Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Summary

Ici, nous décrivons un protocole dans lequel un modèle de xénogreffe dérivée d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë est utilisé comme stratégie pour évaluer et surveiller les toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique CD19.

Abstract

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CART) est devenue un outil puissant pour le traitement de plusieurs types de tumeurs malignes CD19⁺ , ce qui a conduit à l’approbation récente par la FDA de plusieurs thérapies cellulaires CART ciblées par CD19 (CART19). Cependant, la thérapie cellulaire CART est associée à un ensemble unique de toxicités qui entraînent leur propre morbidité et mortalité. Cela inclut le syndrome de libération de cytokines (SRC) et la neuroinflammation (NI). L’utilisation de modèles murins précliniques a été cruciale dans la recherche et le développement de la technologie CART pour évaluer à la fois l’efficacité et la toxicité CART. Les modèles précliniques disponibles pour tester cette immunothérapie cellulaire adoptive comprennent des modèles de souris syngéniques, xénogreffées, transgéniques et humanisées. Il n’existe pas de modèle unique qui reflète parfaitement le système immunitaire humain, et chaque modèle a des forces et des faiblesses. Cet article sur les méthodes vise à décrire un modèle de xénogreffe dérivé d’un patient utilisant des blastes leucémiques de patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë comme stratégie pour évaluer les toxicités associées à CART19, CRS et NI. Il a été démontré que ce modèle récapitule les toxicités associées à CART19 ainsi que l’efficacité thérapeutique observée en clinique.

Introduction

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CART) a révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer. Il s’est avéré efficace dans le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) récidivante / réfractaire, du lymphome à grandes cellules B, du lymphome à cellules du manteau, du lymphome folliculaire et du myélome multiple 1,2,3,4,5,6,7^, conduisant à des approbations récentes de la FDA. Malgré le succès initial des essais cliniques, le traitement par thérapie cellulaire CART entraîne des toxicités souvent graves et parfois mortelles. Les toxicités les plus courantes après la thérapie cellulaire CART comprennent le développement du SRC et de l’IN, également appelé syndrome de neurotoxicité associée aux cellules effectrices immunitaires (ICANS)^8,9. Le SRC est dû à la suractivation et à l’expansion massive des cellules CART in vivo, entraînant la sécrétion ultérieure de multiples cytokines inflammatoires, notamment l’interféron-γ, le facteur de nécrose tumorale α, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) et l’interleukine-6 (IL-6). Il en résulte une hypotension, de fortes fièvres, un syndrome de fuite capillaire, une insuffisance respiratoire, une défaillance multiviscérale et, dans certains cas,^{la mort 10,11}. Le SRC se développe dans 50 à 100 % des cas après la thérapie cellulaire CART19^11,12,13. ICANS est un autre événement indésirable unique associé à la thérapie cellulaire CART et se caractérise par un œdème cérébral généralisé, une confusion, une obnubilation, une aphasie, une faiblesse motrice et, occasionnellement, des convulsions ^9,14. Tout grade d’ICANS survient chez jusqu’à 70% des patients, et des grades 3-4 sont rapportés chez 20-30% des patients 5,10,15,16. Dans l’ensemble, les SRC et les ICANS sont courants et peuvent être mortels.

La prise en charge d’ICANS après la thérapie cellulaire CART est difficile. La plupart des patients atteints d’ICANS présentent également un CRS¹⁷, qui peut souvent être traité avec l’antagoniste des récepteurs de l’IL-6 tocilizumab ou des stéroïdes¹⁸. Un rapport précédent a révélé qu’une intervention précoce avec le tocilizumab diminuait le taux de SRC sévère mais n’affectait pas l’incidence ou la gravité de l’ICANS¹⁹. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace ou d’agent prophylactique pour ICANS, et il est crucial d’étudier des stratégies préventives²⁰.

Les cellules myéloïdes et les cytokines/chimiokines associées seraient les principaux moteurs du développement du SRC et de l’ICANS²¹. Alors que le CRS est directement lié à l’élévation extrême des cytokines et à l’expansion des lymphocytes T, la physiopathologie d’ICANS est largement inconnue^22,23. Il est donc impératif d’établir un modèle murin qui récapitule ces toxicités après la thérapie cellulaire CART pour étudier les mécanismes et développer des stratégies préventives.

Plusieurs modèles animaux précliniques sont actuellement utilisés pour étudier, optimiser et valider l’efficacité des cellules CART, ainsi que pour surveiller leurs toxicités associées. Il s’agit notamment de souris syngéniques, xénogreffées, transgéniques immunocompétentes, transgéniques humanisées et xénogreffes dérivées de patients, en plus des modèles de primates. Cependant, chacun de ces modèles présente des inconvénients, et certains ne reflètent pas les véritables préoccupations en matière d’efficacité ou d’innocuité des cellules CART^24,25. Par conséquent, il est impératif de choisir soigneusement le meilleur modèle pour les objectifs visés de l’étude.

