Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Summary

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Abstract

Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA_257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.

Introduction

Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen¹. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind². Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen³. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder außerhalb von Tumorzellen befinden, zur Entwicklung von Peptidimpfstoffen verwendet werden, die sich bei der Behandlung von metastasierendem Krebs als vorteilhaft erwiesen haben, da sie nicht die signifikante Toxizität aufweisen, die mit Strahlen- und Chemotherapie verbunden ist ^4,5. Seit Mitte der 1990er Jahre werden präklinische und klinische Studien zur Tumorbehandlung hauptsächlich mit Antigenpeptid-Impfstoffen durchgeführt, aber nur wenige Impfstoffe zeigen eine ausreichende therapeutische Wirkung bei Krebspatienten⁶. Darüber hinaus weisen Krebsimpfstoffe mit Peptidepitopen eine schlechte Immunogenität und eine unzureichende Verabreichungseffizienz auf, was auf den schnellen Abbau extrazellulärer Peptide zurückzuführen sein kann, die schnell von der Verabreichungsstelle diffundieren, was zu einer unzureichenden Antigenaufnahme durch Immunzellen führt⁷. Daher ist es notwendig, diese Hindernisse mit Technologie zur Verabreichung von Impfstoffen zu überwinden.

OVA 257-264, das MHC-Klasse-I-bindende_{257-264-Epitop}, das als Fusionsprotein exprimiert wird, ist ein häufig verwendetes Modellepitop⁸. Darüber hinaus ist OVA_257-264 entscheidend für die adaptive Immunantwort gegen Tumore, die von der zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort (CTL) abhängt. Sie wird durch antigenspezifische CD8⁺ T-Zellen im Tumor vermittelt, die durch das OVA_257-264 Peptid induziert werden. Es ist gekennzeichnet durch unzureichendes Granzym B, das von zytotoxischen T-Zellen freigesetzt wird, was zur Apoptose der Zielzellen führt⁸. Die Verabreichung von freiem OVA_{257-264-Peptid} kann jedoch eine geringe CTL-Aktivität induzieren, da die Aufnahme dieser Antigene in unspezifischen Zellen und nicht in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) erfolgt. Das Fehlen einer geeigneten Immunstimulation führt zu einer CTL-Aktivität⁵. Daher erfordert die Induktion einer wirksamen CTL-Aktivität erhebliche Fortschritte.

Aufgrund der Barriere durch Epithelzellen und der kontinuierlichen Schleimsekretion werden Impfantigene schnell aus dem Nasenschleim entfernt ^9,10. Die Entwicklung eines effizienten Impfstoffvektors, der das Schleimhautgewebe passieren kann, ist von entscheidender Bedeutung, da sich die antigenpräsentierenden Zellen unter dem Schleimhautepithel befinden⁹. Die intranasale Injektion von Impfstoffen induziert theoretisch eine Immunität der Schleimhäute zur Bekämpfung von Schleimhautinfektionen¹¹. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung eine effektive und sichere Verabreichungsmethode für Impfstoffe, da sie bequem ist, die Verabreichung des Darms vermeidet und die^{Compliance der Patienten} verbessert 7. Daher ist die nasale Verabreichung ein gutes Mittel zur Verabreichung des neuartigen Peptid-Epitop-Nanoimpfstoffs.

Es wurden mehrere synthetische Biomaterialien entwickelt, um Epitope von Zellgewebe und Zell-Zell-Interaktionen zu kombinieren. Bestimmte bioaktive Proteine, wie z. B. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), wurden als Teil der Struktur des Hydrogels eingeführt, um Bioaktivität zu verleihen¹². Dieses Peptid trägt wahrscheinlich zur Zellanhaftung, -migration und -ausbildung^{bei 13} und bindet Integrine α 3β1 und α_6β1, um mit verschiedenen Krebszelltypen zu interagieren. IKVAV ist ein Zelladhäsionspeptid, das sich von der Laminin-Basalmembranprotein-α-1-Kette ableitet, die ursprünglich zur Modellierung der neuronalen Mikroumgebung und zur neuronalen Differenzierung verwendet wurde¹⁴. Daher ist es wichtig, ein effizientes Verabreichungsvehikel für diesen neuartigen Impfstoff zu finden, um Krankheiten zu kontrollieren.

Kürzlich beschriebene Emulsionssysteme wie W805EC und MF59 wurden ebenfalls für die Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Impfstoff oder rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen in die Nasenhöhle hergestellt und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität auslösen¹⁵. Nanoemulsionen (NEs) haben im Vergleich zu partikulären Schleimhautverabreichungssystemen die Vorteile einer einfachen Verabreichung und einer bequemen Co-Bildung mit wirksamen Adjuvantien¹⁶. Es wurde berichtet, dass Nanoemulsionsimpfstoffe den allergischen Phänotyp nachhaltig verändern, anders als bei der herkömmlichen Desensibilisierung, was zu langfristigen unterdrückenden Wirkungen führt¹⁷. Andere berichteten, dass Nanoemulsionen in Kombination mit Mtb-spezifischen immundominanten Antigenen starke Schleimhautzellantworten induzieren und einen signifikanten Schutz verleihen könnten¹⁸. Daher wurde ein neuartiger intranasaler selbstassemblierter Nanoimpfstoff mit dem synthetischen Peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, das Peptid bestehend aus IKVAV gebunden an OVA_257-264) entwickelt. Es ist wichtig, diesen neuartigen Nanoimpfstoff systematisch zu bewerten.

Ziel dieses Protokolls ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Toxizität und die Stabilität des Nanoimpfstoffs systematisch zu bewerten, festzustellen, ob die Antigenaufnahme und die schützende und therapeutische Wirkung mit technischen Mitteln verbessert werden, und die wichtigsten experimentellen Inhalte zu erläutern. In dieser Studie haben wir eine Reihe von Protokollen erstellt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, das Ausmaß der Toxizität der I-OVA NE zu BEAS-2B-Zellen durch CCK-8 zu bestimmen und die Antigen-präsentierende Fähigkeit von BEAS-2B-Zellen zum Impfstoff mittels konfokaler Mikroskopie zu beobachten, die Freisetzungsprofile dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro zu bewertenund die schützende und therapeutische Wirkung dieses Impfstoffs anhand eines E.G7-OVA-Tumor-tragenden Mausmodells nachzuweisen.

Protocol

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert. 1. Vorbereitung der I-OVA NE Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMS…

Representative Results

Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen …

Discussion

Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln^16,20…

Materials

96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800