Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Summary

Ici, nous présentons des méthodes détaillées pour la préparation et l’évaluation du vaccin tumoral nanoémulsion nasale auto-assemblé in vitro et in vivo.

Abstract

Les peptides d’épitopes ont attiré l’attention dans le domaine des vaccins contre les tumeurs en raison de leur sécurité, de leur haute spécificité et de leur production pratique; en particulier, certains épitopes restreints par le CMH I peuvent induire une activité cytotoxique efficace des lymphocytes T pour éliminer les cellules tumorales. De plus, l’administration nasale est une technique d’administration efficace et sûre pour les vaccins contre les tumeurs en raison de sa commodité et de l’amélioration de l’observance du patient. Cependant, les peptides épitopiques ne conviennent pas à l’administration nasale en raison de leur faible immunogénicité et de leur manque d’efficacité d’administration. Les nanoémulsions (NE) sont des systèmes thermodynamiquement stables qui peuvent être chargés d’antigènes et livrés directement à la surface de la muqueuse nasale. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) est le pentapeptide de base de la laminine, un peptide liant l’intégrine exprimé par les cellules épithéliales respiratoires humaines. Dans cette étude, un vaccin tumoral intranasal auto-assemblé à peptide NE contenant le peptide synthétique IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) a été préparé par une méthode d’émulsification à basse énergie. La combinaison d’IKVAV et d’OVA_257-264 peut améliorer l’absorption de l’antigène par les cellules épithéliales de la muqueuse nasale. Ici, nous établissons un protocole pour étudier les caractéristiques physico-chimiques par microscopie électronique à transmission (MET), microscopie à force atomique (AFM) et diffusion dynamique de la lumière (DLS); stabilité en présence de protéine mucine; toxicité en examinant la viabilité cellulaire des cellules BEAS-2B et des tissus nasaux et pulmonaires des souris C57BL/6; absorption cellulaire par microscopie confocale à balayage laser (CLSM); profils de libération par imagerie de petits animaux in vivo; et l’effet protecteur et thérapeutique du vaccin en utilisant un modèle porteur de tumeur E.G7. Nous prévoyons que le protocole fournira des indices techniques et théoriques pour le développement futur de nouveaux vaccins muqueux peptidiques à épitopes de lymphocytes T.

Introduction

En tant que l’une des innovations les plus critiques en matière de santé publique, les vaccins jouent un rôle clé dans la lutte contre le fardeau mondial des maladies humaines¹. Par exemple, à l’heure actuelle, plus de 120 vaccins candidats contre les maladies COVID-19 sont testés, dont certains ont été approuvés dans de nombreux pays². Des rapports récents indiquent que les vaccins anticancéreux ont effectivement amélioré les progrès des traitements cliniques contre le cancer parce qu’ils dirigent le système immunitaire des patients cancéreux à reconnaître les antigènes comme étrangers au corps³. De plus, plusieurs épitopes de lymphocytes T situés à l’intérieur ou à l’extérieur des cellules tumorales peuvent être utilisés pour concevoir des vaccins peptidiques, qui ont montré des avantages dans le traitement des cancers métastatiques en raison de l’absence de toxicité significative associée à la radiothérapie et à la chimiothérapie ^4,5. Depuis le milieu des années 1990, les essais précliniques et cliniques pour le traitement des tumeurs ont été menés principalement à l’aide de vaccins peptidiques antigéniques, mais peu de vaccins présentent un effet thérapeutique adéquat sur les patients cancéreux⁶. En outre, les vaccins anticancéreux avec des épitopes peptidiques ont une faible immunogénicité et une efficacité d’administration insuffisante, ce qui peut être dû à la dégradation rapide des peptides extracellulaires qui diffusent rapidement à partir du site d’administration, ce qui conduit à une absorption insuffisante de l’antigène par les cellules immunitaires⁷. Par conséquent, il est nécessaire de surmonter ces obstacles avec la technologie d’administration des vaccins.

OVA 257-264, l’épitope_257-264 liant le CMH de classe I exprimé en protéine de fusion, est un épitope^{modèle 8} fréquemment utilisé. En outre, OVA_257-264 est crucial pour la réponse immunitaire adaptative contre les tumeurs, qui dépend de la réponse cytotoxique des lymphocytes T (CTL). Il est médié par des cellules T CD8⁺ spécifiques de l’antigène dans la tumeur, qui sont induites par le peptide OVA_257-264 . Elle se caractérise par une insuffisance de granzyme B, qui est libérée par les lymphocytes T cytotoxiques, conduisant à l’apoptose des cellules cibles⁸. Cependant, l’administration libre du peptide OVA_257-264 peut induire peu d’activité CTL parce que l’absorption de ces antigènes se produit dans des cellules non spécifiques plutôt que dans des cellules présentatrices d’antigènes (APC). L’insuffisance d’une stimulation immunitaire appropriée entraîne une activité CTL⁵. Par conséquent, l’induction d’une activité CTL efficace exige des progrès considérables.

