Summary

Nazal Kendi Kendine Toplanan Nanoemülsiyon Tümör Aşısının İn Vitro ve İn Vivo Hazırlanması, Özellikleri, Toksisitesi ve Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Burada, nazal kendiliğinden monte edilmiş nanoemülsiyon tümör aşısının in vitro ve in vivo olarak hazırlanması ve değerlendirilmesi için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Abstract

Epitop peptitler, güvenlikleri, yüksek özgüllükleri ve uygun üretimleri nedeniyle tümör aşıları alanında yaygın ilgi görmüştür; Özellikle, bazı MHC I kısıtlı epitoplar, tümör hücrelerini temizlemek için etkili sitotoksik T lenfosit aktivitesini indükleyebilir. Ek olarak, nazal uygulama, kolaylığı ve iyileştirilmiş hasta uyumu nedeniyle tümör aşıları için etkili ve güvenli bir uygulama tekniğidir. Bununla birlikte, epitop peptitleri, zayıf immünojeniteleri ve doğum etkinliği eksikliği nedeniyle nazal doğum için uygun değildir. Nanoemülsiyonlar (NE’ler), antijenlerle yüklenebilen ve doğrudan burun mukozal yüzeyine verilebilen termodinamik olarak stabil sistemlerdir. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), insan solunum epitel hücreleri tarafından eksprese edilen integrin bağlayıcı bir peptid olan laminin’in çekirdek pentapeptididir. Bu çalışmada, sentetik peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA )’yi içeren intranazal kendinden montajlı epitop peptid NE tümör aşısı düşük enerjili emülsifikasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. IKVAV ve OVA257-264 kombinasyonu, nazal mukozal epitel hücreleri tarafından antijen alımını artırabilir. Burada, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve dinamik ışık saçılması (DLS) ile fizikokimyasal özellikleri incelemek için bir protokol oluşturuyoruz; müsin proteini varlığında stabilite; BEAS-2B hücrelerinin hücre canlılığını ve C57BL / 6 farelerinin burun ve akciğer dokularını inceleyerek toksisite; konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile hücresel alım; küçük hayvanları in vivo olarak görüntüleyerek profilleri serbest bırakmak; ve bir E.G7 tümör taşıyan model kullanılarak aşının koruyucu ve terapötik etkisi. Protokolün, yeni T hücresi epitop peptid mukozal aşılarının gelecekteki gelişimi için teknik ve teorik ipuçları sağlayacağını öngörüyoruz.

Introduction

En kritik halk sağlığı yeniliklerinden biri olan aşılar, insan hastalıklarının küresel yüküyle mücadelede kilit bir rol oynamaktadır1. Örneğin, şu anda, COVID-19 hastalıkları için 120’den fazla aday aşı test edilmektedir ve bunlardan bazıları birçok ülkede onaylanmıştır2. Son raporlar, kanser aşılarının klinik kanser tedavilerinin ilerlemesini etkili bir şekilde iyileştirdiğini, çünkü kanser hastalarının bağışıklık sistemini antijenleri vücuda yabancı olarak tanımaya yönlendirdiğini belirtmektedir3. Ayrıca, tümör hücrelerinin içinde veya dışında bulunan çoklu T hücre epitopları, radyoterapi ve kemoterapi ile ilişkili önemli toksisitenin bulunmaması nedeniyle metastatik kanserlerin tedavisinde avantajlar gösteren peptid aşılarını tasarlamak için kullanılabilir 4,5. 1990’ların ortalarından bu yana, tümör tedavisi için klinik öncesi ve klinik çalışmalar esas olarak antijen peptid aşıları kullanılarak yürütülmüştür, ancak az sayıda aşı kanser hastaları üzerinde yeterli bir terapötik etki göstermektedir6. Ayrıca, peptit epitoplarına sahip kanser aşıları, zayıf immünojeniteye ve yetersiz dağıtım etkinliğine sahiptir, bu da uygulama bölgesinden hızla yayılan hücre dışı peptitlerin hızlı bir şekilde bozulmasından kaynaklanabilir ve bu da bağışıklık hücreleri tarafından yetersiz antijen alımına yol açabilir7. Dolayısıyla aşı dağıtım teknolojisi ile bu engelleri aşmak gerekmektedir.

Bir füzyon proteini olarak ifade edilen MHC sınıf I-bağlayıcı 257-264 epitopu olan OVA257-264, sıklıkla kullanılan bir model epitop8’dir. Ek olarak, OVA257-264, sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtına bağlı olan tümörlere karşı adaptif immün yanıt için çok önemlidir. Tümörde OVA257-264 peptidi tarafından indüklenen antijene özgü CD8 + T hücreleri aracılık eder. Sitotoksik T hücreleri tarafından salınan ve hedef hücrelerin apoptozuna yol açan yetersiz granzim B ile karakterizedir8. Bununla birlikte, serbest OVA257-264 peptid uygulaması, çok az CTL aktivitesine neden olabilir, çünkü bu antijenlerin alımı, antijen sunan hücrelerden (APC’ler) ziyade spesifik olmayan hücrelerde meydana gelir. Uygun immün stimülasyon eksikliği CTL aktivitesi5 ile sonuçlanır. Bu nedenle, etkili CTL aktivitesinin indüksiyonu önemli ölçüde ilerleme gerektirir.

Epitel hücrelerinin sağladığı bariyer ve sürekli mukus salgılanması nedeniyle, aşı antijenleri burun mukozasından hızla çıkarılır 9,10. Mukozal dokudan geçebilen etkili bir aşı vektörü geliştirmek çok önemlidir, çünkü antijen sunan hücreler mukozal epitel9’un altında bulunur. Aşıların intranazal enjeksiyonu teorik olarak mukozal enfeksiyonla savaşmak için mukozal bağışıklığı indükler11. Ek olarak, burun doğumu, kolaylığı, bağırsak uygulamasından kaçınması ve hasta uyumunun artması nedeniyle aşılar için etkili ve güvenli bir uygulama yöntemidir7. Bu nedenle, nazal doğum, yeni peptid epitop nanoaşısı için iyi bir uygulama aracıdır.

