropp (1:1 000), förväntat band vid 95 kDa; Fosfo-Akt (Ser473) antikropp (1:1 000), förväntat band vid 60 kDa.
- Tvätta membranen 5x i 5 minuter vardera med TBS-T 0,1%.
- Inkubera membranen med motsvarande peroxidaskopplade sekundära antikropp (utspädd i blockerande lösning) i 2 timmar vid rumstemperatur i konstant rotation: peroxidas affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5,000).
- Tvätta membranen 5x i 5 minuter vardera med TBS-T 0,1%.
- Detektera proteinerna med hjälp av kemiluminiscensdetekteringssystemet. Förbered underlaget enligt tillverkarens instruktioner.
- Placera fläcken i en plastpåse och tillsätt 200 μL kemiluminescerande substrat för att helt täcka membranet. Töm överflödigt substrat och ta bort eventuella luftbubblor.
- Exponera varje fläck i 30-60 s i ett högpresterande bildsystem som är kompatibelt med kemiluminescens.
- Remsa membranen (steg 10-13 i den västra blotsektionen) för att bryta antikropp-antigeninteraktionerna och därmed tillåta nitrocellulosamembran att blottas igen. Återställ membranen och tvätta 3x i 5 minuter vardera med TBS-T 1% vid 50 rpm.
- Inkubera i 7 minuter med 10 ml 0,2 M NaOH vid 50 rpm.
- Tvätta 3x i 5 min vardera med kranvatten vid 50 rpm.
- Tvätta i 10 min med TBS-T 1% vid 50 rpm.
- Upprepa steg 2-9 i västra fläcksektionen för att inkubera membranet med anti-beta tubulin (55 kDa) som en belastningskontroll med 1:1 000 utspädning.
- Utför densitometrisk analys25 för varje protein med hjälp av ImageJ-programvara (https://imagej.nih.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under de senaste åren har den ökade förekomsten av fetma och T2D lett till ett intensivt sökande efter mekanismerna som förmedlar insulinresistens i fettvävnad. Med protokollet som beskrivs här kan APC differentieras till mogna adipocyter för att utvärdera insulinresistens och känslighet. När APC: erna når sammanflödet tar det 10 dagar att slutföra sin differentiering i mogna adipocyter och deras TNF-α-medierade induktion av insulinresistens (figur 1).
APC uppvisar en fibroblastliknande morfologi, kännetecknad av sin plana och långsträckta form och deras vidhäftning till plattan avslutad 48 timmar efter sådd (figur 2A). APC tar 2-5 dagar att nå 80% sammanflöde (beroende på antalet seedade celler), en tidpunkt då differentieringsprocessen startas genom exponering för den differentierande cocktailen (figur 2A). Äldre adipocyter börjar dyka upp under de följande 6-8 dagarna. Differentierade adipocyter kännetecknas av en rund morfologi och den intracellulära ackumuleringen av lipiddroppar. Upp till 80% av cellerna differentieras i slutet av differentieringsprocessen (figur 2B).
Insulinresistens induceras i primära adipocyter genom TNF-α behandling (4 ng / ml) i 48 timmar; Denna koncentration av TNF-α påverkar inte cellviabiliteten (kompletterande figur S3). Därefter aktiveras insulinsignalvägen genom tillsats av 100 nM insulin i 15 minuter, och fosforyleringen av huvudsignalmolekylerna (IR, IRS-1 och AKT) mäts med western blot. Insulin stimulerar fosforyleringen av dessa tre molekyler (figur 3) jämfört med kontroll, obehandlade differentierade adipocyter. TNF-α minskar den insulininducerade fosforyleringen av IR (30%), IRS-1 (20%) och AKT (45%) (figur 3). Insulinresistenta celler visar mindre aktivering av insulinsignalvägen jämfört med insulinkänsliga celler. Dessutom minskar TNF-α-behandling mRNA-uttrycket av kända insulinkänslighetsmarkörer: Insr, Irs2, Glut4 och Adipoq (kompletterande figur S4). Dessa fynd bekräftar att TNF-α minskar effekten av insulin i primära adipocyter och därmed inducerar insulinresistens.