En raison de la barrière fournie par les cellules épithéliales et de la sécrétion continue de mucus, les antigènes vaccinaux sont rapidement éliminés de la muqueuse nasale ^9,10. La mise au point d’un vecteur vaccinal efficace capable de traverser le tissu muqueux est cruciale car les cellules présentatrices de l’antigène sont situées sous l’épithélium⁹ de la muqueuse. L’injection intranasale de vaccins induit théoriquement une immunité muqueuse pour lutter contre l’infection des muqueuses¹¹. En outre, l’administration nasale est une méthode d’administration efficace et sûre pour les vaccins en raison de sa commodité, de l’évitement de l’administration intestinale et de l’amélioration de l’observance du patient⁷. Par conséquent, l’administration nasale est un bon moyen d’administration pour le nouveau nanovaccin à épitopes peptidiques.

Plusieurs biomatériaux synthétiques ont été conçus pour combiner les épitopes des interactions cellule-tissu et cellule-cellule. Certaines protéines bioactives, comme l’Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), ont été introduites dans le cadre de la structure de l’hydrogel pour conférer une bioactivité¹². Ce peptide contribue probablement à l’attachement, à la migration et à la croissance^{des cellules 13} et se lie aux intégrines α 3β1 et α_6β1 pour interagir avec différents types de cellules cancéreuses. IKVAV est un peptide d’adhésion cellulaire dérivé de la protéine de membrane basale de laminine α_{chaîne 1} qui était à l’origine utilisé pour modéliser le microenvironnement neuronal et provoquer la différenciation neuronale¹⁴. Par conséquent, il est important de trouver un véhicule d’administration efficace pour ce nouveau vaccin pour lutter contre la maladie.

Des systèmes d’émulsion récemment signalés, tels que W805EC et MF59, ont également été composés pour l’administration dans les cavités nasales d’un vaccin antigrippal inactivé ou d’antigène de surface recombinant de l’hépatite B et illustrés pour déclencher à la fois l’immunité muqueuse et systémique¹⁵. Les nanoémulsions (NE) présentent les avantages d’une administration facile et d’une coformation pratique avec des adjuvants efficaces par rapport aux systèmes d’administration de particules^{muqueuses 16}. Il a été rapporté que les vaccins à nanoémulsion modifient le phénotype allergique d’une manière durable, différente de la désensibilisation traditionnelle, ce qui entraîne des effets suppressifs à long terme¹⁷. D’autres ont rapporté que les nanoémulsions combinées à des antigènes immunodominants spécifiques du Mtb pourraient induire de puissantes réponses des cellules muqueuses et conférer une protection significative¹⁸. Par conséquent, un nouveau nanovaccin intranasal auto-assemblé avec le peptide synthétique IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, le peptide constitué d’IKVAV lié à OVA_257-264) a été conçu. Il est important d’évaluer systématiquement ce nouveau nanovaccin.

L’objectif de ce protocole est d’évaluer systématiquement les caractéristiques physico-chimiques, la toxicité et la stabilité du nanovaccin, de détecter si l’absorption d’antigènes et les effets protecteurs et thérapeutiques sont renforcés à l’aide de moyens techniques, et de préciser les principaux contenus expérimentaux. Dans cette étude, nous avons établi une série de protocoles pour étudier les caractéristiques physico-chimiques et la stabilité, déterminer l’ampleur de la toxicité de l’I-OVA NE en cellules BEAS-2B par CCK-8 et observer la capacité de présentation de l’antigène des cellules BEAS-2B au vaccin à l’aide de la microscopie confocale, évaluer les profils de libération de ce nouveau nanovaccin in vivo et in vitro, et détecter l’effet protecteur et thérapeutique de ce vaccin en utilisant un modèle murin porteur de tumeur E.G7-OVA.

Protocol

Les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices sur les animaux de laboratoire pour l’examen éthique du bien-être animal (GB / T 35892-2018) et ont été approuvées par le Comité du bien-être et de l’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire. Les souris ont été euthanasiées par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %. 1. Préparation de l’I-OVA NE</…

Representative Results

Conformément au protocole, nous avons terminé la préparation et l’évaluation expérimentale in vitro et in vivo de l’administration du nanovaccin nasal contre la tumeur. La MET, l’AFM et le DLS sont des moyens efficaces pour évaluer les caractéristiques de base du potentiel zêta de surface et la taille des particules du nanovaccin (Figure 1). Les cellules épithéliales BEAS-2B sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro d…

Discussion

Les nanovaccins fonctionnalisés avec des membranes immunocytaires présentent de grands avantages dans la thérapie ciblée sur la maladie, et les effets secondaires sont minimisés par des propriétés telles que le tropisme tumoral unique, l’identification de cibles spécifiques, une circulation prolongée, des interactions intercellulaires améliorées et une faible toxicité systémique. Ils peuvent également être facilement intégrés à d’autres modules de traitement pour traiter les cancers en coopération<…

Materials

96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800