JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

تقييم السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري باستخدام نموذج فأر Xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا يتم فيه استخدام نموذج xenograft المشتق من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم ومراقبة السمية المرتبطة بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري التي تستهدف CD19.

Abstract

برز العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) كأداة قوية لعلاج أنواع متعددة من الأورام الخبيثة CD19 + ، مما أدى إلى موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مؤخرا على العديد من علاجات الخلايا CART (CART19) التي تستهدف CD19. ومع ذلك ، يرتبط العلاج بالخلايا CART بمجموعة فريدة من السميات التي تحمل معدلات المراضة والوفيات الخاصة بها. وهذا يشمل متلازمة إطلاق السيتوكين (CRS) والالتهاب العصبي (NI). كان استخدام نماذج الفئران قبل السريرية أمرا حاسما في البحث والتطوير لتكنولوجيا CART لتقييم كل من فعالية CART وسمية CART. تشمل النماذج قبل السريرية المتاحة لاختبار هذا العلاج المناعي الخلوي بالتبني نماذج الفئران الجينية ، و xenograft ، والمعدلة وراثيا ، والإنسانية. لا يوجد نموذج واحد يعكس بسلاسة جهاز المناعة البشري ، ولكل نموذج نقاط قوة وضعف. تهدف ورقة الطرق هذه إلى وصف نموذج xenograft المشتق من المريض باستخدام أرومات اللوكيميا من المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي الحاد كاستراتيجية لتقييم السمية المرتبطة ب CART19 ، CRS ، و NI. وقد ثبت أن هذا النموذج يلخص السمية المرتبطة ب CART19 بالإضافة إلى الفعالية العلاجية كما رأينا في العيادة.

Introduction

أحدث العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CART) ثورة في مجال العلاج المناعي للسرطان. لقد أثبت نجاحه في علاج سرطان الدم الليمفاوي الحاد الانتكاسي / المقاوم (ALL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا الوشاح ، وسرطان الغدد الليمفاوية الجريبي ، والورم النقوي المتعدد1،2،3،4،5،6،7 ، مما أدى إلى موافقات إدارة الغذاء والدواء الأخيرة. على الرغم من النجاح الأولي في التجارب السريرية ، فإن العلاج بخلايا CART يؤدي إلى سميات غالبا ما تكون شديدة ومميتة في بعض الأحيان. تشمل السميات الأكثر شيوعا بعد العلاج بخلايا CART تطوير CRS و NI ، والتي يشار إليها أيضا باسم متلازمة السمية العصبية المرتبطة بالخلايا المستجيبة المناعية (ICANS) 8,9. يحدث CRS بسبب الإفراط في التنشيط والتوسع الهائل لخلايا CART في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى إفراز لاحق للعديد من السيتوكينات الالتهابية ، بما في ذلك γ الإنترفيرون ، وعامل نخر الورم α ، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) ، والإنترلوكين -6 (IL-6). هذا يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم ، وارتفاع في درجة الحرارة ، ومتلازمة تسرب الشعيرات الدموية ، وفشل الجهاز التنفسي ، وفشل متعدد الأعضاء ، وفي بعض الحالات ، الموت10,11. يتطور CRS في 50-100٪ من الحالات بعد العلاج بالخلايا CART1911،12،13. ICANS هو حدث ضار فريد آخر مرتبط بالعلاج بخلايا CART ويتميز بالوذمة الدماغية المعممة ، والارتباك ، والانقطاع ، وفقدان القدرة على الكلام ، والضعف الحركي ، وأحيانا النوبات 9,14. تحدث أي درجة من ICANS في ما يصل إلى 70٪ من المرضى ، ويتم الإبلاغ عن الدرجات 3-4 في 20-30٪ من المرضى5،10،15،16. بشكل عام ، CRS و ICANS شائعان ويمكن أن يكونا قاتلين.

تمثل إدارة ICANS بعد العلاج بالخلايا CART تحديا. يعاني معظم المرضى الذين يعانون من ICANS أيضا من CRS17 ، والذي يمكن علاجه غالبا باستخدام مضاد مستقبلات IL-6 توسيليزوماب أو المنشطات18. كشف تقرير سابق أن التدخل المبكر مع توسيليزوماب قلل من معدل CRS الشديد ولكنه لم يؤثر على حدوث أو شدة ICANS19. في الوقت الحالي ، لا يوجد علاج فعال أو عامل وقائي ل ICANS ، ومن الأهمية بمكان التحقيق في الاستراتيجيات الوقائية20.