Cet article vise à décrire la méthodologie utilisée pour évaluer les toxicités associées aux cellules CART, CRS et NI, à l’aide d’un modèle in vivo de xénogreffe dérivée de patients (PDX) LAL (Figure 1). Plus précisément, dans les méthodes décrites ici, les cellules CART19 générées dans le laboratoire des auteurs sont utilisées selon les protocoles décrits précédemment. En bref, les lymphocytes T humains sont isolés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de donneurs sains par une technique de gradient de densité, stimulés avec des billes CD3/CD28 au jour 0 et transduits lentiviraux le jour 1 avec des CARs composés d’un fragment variable à chaîne unique ciblant CD19 fusionné aux domaines de signalisation 4-1BB et CD3ζ. Ces cellules CART sont ensuite dilatées, déperlées le jour 6 et cryoconservées le jour 8 26,27,28,29,30. Comme indiqué précédemment, les souris sont soumises à un traitement lymphodéplétif, suivi de l’administration de blastes leucémiques dérivés du patient (LAL)²⁸. Tout d’abord, la greffe de tumeur est vérifiée par prélèvement de sang sous-maxillaire. Après l’établissement d’une charge tumorale appropriée, des cellules CART19 sont administrées aux souris. Ensuite, les souris sont pesées quotidiennement pour évaluer leur bien-être. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) chez les petits animaux est effectuée pour évaluer l’IN, ainsi que le saignement de la queue pour évaluer l’expansion des lymphocytes T et la production de cytokines / chimiokines. Les techniques décrites ci-dessous sont fortement recommandées pour être utilisées comme modèle pour étudier les toxicités associées aux cellules CART dans un modèle PDX.

Protocol

Ce protocole suit les directives du comité d’examen institutionnel (IRB), du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC A00001767) et du comité institutionnel de biosécurité (IBC, Bios00000006.04) de la Mayo Clinic. NOTE: Tous les matériaux utilisés pour travailler avec les souris doivent être stériles. 1. Injection de busulfan à des souris NSG Obtenir des souris mâles immunodéprimées âgées de 8 à…

Representative Results

L’objectif de ce protocole est d’évaluer les toxicités associées aux cellules CART à l’aide d’un modèle de souris PDX à partir de cellules tumorales de patients atteints de LAL (Figure 1). Tout d’abord, les souris NSG ont reçu des injections i.p. de busulfan (30 mg / kg) dans le but de les immunosupprimer et de faciliter la greffe de cellules CART28. Le lendemain, ils ont reçu ~5 × 106 PBMC (i.v.) dérivés de TOUS les patients. Les souri…

Discussion

Dans ce rapport, une méthodologie pour évaluer les toxicités associées aux cellules CART à l’aide d’un modèle ALL PDX a été décrite. Plus précisément, ce modèle cherche à imiter deux toxicités potentiellement mortelles, CRS et NI, que les patients éprouvent souvent après la perfusion de cellules CART. Il récapitule de nombreuses caractéristiques des toxicités CART observées en clinique : perte de poids, dysfonctionnement moteur, neuroinflammation, production de cytokines inflammatoires et de chimi…

Materials

APC Anti-Human CD19	Biolegend	302211
Alcohol Prep Pad	Wecol	6818
Analyze 14.0 software	AnalyzeDirect Inc.	N/A	https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum)	Akorn	17478-062-35	Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution	BD	349202	Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes	BD	329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45	Biolegend	304032
Bruker Avance II 7 Tesla	Bruker Biospin	N/A	MRI machine
Busulfan (NSC-750)	Selleckchem	S1692
CountBright absolute counting beads	Invitrogen	C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2	Beckman Coulter	C10343	flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190-144
ERT Control/Gating Module	SA Instruments	Model 1030	Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum	Millipore Sigma	F8067
Hemocytometer	Bright-Line	Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US	Corning	35-060-CI
Isoflurane (Liquid)	Sigma-Aldrich	792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation	Invitrogen	L34966
Microvette 500 Lithium heparin	Sarstedt	20.1345.100	Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel	Millipore Sigma	HCYTMAG-60K-PX38	Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan	Ge Healthcare Inc.	0407-0690-10	Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45	Biolegend	103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid	Gibco	10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube	Corning	352008
Sodium Azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical	7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade	Bard-Parker	371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza	04-418Q