Figur 1: Schematisk tidslinje som representerar processen för differentiering av adipocytprekursorceller och induktion av insulinresistens. APC isoleras från subkutan fettvävnad med användning av kollagenasbehandling och magnetisk cellseparationsteknik. Sedan genomgår de en 7 dagars differentieringsprocess för att erhålla primära adipocyter. Därefter induceras insulinresistens med TNF-α under 48 timmar, de första 24 timmarna i medium innehållande 2% FBS och nästa 24 timmar med serumfritt medium för att förhindra aktivering av insulinsignalvägen. Signalkaskaden aktiveras med insulin och protein extraheras för western blot-analys 10 dagar efter påbörjad differentieringsprocessen för att utvärdera fosforylering/aktivering av IR, IRS-1 och AKT. Förkortningar: APC = adipocytprekursorceller; BMP4 = Benmorfogenetiskt protein; IBMX = 3-isobutyl-1-metylxantin; TNF-α = tumörnekrosfaktor-α; FBS = fetalt bovint serum; IR = insulinreceptor; IRS = insulinreceptorsubstrat; AKT = proteinkinas B; Tx = behandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologi hos adipocytprekursorceller och mogna adipocyter . (A) Subkutana APC vid 80% sammanflöde före inducering av differentiering i odlingsplattor med 12 brunnar. (B) Subkutana primära adipocyter efter 7 dagars inducerande differentiering i odlingsplattor med 12 brunnar. Bilder togs med 10x förstoring. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: APC = adipocytprekursorceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Insulinresistens inducerad av TNF-α i subkutana primära adipocyter påvisad genom minskad insulininducerad fosforylering av IR, IRS-1 och AKT. Subkutana adipocyter behandlades med TNF-α (4 ng/ml) under 48 timmar och serumhungrade under de sista 24 timmarna. Efter stimulering med insulin (100 nM) i 15 minuter laddades 40 μg totalt protein på 7,5% geler och utsattes för SDS-PAGE, överfördes till nitrocellulosamembran och blockerades i 4% fettfri mjölk i TBS-T 0,1%. Membranet undersöktes med antifosforylerad IR (pIR), antifosforylerad IRS-1 (pIRS-1) och antifosforylerad AKT (pAKT), samt med en antikanin HRP sekundär antikropp. Signalen visualiserades med kemiluminiscensdetektering och anti-β tubulin användes som lastkontroll. (A) representativa fläckar och (B) kvantifiering från tre oberoende experiment. Data är medelvärde ± SEM; *, p < .05 kontra kontroll. Förkortningar: TNF-α = tumörnekrosfaktor-α; IR = insulinreceptor; IRS = insulinreceptorsubstrat; pX = fosforylerad form av X; b-tub = beta-tubulin; HRP = pepparrotsperoxidas; Ctrl = kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Anti-Fc-lösning | renad råtta anti-mus CD16 / CD32 utspädd i PBS-2% FBS [1:150] | |||
| TBS-T 0,1% | 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 | |||
| Blockering lösning | 4% fettfri torrmjölk utspädd i TBS-T 0,1% | |||
| Tillväxtmedium | 60% DMEM låg glukos, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM dexametason, 0,1 mM L-askorbinsyra 2-fosfat, 1x insulin, transferrin, natrium, selenit (ITS) flytande media tillägg, 1x linolsyra-albumin från BSA, 10% FBS, 10 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF), 10 ng / ml leukemihämmande faktor (LIF), 10 ng / ml trombocyt-härledd tillväxtfaktor BB (PDGF-BB), 5 ng/ml fibroblasttillväxtfaktor-basisk (bFGF) och 50 μg/ml normocin | |||
| Differentieringsmedium | 60% DMEM låg glukos, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin, 1 nM dexametason, 0,1 mM L-askorbinsyra 2-fosfat, 1x ITS flytande media tillägg, 1x linolsyra-albumin från BSA och 2% FBS | |||
| Differentiering cocktail | 0,5 μM 3-isobutyl-1-metylxantin [IBMX], 1 μM dexametason, 10 μM rosiglitazon och 100 nM insulin | |||
| Enkel medium-2% FBS | 60% DMEM låg glukos, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin och 2% FBS | |||
| Enkel medium–0% FBS | 60% DMEM låg glukos, 40% MCDB 201 medium, 1x penicillin-streptomycin | |||
| Ripa-buffert | 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% oktylfenoxipoly(etylenoxi)etanol, 1 mMNa3VO4,48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4P2O7och 0,26 M sackaros | |||
| 6x Laemmli buffert | 1,2 g SDS, 6 mg bromfenolblått, 4,7 ml glycerol, 1,2 ml Tris-bas 0,5 M pH 6,8, 845 μL 2- merkaptoetanol och 2,1 mlH2O | |||
| Löpande buffert | 25 mM Tris bas, 192 mM glycin, 1% SDS | |||
| Överför buffert | 25 mM Tris-bas, 192 mM glycin, 20% metanol | |||
Tabell 1: Lösningar som används i detta protokoll.
