JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Beoordeling van chimere antigeenreceptor T-celgeassocieerde toxiciteiten met behulp van een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmuismodel

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

Hier beschrijven we een protocol waarin een acuut lymfoblastische leukemiepatiënt-afgeleid xenograftmodel wordt gebruikt als een strategie om CD19-gerichte chimere antigeenreceptor T-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen en te monitoren.

Abstract

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van meerdere soorten CD19 + maligniteiten, wat heeft geleid tot de recente FDA-goedkeuring van verschillende CD19-gerichte CART (CART19) celtherapieën. CART-celtherapie wordt echter geassocieerd met een unieke reeks toxiciteiten die hun eigen morbiditeit en mortaliteit met zich meebrengen. Dit omvat cytokine release syndrome (CRS) en neuro-inflammatie (NI). Het gebruik van preklinische muismodellen is cruciaal geweest in het onderzoek en de ontwikkeling van CART-technologie voor het beoordelen van zowel CART-werkzaamheid als CART-toxiciteit. De beschikbare preklinische modellen om deze adoptieve cellulaire immunotherapie te testen omvatten syngene, xenograft, transgene en gehumaniseerde muismodellen. Er is geen enkel model dat naadloos het menselijk immuunsysteem weerspiegelt, en elk model heeft sterke en zwakke punten. Dit methodedocument heeft tot doel een van de patiënt afgeleid xenograftmodel te beschrijven met behulp van leukemische blasten van patiënten met acute lymfatische leukemie als een strategie om CART19-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen. Van dit model is aangetoond dat het CART19-geassocieerde toxiciteiten en therapeutische werkzaamheid zoals gezien in de kliniek samenvat.

Introduction

Chimere antigeenreceptor T (CART) celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van kankerimmunotherapie. Het heeft bewezen succesvol te zijn bij de behandeling van recidiverende / refractaire acute lymfatische leukemie (ALL), grootcellig B-cellymfoom, mantelcellymfoom, folliculair lymfoom en multipel myeloom 1,2,3,4,5,6,7, wat leidt tot recente FDA-goedkeuringen. Ondanks het aanvankelijke succes in klinische onderzoeken, resulteert behandeling met CART-celtherapie in toxiciteiten die vaak ernstig en soms dodelijk zijn. De meest voorkomende toxiciteiten na CART-celtherapie zijn de ontwikkeling van CRS en NI, ook wel immuuneffectorcelgeassocieerd neurotoxiciteitssyndroom (ICANS) genoemd8,9. CRS wordt veroorzaakt door de overactivatie en massale expansie van CART-cellen in vivo, wat leidt tot de daaropvolgende secretie van meerdere inflammatoire cytokines, waaronder interferon-γ, tumornecrosefactor-α, granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) en interleukine-6 (IL-6). Dit resulteert in hypotensie, hoge koorts, capillair leksyndroom, respiratoire insufficiëntie, multi-orgaanfalen en in sommige gevallen de dood10,11. CRS ontwikkelt zich in 50-100% van de gevallen na CART19 celtherapie11,12,13. ICANS is een andere unieke bijwerking geassocieerd met CART-celtherapie en wordt gekenmerkt door gegeneraliseerd hersenoedeem, verwarring, obtundatie, afasie, motorische zwakte en af en toe aanvallen 9,14. Elke graad van ICANS komt voor bij maximaal 70% van de patiënten, en graad 3-4 wordt gemeld bij 20-30% van de patiënten 5,10,15,16. Over het algemeen komen CRS en ICANS vaak voor en kunnen ze fataal zijn.

Het beheer van ICANS na CART-celtherapie is een uitdaging. De meeste patiënten met ICANS ervaren ook CRS17, dat vaak kan worden behandeld met de IL-6-receptorantagonist tocilizumab of steroïden18. Een eerder rapport toonde aan dat vroege interventie met tocilizumab de snelheid van ernstige CRS verminderde, maar geen invloed had op de incidentie of ernst van ICANS19. Momenteel is er geen effectieve behandeling of profylactisch middel voor ICANS, en het is cruciaal om preventieve strategieën te onderzoeken20.

Myeloïde cellen en bijbehorende cytokines/chemokines worden beschouwd als de belangrijkste aanjagers van de ontwikkeling van CRS en ICANS21. Terwijl CRS direct gerelateerd is aan de extreme verhoging van cytokines en T-celexpansie, is de pathofysiologie van ICANS grotendeels onbekend22,23. Daarom is het noodzakelijk om een muismodel op te stellen dat deze toxiciteiten na CART-celtherapie samenvat om de mechanismen te bestuderen en preventieve strategieën te ontwikkelen.