يعتقد أن الخلايا النخاعية والسيتوكينات / الكيموكينات المرتبطة بها هي الدوافع الرئيسية لتطوير CRS و ICANS21. في حين أن CRS يرتبط ارتباطا مباشرا بالارتفاع الشديد للسيتوكينات وتوسع الخلايا التائية ، فإن الفيزيولوجيا المرضية ل ICANS غير معروفة إلى حد كبير22,23. لذلك ، من الضروري إنشاء نموذج فأر يلخص هذه السميات بعد العلاج بخلايا CART لدراسة الآليات وتطوير الاستراتيجيات الوقائية.

هناك العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية المستخدمة حاليا لدراسة وتحسين والتحقق من فعالية خلايا CART ، وكذلك لمراقبة السمية المرتبطة بها. وتشمل هذه الفئران الوراثية ، والطعم الأجنبي ، والمعدلة وراثيا ذات الكفاءة المناعية ، والمعدلة وراثيا المتوافقة مع البشر ، والفئران المشتقة من المريض ، بالإضافة إلى نماذج الرئيسيات. ومع ذلك ، فإن كل نموذج من هذه النماذج له عيوب ، وبعضها لا يعكس الفعالية الحقيقية أو مخاوف السلامة لخلايا CART24,25. لذلك ، لا بد من اختيار أفضل نموذج بعناية للأهداف المقصودة من الدراسة.

تسعى هذه المقالة إلى وصف المنهجية المستخدمة لتقييم السميات المرتبطة بخلايا CART ، CRS و NI ، باستخدام نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه التحديد ، في الطرق الموضحة هنا ، يتم استخدام خلايا CART19 التي تم إنشاؤها في مختبر المؤلفين باتباع البروتوكولات الموصوفة مسبقا. باختصار ، يتم عزل الخلايا التائية البشرية من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية من متبرع سليم (PBMCs) عبر تقنية تدرج الكثافة ، ويتم تحفيزها بخرز CD3 / CD28 في اليوم 0 ، ويتم تحويلها عدسيا في اليوم الأول مع CARs المكونة من جزء متغير أحادي السلسلة يستهدف CD19 يندمج في مجالات إشارات 4-1BB و CD3ζ. ثم يتم توسيع خلايا CART هذه ، وإزالة الخرز في اليوم 6 ، وحفظها بالتبريد في اليوم 826،27،28،29،30. كما هو موضح سابقا ، تخضع الفئران للعلاج اللمفاوي المستنفد ، يليه إعطاء أرومات اللوكيميا المشتقة من المريض (ALL)28. أولا ، يتم التحقق من تطعيم الورم عن طريق جمع الدم تحت الفك السفلي. بعد إنشاء عبء الورم المناسب ، يتم إعطاء خلايا CART19 للفئران. بعد ذلك ، يتم وزن الفئران يوميا لتقييم الرفاهية. يتم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانات الصغيرة (MRI) لتقييم NI ، جنبا إلى جنب مع نزيف الذيل لتقييم توسع الخلايا التائية وإنتاج السيتوكين / الكيموكين. يوصى بشدة باستخدام التقنيات الموضحة أدناه كنموذج لدراسة السميات المرتبطة بخلايا CART في نموذج PDX.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول إرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع ل Mayo Clinic، واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC A00001767)، واللجنة المؤسسية للسلامة الحيوية (IBC، Bios00000006.04). ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد المستخدمة للعمل مع الفئران معقمة. 1. حقن بوسلفا…

Representative Results

الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج الفئران PDX من الخلايا السرطانية للمرضى الذين يعانون من ALL (الشكل 1). أولا ، تلقت الفئران NSG حقن i.p. من بوسلفان (30 ملغم / كغم) بهدف كبت المناعة لهم وتسهيل تطعيم خلايا CART28. في اليوم التالي ، تلقو…

Discussion

في هذا التقرير ، تم وصف منهجية لتقييم السمية المرتبطة بخلايا CART باستخدام نموذج ALL PDX. وبشكل أكثر تحديدا ، يسعى هذا النموذج إلى تقليد سميتين تهددان الحياة ، CRS و NI ، والتي غالبا ما يعاني منها المرضى بعد ضخ خلايا CART. يلخص العديد من السمات المميزة لسمية CART التي لوحظت في العيادة: فقدان الوزن ، وال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المعاهد الوطنية للصحة (R37CA266344 ، 1K99CA273304) ، ووزارة الدفاع (CA201127) ، وخط أنابيب Mayo Clinic K2R (SSK) ، ومركز Mayo Clinic للطب الفردي (SSK) ، ومؤسسة Predolin (R.L.S.). بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر موظفي مرفق الرنين المغناطيسي النووي الأساسي في Mayo Clinic. تم إنشاء الشكل 1 في عام BioRender.com

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. 암 연구학. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

CAR-TAcute Lymphoblastic LeukemiaPatient-derived XenograftToxicity AssessmentMotor WeaknessWeight LossCytokine AnalysisMRI ImagingBreathing MonitoringParaVision Software

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image