Kompletterande figur S1: Subkutan fettvävnad spjälkad med kollagenas. När fettvävnaden har avlägsnats skärs den i små bitar med sax för att starta matsmältningsprocessen (A), sedan inkuberas den i 30 minuter med kollagenas typ 1 vid 37 °C, 150 rpm (B). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Schema för isoleringsprocessen för adipocytprekursorceller. Dissekera den inguinala subkutana fettvävnaden och smälta proverna med kollagenas. Eliminera mogna adipocyter genom centrifugering och tvätta pelleten för att avlägsna överflödigt fett. Lysera de röda blodkropparna och blockera för att minska ospecifik bindning. Märk endotelcellerna och makrofagerna med antikroppar kopplade till magnetiska partiklar. Utför magnetisk separation av celler med hjälp av den negativa separationsstrategin med en magnetisk cellseparator. Frö APC (omärkta celler) i plattor täckta med basalmembranmatris. Byt medium var 48: e timme tills cellerna når 80% sammanflöde. Förkortningar: APC = adipocytprekursorceller; BSA = bovint serumalbumin, FBS = fetalt bovint serum. Skapad med Biorender.com. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Behandling med TNF-α för att inducera insulinresistens förändrar inte adipocyternas livskraft. Viabiliteten hos mogna adipocyter mättes med MTT-testet efter behandling med 4 ng/ml TNF-α under 48 timmar. Data är medelvärde ± SEM. Förkortningar: TNF-α = tumörnekrosfaktor-α; Ctrl = kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: TNF-α behandling i adipocyter minskar uttrycket av insulinkänslighetsmarkörer. MRNA-uttrycket av Insr, Irs, Glut4 och Adipoq mättes med realtids-PCR efter behandling med 4 ng/ml TNF-α i 48 timmar. Data är medelvärde ± SEM; *, p < .05 kontra kontroll. Förkortningar: TNF-α = tumörnekrosfaktor-α; Ctrl = kontroll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument ger en metod för att studera insulinresistens som använder primära adipocyter i odling behandlad med TNF-α. Denna modell har fördelen att primära adipocyter kan odlas under definierade förhållanden under långa tidsperioder med en tät kontroll av cellulära miljöfaktorer26. Analystiden är 15-20 dagar, även om variationer i andelen differentierade adipocyter kan förekomma mellan experiment. Primära adipocyter har fördelar jämfört med cellinjer eftersom de inte kontinuerligt har expanderats i odling och närmare fångar mångfalden i vävnaden från vilken de härrör27. Dessutom tillåter primära adipocyter att studera givare under olika fysiopatologiska sammanhang, såsom mager kontra fet, man kontra kvinna, ung kontra gammal och celler från olika fettdepåer. En annan fördel med denna metod är att cellinjer från CRE och knockoutmöss kan genereras efter APC-isolering.
Ett möjligt problem under APCs isolering och differentiering är att dessa celler kan förlora förmågan att differentiera, vilket sannolikt skulle inträffa när 80% sammanflöde överskrids i början av differentieringsprocessen. Mediet bör också ändras mycket försiktigt, särskilt efter lipidackumulering, eftersom differentierade adipocyter lätt lossnar från odlingsskålen. Dessutom måste varje parti kollagenas testas för matsmältningseffektivitet, cellutbyte och cytotoxicitet26. Tekniker har utvecklats för att identifiera och isolera APC från den stromovaskulära fraktionen av vit fettvävnad, med hjälp av negativa markörer såsom CD31 och CD45, samt positiva stamcellspopulationsmarkörer såsom CD34 och Sca128,29. I detta protokoll utför vi endast en negativ separation, vilket eliminerar endotelceller och makrofager från den stromovaskulära fraktionen, vilket undviker förlust av preadipocyter i den positiva separationen.
Även om primära kulturer tillåter studier av givarvariabilitet och komplexitet27,30, introducerar den experimentella modellen begränsningar. Till exempel kommer adipocyter isolerade från gamla djur att ha en lägre differentieringskapacitet och en högre lipotoxicitet jämfört med de från unga djur31,32. Protokollet kan också anpassas för att använda olika cellseparationstekniker. Om en automatisk magnetisk cellseparator inte är tillgänglig kan manuell separation av cellerna uppnås med kolonner eller FACS-sortering. Den metod som beskrivs här för APC-isolering med hjälp av en magnetisk cellseparator är en anpassad och förenklad version av FACS-sorteringsprotokollet som beskrivs av Macotela et al.28.
Flera inflammatoriska cytokiner har använts för att inducera insulinresistens i fettceller, inklusive TNF-α, IL-1β och IL-6 18,33,34,35,36. Odlade 3T3-L1-adipocyter exponerade för TNF-α bli insulinresistenta inom flera dagar, vilket bedöms av insulinets minskade förmåga att stimulera glukosupptag37. Dessa resultat visar att TNF-α minskar insulininducerad fosforylering av IR, IRS-1 och AKT21,23, mätt med western blot-detektion av totalt protein extraherat från primära adipocyter. Proteaser och fosfataser som frigörs under celllys kan dock påverka västerländsk blotdetektering. Proteinernas aktiva tillstånd bör bevaras genom tillsats av proteas och fosfatashämmare till lysbufferten och efter proteinkvantifiering genom att provet blandas med Laemmli buffert. Sammanfattningsvis ger denna metod ett användbart verktyg för att studera mekanismerna som förmedlar insulinresistens i adipocyter differentierade från mus APC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla och María Antonieta Carbajo för deras tekniska hjälp, och Jessica Gonzalez Norris för kritisk redigering av manuskriptet. Detta protokoll stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (till Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B.
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
- Petersen, M. C., Shulm, G. I.
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
- Cinti, S.
- Kahn, B. B., Flier, J. S.
- Klemm, D. J., et al.
- Wilcox, G.
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