Er zijn meerdere preklinische diermodellen die momenteel worden gebruikt om de werkzaamheid van CART-cellen te bestuderen, te optimaliseren en te valideren, en om hun bijbehorende toxiciteiten te controleren. Deze omvatten syngene, xenograft, immunocompetente transgene, gehumaniseerde transgene en patiënt-afgeleide xenograftmuizen, naast primatenmodellen. Elk van deze modellen heeft echter nadelen en sommige weerspiegelen niet de werkelijke werkzaamheid of veiligheidsproblemen van CART-cellen24,25. Daarom is het noodzakelijk om zorgvuldig het beste model te kiezen voor de beoogde doelen van het onderzoek.

Dit artikel beoogt de methodologie te beschrijven die wordt gebruikt om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten, CRS en NI te beoordelen, met behulp van een ALL patient-derived xenograft (PDX) in vivo model (Figuur 1). In het bijzonder worden in de hier beschreven methoden CART19-cellen gebruikt die in het laboratorium van de auteurs zijn gegenereerd volgens eerder beschreven protocollen. Kortom, menselijke T-cellen worden geïsoleerd uit gezonde donor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC’s) via een dichtheidsgradiënttechniek, gestimuleerd met CD3 / CD28-kralen op dag 0 en lentiviraal getransduceerd op dag 1 met CARs samengesteld uit een CD19-gericht enkelvoudig keten variabel fragment gefuseerd met 4-1BB- en CD3ζ-signaleringsdomeinen. Deze CART-cellen worden vervolgens uitgebreid, ont-beaded op dag 6 en gecryopreserveerd op dag 8 26,27,28,29,30. Zoals eerder beschreven, worden muizen onderworpen aan een lymfodepleterende behandeling, gevolgd door de toediening van van de patiënt afgeleide leukemische blasten (ALL)28. Eerst wordt tumortransplantatie geverifieerd via submandibulaire bloedafname. Na het vaststellen van een geschikte tumorlast worden CART19-cellen toegediend aan de muizen. Vervolgens worden de muizen dagelijks gewogen om het welzijn te beoordelen. Beeldvorming van magnetische resonantie van kleine dieren (MRI) wordt uitgevoerd om NI te beoordelen, samen met staartbloedingen om T-celexpansie en cytokine / chemokineproductie te beoordelen. De hieronder beschreven technieken worden ten zeerste aanbevolen om te worden gebruikt als een model om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten in een PDX-model te bestuderen.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB), Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) en Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) van Mayo Clinic. OPMERKING: Alle materialen die worden gebruikt om met muizen te werken, moeten steriel zijn. 1. Injectie van busulfan op NSG-muizen Verkrijg mannelijke, 8-12 weken oude, immuungecompromitteerde, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) muizen e…

Representative Results

Het doel van dit protocol is om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een PDX-muizenmodel van tumorcellen van patiënten met ALL (figuur 1). Ten eerste kregen NSG-muizen i.p. injecties met busulfan (30 mg/kg) met als doel ze immunosuppressief te maken en CART-celtransplantatiete vergemakkelijken 28. De volgende dag ontvingen ze ~5 × 106 PBMC’s (i.v.) afkomstig van ALLE patiënten. De muizen werden gedurende ~ 13 weken gecontrolee…

Discussion

In dit rapport is een methodologie beschreven om CART-cel-geassocieerde toxiciteiten te beoordelen met behulp van een ALL PDX-model. Meer specifiek probeert dit model twee levensbedreigende toxiciteiten na te bootsen, CRS en NI, die patiënten vaak ervaren na de infusie van CART-cellen. Het vat vele kenmerken van CART-toxiciteiten samen die in de kliniek zijn waargenomen: gewichtsverlies, motorische disfunctie, neuro-inflammatie, inflammatoire cytokine- en chemokineproductie en de infiltratie van verschillende effectorce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), Department of Defense (CA201127), Mayo Clinic K2R-pijplijn (SSK), het Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) en de Predolin Foundation (R.L.S.). Daarnaast willen we de medewerkers van Mayo Clinic NMR Core Facility bedanken. Figuur 1 is gemaakt in BioRender.com

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. 암 연구학. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

Keywords: CAR-TAcute Lymphoblastic LeukemiaPatient-derived XenograftToxicity AssessmentMotor WeaknessWeight LossCytokine AnalysisMRI ImagingBreathing MonitoringParaVision Software
check_url/kr/64535?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image