Beredning, egenskaper, toxicitet och effektutvärdering av det nasala självmonterade nanoemulsionstumörvaccinet in vitro och in vivo

Summary

Här presenterar vi detaljerade metoder för beredning och utvärdering av det nasala självmonterade nanoemulsionstumörvaccinet in vitro och in vivo.

Abstract

Epitoppeptider har väckt stor uppmärksamhet inom tumörvacciner på grund av deras säkerhet, höga specificitet och bekväm produktion; i synnerhet kan vissa MHC I-begränsade epitoper inducera effektiv cytotoxisk T-lymfocytaktivitet för att rensa tumörceller. Dessutom är nasal administrering en effektiv och säker leveransteknik för tumörvacciner på grund av dess bekvämlighet och förbättrad patientöverensstämmelse. Epitoppeptider är emellertid olämpliga för nasal leverans på grund av deras dåliga immunogenicitet och brist på leveranseffektivitet. Nanoemulsioner (NE) är termodynamiskt stabila system som kan laddas med antigener och levereras direkt till nässlemhinnans yta. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) är kärnpentapeptiden av laminin, en integrinbindande peptid som uttrycks av humana respiratoriska epitelceller. I denna studie framställdes ett intranasalt självmonterat epitoppeptid NE-tumörvaccin innehållande den syntetiska peptiden IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) med en lågenergiemulgeringsmetod. Kombinationen av IKVAV och OVA_257-264 kan förbättra antigenupptaget av nasala mukosala epitelceller. Här upprättar vi ett protokoll för att studera de fysikalisk-kemiska egenskaperna genom transmissionselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) och dynamisk ljusspridning (DLS); stabilitet i närvaro av mucinprotein; toxicitet genom undersökning av cellviabiliteten hos BEAS-2B-celler och näs- och lungvävnaderna hos C57BL/6-möss, cellulärt upptag genom konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM); frisläppa profiler genom att avbilda små djur in vivo; och vaccinets skyddande och terapeutiska effekt med hjälp av en E.G7-tumörbärande modell. Vi förväntar oss att protokollet kommer att ge tekniska och teoretiska ledtrådar för framtida utveckling av nya T-cellsepitoppeptidslemhinnevacciner.

Introduction

Som en av de mest kritiska folkhälsoinnovationerna spelar vacciner en nyckelroll i kampen mot den globala bördan av mänskliga sjukdomar¹. För närvarande testas till exempel mer än 120 kandidatvacciner mot covid-19-sjukdomar, varav några har godkänts i många länder². Nya rapporter säger att cancervacciner effektivt har förbättrat framstegen för kliniska cancerbehandlingar eftersom de leder immunsystemet hos cancerpatienter att känna igen antigener som främmande för kroppen³. Dessutom kan flera T-cellsepitoper belägna inuti eller utanför tumörceller användas för att utforma peptidvacciner, som har visat fördelar vid behandling av metastaserande cancer på grund av bristen på den signifikanta toxiciteten i samband med strålbehandling och kemoterapi ^4,5. Sedan mitten av 1990-talet har prekliniska och kliniska prövningar för tumörbehandling huvudsakligen genomförts med antigenpeptidvacciner, men få vacciner uppvisar en adekvat terapeutisk effekt på cancerpatienter⁶. Vidare har cancervacciner med peptidepitoper dålig immunogenicitet och otillräcklig leveranseffektivitet, vilket kan bero på snabb nedbrytning av extracellulära peptider som diffunderar snabbt från administreringsstället, vilket leder till otillräckligt antigenupptag av immunceller⁷. Därför är det nödvändigt att övervinna dessa hinder med vaccinleveransteknik.

OVA 257-264, MHC klass I-bindande_257-264 epitop uttryckt som ett fusionsprotein, är en ofta använd modell epitop⁸. Dessutom är OVA_257-264 avgörande för det adaptiva immunsvaret mot tumörer, vilket beror på det cytotoxiska T-lymfocytsvaret (CTL). Det medieras av antigenspecifika CD8 ⁺ T-celler i tumören, som induceras av OVA_{257-264-peptiden} . Det kännetecknas av otillräcklig granzym B, som frigörs av cytotoxiska T-celler, vilket leder till apoptos av målceller⁸. Administrering av fri OVA_{257-264-peptid} kan dock inducera liten CTL-aktivitet eftersom upptaget av dessa antigener sker i icke-specifika celler snarare än antigenpresenterande celler (APC). Brist på lämplig immunstimulering resulterar i CTL-aktivitet⁵. Därför kräver induktionen av effektiv CTL-aktivitet betydande framsteg.

