이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
인슐린 저항성은 표적 세포에 대한 인슐린의 감소된 효과로, 일반적으로 인슐린 수용체 신호 전달 감소에서 파생됩니다. 인슐린 저항성은 전 세계적으로 유병률이 높은 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 비만 유래 질병의 발병에 기여합니다. 따라서 인슐린 저항성의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 생체 내 및 시험관 내에서 인슐린 저항성을 연구하기 위해 여러 모델이 사용되었습니다. 일차 지방 세포는 인슐린 저항성의 메커니즘을 연구하고 이 상태에 대항하는 분자와 인슐린 감작 약물의 분자 표적을 식별하는 매력적인 옵션을 나타냅니다. 여기에서 우리는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 처리된 배양에서 일차 지방 세포를 사용하여 인슐린 저항성 모델을 확립했습니다.
자성 세포 분리 기술에 의해 콜라게나제로 분해된 마우스 피하 지방 조직에서 분리된 지방 세포 전구 세포(APC)는 1차 지방 세포로 분화됩니다. 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달 캐스케이드 구성원의 티로신 인산화/활성화를 감소시키는 전염증성 사이토카인인 TNF-α로 처리하여 유도됩니다. 인슐린 수용체 (IR), 인슐린 수용체 기질 (IRS-1) 및 단백질 키나아제 B (AKT)의 감소된 인산화는 웨스턴 블롯에 의해 정량화된다. 이 방법은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다.
서론
인슐린은 췌장 섬 β 세포에서 생성되는 단백 동화 호르몬이며 포도당과 지질 대사의 핵심 조절자입니다. 인슐린은 많은 기능 중에서 포도당 흡수, 글리코겐 합성, 포도당 생성, 단백질 합성, 지방 생성 및 지방 분해를 조절합니다1. 인슐린과 인슐린의 수용체(IR) 상호작용 후의 초기 분자 신호는IR2의 내인성 티로신 단백질 키나아제 활성의 활성화이며, 그 결과 자가인산화3 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates, IRS)로 알려진 단백질 계열의 활성화가 일어나며, 이는 어댑터 단백질에 결합하여 단백질 키나아제4의 캐스케이드를 활성화시킨다 . 인슐린은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)-단백질 키나아제 B(AKT)와 라스-미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 두 가지 주요 신호 전달 경로를 활성화합니다. 전자는 연료 항상성의 조절을 포함하여 다양한 생리적 기능에 관여하는 수많은 다운스트림 이펙터의 활성화를 위한 주요 분기점 또는 노드(4,5)를 구성하는 반면, 후자는 세포 성장 및....
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프로토콜
모든 설치류 실험은 UNAM 신경 생물학 연구소의 생명 윤리위원회 (프로토콜 번호 075)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 지방세포 전구세포 분리
- 8-10주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 안락사시킵니다(예: CO2 흡입 및 후속 자궁경부 탈구에 의해)(분리당 4마리). 마우스를 70% 에탄올로 문질러 소독하고 희생 직후 지방 조직을 얻습니다.
참고: 설치류를 안락사시킨 후 즉시 지방 조직을 분리하고 멸균 층류 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암주기 아래로 유지됩니다. - 각 마우스에서 사타구니 피하 지방 조직을 해부합니다. 근육, 피부 또는 기타 조직의 제거를 피하고 지방 조직만 제거하고 얼음 위에 15mL의 유형 1 콜라게나제 용액(1.5mg/mL)이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고포도당-1% 소 혈청 알부민(BSA)에 유형 1 콜라게나제를 용해하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
- 멸균 수술용 가위로 지방 조직을 작은 조각으로 절단하고 37°C에서 30분 동안 안와 진탕기(....
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결과
지난 몇 년 동안 비만과 T2D의 유병률이 증가함에 따라 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘에 대한 집중적인 연구가 촉발되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 APC를 성숙한 지방 세포로 분화하여 인슐린 저항성과 민감도를 평가할 수 있습니다. APC가 합류점에 도달하면 성숙한 지방세포로의 분화와 TNF α 매개 인슐린 저항성 유도를 완료하는 데 10일이 걸립니다(그림 1).
