PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME
Summary
Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.
Abstract
La capacité d’auto-renouvellement et le potentiel de différenciation multi-lignée sont généralement considérés comme les caractéristiques déterminantes des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Cependant, de nombreuses études ont suggéré qu’une hétérogénéité fonctionnelle existe dans le compartiment HSC. Des analyses récentes de cellules uniques ont rapporté des clones de CSH avec des destins cellulaires différents dans le compartiment des CSH, appelés clones de CSH biaisés. Les mécanismes sous-jacents aux résultats hétérogènes ou peu reproductibles sont peu compris, notamment en ce qui concerne la durée de l’auto-renouvellement lorsque des fractions de CSH purifiées sont transplantées par immunomarquage classique. Par conséquent, l’établissement d’une méthode d’isolation reproductible pour les CSH à long terme (CSH-LT) et les CSH à court terme (CSS-ST), définies par la durée de leur auto-renouvellement, est crucial pour surmonter ce problème. En utilisant un dépistage non biaisé en plusieurs étapes, nous avons identifié un facteur de transcription, Hoxb5, qui pourrait être un marqueur exclusif des CSL-LT dans le système hématopoïétique de la souris. Sur la base de cette découverte, nous avons établi une lignée de souris rapporteures Hoxb5 et isolé avec succès les LT-HSC et les ST-HSC. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolation des LT-HSC et des ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . Cette méthode d’isolement aidera les chercheurs à mieux comprendre les mécanismes d’auto-renouvellement et la base biologique d’une telle hétérogénéité dans le compartiment HSC.
Introduction
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui possèdent une capacité d’auto-renouvellement et de multipotence, résident au sommet de la hiérarchie hématopoïétique 1,2. En 1988, Weissman et ses collègues ont démontré pour la première fois que l’isolement des CSH de souris pouvait être réalisé en utilisant la cytométriede flux 3. Par la suite, une fraction définie par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, a été signalée comme contenant toutes les CSH chez les souris 4,5,6,7,8.
Les CSH définies immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (ci-après, les CSHp) étaient auparavant considérées comme fonctionnellement homogènes. Cependant, des analyses récentes sur une seule cellule ont révélé que les CSHp présentent toujours une hétérogénéité en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement 9,10 et leur multipotence11,12. Plus précisément, deux populations semblent exister dans la fraction des CSHp en ce qui concerne leur capacité d’auto-renouvellement : les cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), qui ont une capacité d’auto-renouvellement continue, et les cellules souches hématopoïétiques à court terme (CSS-ST), qui ont une capacité d’auto-renouvellement transitoire 9,10.
À ce jour, les mécanismes moléculaires de la capacité d’auto-renouvellement qui distinguent les CSL-LT et les CST-ST restent mal compris. Il est crucial d’isoler les deux populations cellulaires en fonction de leurs capacités d’auto-renouvellement et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. Plusieurs systèmes rapporteurs ont également été introduits pour purifier les LT-HSC13,14,15; cependant, la pureté LT-HSC définie par chaque système rapporteur est variable, et la purification exclusive LT-HSC n’a pas été atteinte à ce jour.
Par conséquent, le développement d’un système d’isolation pour les CSL-LT et les CSS-ST accélérera la recherche sur la capacité d’auto-renouvellement dans la fraction des CSHp. Dans l’isolement des CSH-LT et des CSS-ST, une étude utilisant un criblage non biaisé en plusieurs étapes a identifié un seul gène, Hoxb5, qui est exprimé de manière hétérogène dans la fraction16 des CSp. De plus, l’analyse de la moelle osseuse des souris rapporteures Hoxb5 a révélé qu’environ 20% à 25% de la fraction pHSC est constituée de cellulesPos Hoxb5. Un test de transplantation compétitif utilisant des CSp Hoxb5 pos et des CSp négatives Hoxb5 a révélé que seuls les CSp Hoxb5 pos possèdent une capacité d’auto-renouvellement à long terme, tandis que les CSPp Hoxb5neg perdent leur capacité d’auto-renouvellement en peu de temps, ce qui indique que Hoxb5 identifie les CSH-LT dans la fraction16 des CSPp.
Ici, nous démontrons un protocole étape par étape pour isoler les LT-HSC et les ST-HSC à l’aide du système de rapporteur Hoxb5 . De plus, nous présentons un test de transplantation compétitif pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement des CSp Hoxb5pos/neg (Figure 1). Ce système de rapporteur Hoxb5 nous permet d’isoler de manière prospective les LT-HSC et les ST-HSC et contribue à la compréhension des caractéristiques spécifiques aux LT-HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionnellement, les CSH définies par marqueurs de surface cellulaire ont été préparées pour étudier les fonctions des CSH, telles que la capacité d’auto-renouvellement et la multipuissance 19,20,21. Cependant, la fraction de CSH définie immunophénotypiquement (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contient deux populations distin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Hiroshi Kiyonari pour les soins aux animaux et pour avoir fourni des souris receveuses à RIKEN BDR, ainsi que Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka et Masaki Miyahashi pour la gestion du laboratoire à l’Université de Kobe. Les auteurs apprécient également grandement le soutien continu apporté à ce travail. Masanori Miyanishi a été soutenu par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Numéros de subvention KAKENHI JP17K07407 et JP20H03268, la Fondation Mochida Memorial pour la recherche médicale et pharmaceutique, la Fondation des sciences de la vie du Japon, la Fondation scientifique Takeda, la Fondation Astellas pour la recherche sur les troubles métaboliques et AMED-PRIME, AMED sous le numéro de subvention JP18gm6110020. Taro Sakamaki est soutenu par les numéros de subvention JP21K20669 et JP22K16334 de JSPS KAKENHI et a été soutenu par le programme de base à noyau JSPS et le programme d’associé de recherche junior RIKEN. Katsuyuki Nishi a été soutenu par JSPS Grant Number KAKENHI JP18J13408.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
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