På grund av barriären från epitelceller och den kontinuerliga utsöndringen av slem avlägsnas vaccinantigener snabbt från nässlemhinnan ^9,10. Att utveckla en effektiv vaccinvektor som kan passera genom slemhinnevävnaden är avgörande eftersom de antigenpresenterande cellerna ligger under slemhinnans epitel⁹. Intranasal injektion av vacciner inducerar teoretiskt slemhinneimmunitet för att bekämpa slemhinneinfektion¹¹. Dessutom är nasal leverans en effektiv och säker administreringsmetod för vacciner på grund av dess bekvämlighet, undvikande av tarmadministration och förbättrad patientöverensstämmelse⁷. Därför är nasal leverans ett bra administreringssätt för den nya peptidepitopnanovaccinen.

Flera syntetiska biomaterial har tagits fram för att kombinera epitoper av cell-vävnad och cell-cellinteraktioner. Vissa bioaktiva proteiner, såsom Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), har införts som en del av hydrogelens struktur för att ge bioaktivitet¹². Denna peptid bidrar sannolikt till cellbindning, migration och utväxt¹³ och binder integriner α 3β1 och_{α 6β1} för att interagera med olika cancercelltyper. IKVAV är en celladhesionspeptid härledd från laminin basalmembranprotein α_1-kedjan som ursprungligen användes för att modellera den neurala mikromiljön och orsaka neuronal differentiering¹⁴. Därför är det viktigt att hitta ett effektivt leveransfordon för detta nya vaccin för sjukdomsbekämpning.

Nyligen rapporterade emulsionssystem, såsom W805EC och MF59, har också blandats för leverans av inaktiverat influensavaccin eller rekombinant hepatit B-ytantigen och illustrerats för att utlösa både mukosal och systemisk immunitet¹⁵. Nanoemulsioner (NE) har fördelarna med enkel administrering och bekväm sambildning med effektiva adjuvans jämfört med partikelformiga slemhinneleveranssystem¹⁶. Nanoemulsionsvacciner har rapporterats förändra den allergiska fenotypen på ett varaktigt sätt som skiljer sig från traditionell desensibilisering, vilket resulterar i långsiktiga undertryckande effekter¹⁷. Andra rapporterade att nanoemulsioner i kombination med Mtb-specifika immunodominanta antigener kan inducera potenta slemhinnecellssvar och ge signifikant skydd¹⁸. Därför designades ett nytt intranasalt självmonterat nanovaccin med den syntetiska peptiden IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptiden bestående av IKVAV bunden till OVA_257-264). Det är viktigt att bedöma detta nya nanovaccin systematiskt.

Syftet med detta protokoll är att systematiskt utvärdera nanovaccinets fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och stabilitet, upptäcka om antigenupptag och skyddande och terapeutiska effekter förbättras med hjälp av tekniska medel och utarbeta det huvudsakliga experimentella innehållet. I denna studie etablerade vi en serie protokoll för att studera de fysikalisk-kemiska egenskaperna och stabiliteten, bestämma storleken på toxiciteten hos I-OVA NE till BEAS-2B-celler med CCK-8 och observera BEAS-2B-cellernas antigenpresenterande förmåga till vaccinet med hjälp av konfokalmikroskopi, utvärdera frisättningsprofilerna för detta nya nanovaccin in vivo och in vitro, och detektera den skyddande och terapeutiska effekten av detta vaccin med hjälp av en E.G7-OVA-tumörbärande musmodell.

Protocol

Djurförsöken utfördes i enlighet med Försöksdjur-Riktlinje för etisk granskning av djurskydd (GB / T 35892-2018) och godkändes av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee of the Third Military Medical University. Mössen avlivades genom en intraperitoneal injektion av 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital. 1. Beredning av I-OVA NE Blanda 1 mg monofosforyllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, virvel i 5 minuter och låt den stå i 4 timmar vid rumstemperatur (RT)…

Representative Results

Enligt protokollet slutförde vi beredningen och in vitro och in vivo experimentell utvärdering av nanovaccinleveransen för nästumören. TEM, AFM och DLS är effektiva medel för bedömning av de grundläggande egenskaperna hos ytzetapotentialen och nanovaccinets partikelstorlek (figur 1). BEAS-2B-epitelceller är en användbar screeningmodell för in vitro-toxicitetstestning av nasala vacciner (figur 2A). Mikrofotografierna färga…

Discussion

Nanovacciner funktionaliserade med immunocytmembran har stora fördelar vid sjukdomsriktad terapi, och biverkningarna minimeras av egenskaper som unik tumörtropism, identifiering av specifika mål, långvarig cirkulation, förbättrade intercellulära interaktioner och låg systemisk toxicitet. De kan också enkelt integreras med andra behandlingsmoduler för att behandla cancer tillsammans^16,20. Önskvärda egenskaper kan erhållas genom att kontrollerafysiska …

Materials

96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800