Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi
Summary
Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC’ler) ve kısa süreli HSC’lerin (ST-HSC’ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Kendini yenileme kapasitesi ve çok soylu farklılaşma potansiyeli genellikle hematopoetik kök hücrelerin (HSC) tanımlayıcı özellikleri olarak kabul edilir. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, HSC kompartmanında fonksiyonel heterojenitenin var olduğunu ileri sürmüştür. Son zamanlarda yapılan tek hücreli analizler, HSC bölmesinde farklı hücre kaderlerine sahip HSC klonlarını bildirmiştir ve bunlar önyargılı HSC klonları olarak adlandırılmaktadır. Heterojen veya kötü tekrarlanabilir sonuçların altında yatan mekanizmalar, özellikle saflaştırılmış HSC fraksiyonları konvansiyonel immün boyama ile nakledildiğinde kendini yenilemenin uzunluğu ile ilgili olarak çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, uzun vadeli HSC’ler (LT-HSC’ler) ve kısa vadeli HSC’ler (ST-HSC’ler) için, kendilerini yenileme süreleri ile tanımlanan tekrarlanabilir bir izolasyon yöntemi oluşturmak, bu sorunun üstesinden gelmek için çok önemlidir. Tarafsız çok adımlı tarama kullanarak, fare hematopoetik sistemindeki LT-HSC’lerin özel bir belirteci olabilecek bir transkripsiyon faktörü olan Hoxb5’i tanımladık. Bu bulguya dayanarak, bir Hoxb5 muhabir fare hattı oluşturduk ve LT-HSC’leri ve ST-HSC’leri başarıyla izole ettik. Burada, Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak LT-HSC’lerin ve ST-HSC’lerin izolasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu izolasyon yöntemi, araştırmacıların kendini yenileme mekanizmalarını ve HSC bölmesindeki bu heterojenliğin biyolojik temelini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.
Introduction
Kendini yenileme kapasitesine ve multipotensine sahip hematopoetik kök hücreler (HSC’ler), hematopoetik hiyerarşi 1,2’nin zirvesinde yer almaktadır. 1988’de Weissman ve meslektaşları ilk kez fare HSC’lerinin izolasyonunun akış sitometrisi3 kullanılarak sağlanabileceğini gösterdi. Daha sonra, hücre yüzey belirteçlerinin bir kombinasyonu ile tanımlanan bir fraksiyonun, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / loFlk2 −, farelerde tüm HSC’leri içerdiği bildirildi 4,5,6,7,8.
İmmünofenotipik olarak tanımlanmış (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC’ler (bundan böyle pHSC’ler) daha önce fonksiyonel olarak homojen olarak kabul edildi. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan tek hücreli analizler, pHSC’lerin hala kendini yenileme kapasiteleri9,10 ve multipotens11,12 açısından heterojenlik sergilediklerini ortaya koymuştur. Spesifik olarak, pHSC fraksiyonunda kendini yenileme kapasiteleri açısından iki popülasyon var gibi görünmektedir: sürekli kendini yenileme kapasitesine sahip uzun süreli hematopoetik kök hücreler (LT-HSC’ler) ve geçici kendini yenileme kapasitesine sahip kısa süreli hematopoetik kök hücreler (ST-HSC’ler) 9,10.
Bugüne kadar, LT-HSC’leri ve ST-HSC’leri birbirinden ayıran kendini yenileme kapasitesinin moleküler mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Her iki hücre popülasyonunu da kendini yenileme kapasitelerine göre izole etmek ve altta yatan moleküler mekanizmaları keşfetmek çok önemlidir. LT-HSC’leri saflaştırmak için çeşitli muhabir sistemleri de tanıtılmıştır13,14,15; Bununla birlikte, her bir muhabir sistemi tarafından tanımlanan LT-HSC saflığı değişkendir ve bugüne kadar özel LT-HSC saflaştırması sağlanamamıştır.
Bu nedenle, LT-HSC’ler ve ST-HSC’ler için bir izolasyon sistemi geliştirmek, pHSC fraksiyonunda kendini yenileme kapasitesi ile ilgili araştırmaları hızlandıracaktır. LT-HSC’lerin ve ST-HSC’lerin izolasyonunda, çok adımlı, tarafsız tarama kullanan bir çalışma, pHSC fraksiyonu16’da heterojen olarak ifade edilen tek bir gen, Hoxb5’i tanımladı. Ek olarak, Hoxb5 muhabir farelerinin kemik iliği analizi, pHSC fraksiyonunun yaklaşık% 20-25’inin Hoxb5 pos hücrelerinden oluştuğunu ortaya koymuştur. Hoxb5pos pHSC’ler ve Hoxb5neg pHSC’ler kullanılarak yapılan rekabetçi bir transplantasyon testi, sadece Hoxb5 pos pHSC’lerin uzun vadeli kendini yenileme kapasitesine sahip olduğunu, Hoxb5neg pHSC’lerin ise kısa bir süre içinde kendini yenileme kapasitelerini kaybettiğini ortaya koymuştur ve bu da Hoxb5’in pHSC fraksiyonu16’da LT-HSC’leri tanımladığını göstermektedir.
Burada, Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak LT-HSC’leri ve ST-HSC’leri izole etmek için adım adım bir protokol gösteriyoruz. Ek olarak, Hoxb5pos/neg pHSC’lerin kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için rekabetçi bir transplantasyon testi sunuyoruz (Şekil 1). Bu Hoxb5 raporlayıcı sistemi, LT-HSC’leri ve ST-HSC’leri ileriye dönük olarak izole etmemizi sağlar ve LT-HSC’ye özgü özelliklerin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel olarak, hücre yüzey belirteci tanımlı HSC’ler, HSC’lerin kendini yenileme kapasitesi ve çoklu potens 19,20,21 gibi işlevlerini incelemek için hazırlanmıştır. Bununla birlikte, immünofenotipik olarak tanımlanan (Soy-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / loFlk2 −) HSC fraksiyonu iki ayrı HSC popülasyonu içerir: LT-HSC’ler ve ST-HSC’ler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiroshi Kiyonari’ye hayvan bakımı ve RIKEN BDR’de alıcı fareler sağladığı için ve ayrıca Kobe Üniversitesi’nde laboratuvar yönetimi için Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka ve Masaki Miyahashi’ye minnettarız. Yazarlar ayrıca bu çalışma için devam eden desteği de büyük ölçüde takdir ediyorlar. Masanori Miyanishi, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) KAKENHI Hibe Numaraları JP17K07407 ve JP20H03268, Mochida Memorial Tıbbi ve Farmasötik Araştırma Vakfı, Japonya Yaşam Bilimleri Vakfı, Takeda Bilim Vakfı, Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı ve AMED-PRIME, AMED tarafından JP18gm6110020 Hibe Numarası altında desteklenmiştir. Taro Sakamaki, JSPS KAKENHI Hibe Numaraları JP21K20669 ve JP22K16334 tarafından desteklenmektedir ve JSPS Çekirdekten Çekirdeğe Programı ve RIKEN Junior Araştırma Önlisans Programı. Katsuyuki Nishi, JSPS Hibe Numarası KAKENHI JP18J13408 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