Hücre-doku ve hücre-hücre etkileşimlerinin epitoplarını birleştirmek için çeşitli sentetik biyomalzemeler geliştirilmiştir. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) gibi bazı biyoaktif proteinler, biyoaktivite12’yi sağlamak için hidrojelin yapısının bir parçası olarak tanıtılmıştır. Bu peptit muhtemelen hücre bağlanmasına, göçüne ve büyümesine katkıda bulunur13 ve farklı kanser hücresi tipleriyle etkileşime girmek için 3β1 ve α6β1 α integrinleri bağlar. IKVAV, başlangıçta nöral mikroçevreyi modellemek ve nöronal farklılaşmaya neden olmak için kullanılanlaminin bazal membran proteini α 1 zincirinden türetilen bir hücre yapışma peptididir14. Bu nedenle, bu yeni aşı için etkili bir dağıtım aracı bulmak hastalık kontrolü için önemlidir.

Son zamanlarda bildirilen W805EC ve MF59 gibi emülsiyon sistemleri, inaktive influenza aşısı veya rekombinant hepatit B yüzey antijeninin burun boşluğuna verilmesi için birleştirilmiştir ve hem mukozal hem de sistemik bağışıklığı tetiklediği gösterilmiştir15. Nanoemülsiyonlar (NE’ler), partikül mukozal dağıtım sistemlerine kıyasla etkili adjuvanlarla kolay uygulama ve uygun ko-oluşum avantajlarına sahiptir16. Nanoemülsiyon aşılarının, alerjik fenotipi, geleneksel duyarsızlaştırmadan farklı olarak sürekli bir şekilde değiştirdiği ve bunun da uzun süreli baskılayıcı etkilere neden olduğu bildirilmiştir17. Diğerleri, Mtb’ye özgü immünodominant antijenlerle kombine edilen nanoemülsiyonların güçlü mukozal hücre yanıtlarını indükleyebileceğini ve önemli koruma sağlayabileceğini bildirmiştir18. Bu nedenle, sentetik peptit IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, OVA 257-264’e bağlı IKVAV’dan oluşan peptit) ile yeni bir burun içi kendiliğinden monte edilmiş nanoaşı tasarlanmıştır. Bu yeni nanoaşıyı sistematik olarak değerlendirmek önemlidir.

Bu protokolün amacı, nanoaşının fizikokimyasal özelliklerini, toksisitesini ve stabilitesini sistematik olarak değerlendirmek, antijen alımının ve koruyucu ve terapötik etkilerin teknik araçlar kullanılarak arttırılıp arttırılmadığını tespit etmek ve ana deneysel içerikler üzerinde durmaktır. Bu çalışmada, fizikokimyasal özellikleri ve stabiliteyi incelemek, I-OVA NE’nin CCK-8 ile BEAS-2B hücrelerine toksisitesinin büyüklüğünü belirlemek ve konfokal mikroskopi kullanarak BEAS-2B hücrelerinin aşıya antijen sunma yeteneğini gözlemlemek, bu yeni nanoaşının salınım profillerini in vivo ve in vitro olarak değerlendirmek için bir dizi protokol oluşturdukve bu aşının koruyucu ve terapötik etkisini, bir E.G7-OVA tümör taşıyan fare modeli kullanarak tespit edin.

Protocol

Hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanı – Hayvan refahının etik incelemesi için kılavuz (GB / T 35892-2018) uyarınca yürütülmüş ve Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler, 100 mg / kg% 1 sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile ötenazi yapıldı. 1. I-OVA NE’nin hazırlanması 1 mg monofosforil lipid A’yı (MPLA) 100 μL DMSO ile karıştırın, 5 dakika boyunca…

Representative Results

Protokole göre, burun tümörü nanoaşı dağıtımının hazırlığını ve in vitro ve in vivo deneysel değerlendirmesini tamamladık. TEM, AFM ve DLS, yüzey zeta potansiyelinin temel özelliklerinin ve nanoaşının parçacık boyutunun değerlendirilmesinde etkili araçlardır (Şekil 1). BEAS-2B epitel hücreleri, nazal aşıların in vitro toksisite testi için yararlı bir tarama modelidir (Şekil 2A). H&E ile boyanmış mi…

Discussion

İmmünosit membranlarla fonksiyonelleştirilen nanoaşılar, hastalığa yönelik tedavide büyük avantajlara sahiptir ve benzersiz tümör tropizmi, spesifik hedeflerin belirlenmesi, uzun süreli dolaşım, gelişmiş hücreler arası etkileşimler ve düşük sistemik toksisite gibi özelliklerle yan etkiler en aza indirilmektedir. Ayrıca kanserleri işbirliği içinde tedavi etmek için diğer tedavi modülleriyle kolayca entegre edilebilirler 16,20. İsten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Programı No. 31670938, 32070924, 32000651, Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı Proje Programı’nın No. 2014jcyjA0107 ve No. 2019jcyjA-msxmx0159, Ordu Tıp Üniversitesi Özel projelerinin No. 2020XBK24 ve No. 2020XBK26 ve üniversite öğrencileri için Ulusal İnovasyon ve Girişimcilik Programı’nın No. 202090031021 ve No. 202090031035 tarafından desteklenmiştir.

Materials

96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.
tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.
NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O’Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis – A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M., Singh, D., Condurache-Bota, S. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. , (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O’Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

View Video