APC는 평평하고 길쭉한 모양과 파종 후 48시간 후에 완료된 플레이트에 대한 접착을 특징으로 하는 섬유아세포와 유사한 형태를 보여줍니다(그림 2A). APC는 80% 합류에 도달하는 데 2-5일이 걸리며(시드된 세포 수에 따라 다름), 분화 칵테일에 노출되어 분화 과정이 시작됩니다(그림 2A). 성숙한 지방 세포는 다음 6-8 일.......
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토론
본 논문은 TNF-α로 처리된 배양물에서 일차 지방세포를 이용하는 인슐린 저항성을 연구하는 방법을 제공한다. 이 모델은 세포 환경 인자의 엄격한 제어와 함께 일차 지방 세포가 장기간 동안 정의된 조건 하에서 배양될 수 있다는 장점이 있다26. 분석 기간은 15-20 일이지만 분화 된 지방 세포의 비율에 변화가 실험 사이에 발생할 수 있습니다. 일차 지방세포는 배양에서 지속적으로 확장되지 않았고 세포주가 유래된 조직의 다양성을 더 밀접하게 포착하기 때문에 세포주에 비해 이점이 있다27. 또한, 1차 지방세포는 마른 대 비만, 남성 대 여성, 젊은 대 노인, 다른 지방 저장소의 세포와 같은 다양한 생리병리학적 맥락에서 기증자를 연구할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 APC 분리 후 CRE 및 녹아웃 마우스의 세포주를 생성할 수 있다는 것입니다.
APC 분리 및 분화 중 발생할 수 있는 한 .......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
기술 지원을 아끼지 않은 다니엘 몬드라곤, 안토니오 프라도, 페르난도 로페스-바레라, 마르틴 가르시아-세르빈, 알레한드라 카스티야, 마리아 안토니에타 카르바호, 그리고 원고를 비판적으로 편집해 준 제시카 곤잘레스 노리스에게 감사드립니다. 이 프로토콜은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (YM에게)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>1. 분리 마우스 지방 세포 전구체 세포 | |||
| ACK 용해 완충액 | LONZA | 10-548E | |
| 안티-비오틴 마이크로비즈 | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| 기저막 매트릭스(마트리겔) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | 성장 인자 |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 단클론 항체 (30-F11) - 비오틴 | eBioscience | 13-0451-85 | |
| 콜라겐 분해 효소, 유형 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| 덱사메타손 | 시그마 | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM 저당 | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | 성장 인자 |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS 믹스 | Sigma | I3146 | |
| L-아스코르브산 2-인산 | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | 성장 인자 |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | 성장 인자 |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| 사전 분리 필터 (70 µ m) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| 정제된 쥐 안티-마우스 CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 트립신-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| <강한>2. 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도 | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | 분화 칵테일 |
| BMP4 | R& D Systems | 5020-BP-010 | 분화 칵테일 |
| 덱사메타손 | 시그마 | D1756 | 분화 칵테일 |
| 인슐린 | 시그마 | I9278 | |
| 로시글리타존 | 케이맨 | 71742 | 분화 칵테일 |
| TNF&알파; | R& D 시스템 | 210-TA-005 | |
| <강한>3. 웨스턴 블롯 | |||
| 안티 베타 튜불린 항체 | Abcam | ab6046 | |
| 브로모페놀 블루 | BioRad | 161-0404 | Laemmli 완충액 |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA 완충액 |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA 완충액 |
| FluorChem E 시스템 | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli 완충액 |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | 시그마 | 77F-0379 | RIPA 버퍼 |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA 버퍼 |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA 버퍼 |
| 니트로셀룰로오스 막 | BioRad | 1620112 | |
| 무지방 분유 | BioRad | 1706404 | 차단 용액 |
| 사전 염색 단백질 표준 | BioRad | 1610395 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure 당나귀 안티-래빗 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| 포스포- 인슐린 수용체 및 베타; | 세포 신호 | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) 항체 | 세포 신호 | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) 항체 | Millipore | 9432 | |
| 당류 | JT Baker | 407205 | RIPA 완충액 |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running 및 laemmli 완충기 |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, Transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | 시그마 | P1379 | TBS-T |
참고문헌
- Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. ....
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재인쇄 및 허가
