JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Akut Lenfoblastik Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modeli Kullanılarak Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi İlişkili Toksisitelerin Değerlendirilmesi

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64535
, , , , , , , ,
1T Cell Engineering Laboratory,Mayo Clinic, Rochester, 2Division of Hematology,Mayo Clinic, Rochester, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences,Mayo Clinic, Rochester, 4Department of Molecular Medicine,Mayo Clinic, Rochester, 5Regenerative Sciences PhD Program,Mayo Clinic, Rochester, 6Department of Immunology,Mayo Clinic, Rochester

Summary

Burada, akut lenfoblastik lösemi hastası kaynaklı ksenogreft modelinin, CD19 hedefli kimerik antijen reseptörü T hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek ve izlemek için bir strateji olarak kullanıldığı bir protokol tanımlanmıştır.

Abstract

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, birden fazla CD19 + malignite tipinin tedavisi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve bu da yakın zamanda birkaç CD19 hedefli CART (CART19) hücre tedavisinin FDA onayına yol açmıştır. Bununla birlikte, CART hücre tedavisi, kendi morbidite ve mortalitelerini taşıyan benzersiz bir dizi toksisite ile ilişkilidir. Buna sitokin salınım sendromu (CRS) ve nöroinflamasyon (NI) dahildir. Klinik öncesi fare modellerinin kullanımı, hem CART etkinliğini hem de CART toksisitesini değerlendirmek için CART teknolojisinin araştırılması ve geliştirilmesinde çok önemli olmuştur. Bu adoptif hücresel immünoterapiyi test etmek için mevcut preklinik modeller arasında sinjeneik, ksenogreft, transgenik ve insanlaştırılmış fare modelleri bulunur. İnsan bağışıklık sistemini sorunsuz bir şekilde yansıtan tek bir model yoktur ve her modelin güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bu yöntem makalesi, CART19 ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI’yi değerlendirmek için bir strateji olarak akut lenfoblastik lösemili hastalardan lösemik blastlar kullanan hasta kaynaklı bir ksenogreft modelini tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu modelin, klinikte görüldüğü gibi terapötik etkinliğin yanı sıra CART19 ile ilişkili toksisiteleri özetlediği gösterilmiştir.

Introduction

Kimerik antijen reseptörü T (CART) hücre tedavisi, kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır. Nüks/refrakter akut lenfoblastik lösemi (ALL), büyük B hücreli lenfoma, manto hücreli lenfoma, foliküler lenfoma ve multipl miyelom 1,2,3,4,5,6,7 tedavisinde başarılı olduğu kanıtlanmıştır ve bu da son FDA onaylarına yol açmıştır. Klinik çalışmalardaki ilk başarıya rağmen, CART hücre tedavisi ile tedavi, genellikle şiddetli ve bazen ölümcül olan toksisitelere neden olur. CART hücre tedavisinden sonra en yaygın toksisiteler, immün efektör hücre ile ilişkili nörotoksisite sendromu (ICANS) olarak da adlandırılan CRS ve NI’nin gelişimini içerir8,9. CRS, CART hücrelerinin in vivo aşırı aktivasyonu ve büyük genişlemesi nedeniyle ortaya çıkar ve daha sonra interferon-γ, tümör nekroz faktörü-α, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve interlökin-6 (IL-6) dahil olmak üzere çoklu inflamatuar sitokinlerin salgılanmasına yol açar. Bu durum hipotansiyon, yüksek ateş, kılcal damar kaçağı sendromu, solunum yetmezliği, çoklu organ yetmezliği ve bazı durumlarda ölümle sonuçlanır10,11. CRS, CART19 hücre tedavisinden sonra vakaların% 50-100’ünde gelişir11,12,13. ICANS, CART hücre tedavisi ile ilişkili bir başka benzersiz advers olaydır ve genelleştirilmiş serebral ödem, konfüzyon, obtundasyon, afazi, motor güçsüzlük ve bazen nöbetler ile karakterizedir 9,14. Hastaların %70’ine kadar herhangi bir ICANS derecesi görülür ve hastaların %20-30’unda Derece 3-4 bildirilir 5,10,15,16. Genel olarak, CRS ve ICANS yaygındır ve ölümcül olabilir.

CART hücre tedavisinden sonra ICANS’ın yönetimi zordur. ICANS’lı hastaların çoğu, genellikle IL-6 reseptör antagonisti tocilizumab veya steroidler18 ile tedavi edilebilen CRS17’yi de yaşar. Önceki bir rapor, tocilizumab ile erken müdahalenin şiddetli CRS oranını azalttığını, ancak ICANS19’un insidansını veya şiddetini etkilemediğini ortaya koydu. Şu anda, ICANS için etkili bir tedavi veya profilaktik ajan yoktur ve önleyici stratejilerin araştırılması çok önemlidir20.

Miyeloid hücrelerin ve ilişkili sitokinlerin/kemokinlerin, CRS ve ICANS21’in gelişiminin ana itici güçleri olduğu düşünülmektedir. KRS, sitokinlerin aşırı yükselmesi ve T hücre genişlemesi ile doğrudan ilişkili olsa da, ICANS’ın patofizyolojisi büyük ölçüde bilinmemektedir22,23. Bu nedenle, mekanizmaları incelemek ve önleyici stratejiler geliştirmek için CART hücre tedavisinden sonra bu toksisiteleri özetleyen bir fare modeli oluşturmak zorunludur.

Şu anda CART hücrelerinin etkinliğini incelemek, optimize etmek ve doğrulamak ve ayrıca ilişkili toksisitelerini izlemek için kullanılan çok sayıda klinik öncesi hayvan modeli vardır. Bunlar, primat modellerine ek olarak sinjeneik, ksenogreft, immünokompetan transgenik, insanlaştırılmış transgenik ve hasta kaynaklı ksenogreft farelerini içerir. Bununla birlikte, bu modellerin her birinin dezavantajları vardır ve bazıları CART hücrelerinin gerçek etkinliğini veya güvenlik endişelerini yansıtmamaktadır24,25. Bu nedenle, çalışmanın amaçlanan hedefleri için en iyi modeli dikkatlice seçmek zorunludur.

Bu makale, ALL hastadan türetilmiş bir ksenogreft (PDX) in vivo model kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri, CRS ve NI’yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiyi açıklamayı amaçlamaktadır (Şekil 1). Spesifik olarak, burada açıklanan yöntemlerde, yazarların laboratuvarında üretilen CART19 hücreleri, daha önce açıklanan protokoller izlenerek kullanılır. Kısaca, insan T hücreleri, sağlıklı donör periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) bir yoğunluk gradyan tekniği ile izole edilir, 0. günde CD3/CD28 boncukları ile uyarılır ve 1. günde 4-1BB ve CD3ζ sinyal alanlarına kaynaşmış bir CD19 hedefli tek zincirli değişken fragmandan oluşan CAR’larla lentiviral olarak transdüksiyona tabi tutulur. Bu CART hücreleri daha sonra genişletilir, 6. günde boncukları çıkarılır ve 8. günde 26,27,28,29,30. günde dondurularak saklanır. Daha önce belirtildiği gibi, fareler lenfodeplesyon tedavisine tabi tutulur, ardından hasta kaynaklı lösemik blastlar (ALL) uygulanır28. İlk olarak, tümör aşılaması submandibular kan alma yoluyla doğrulanır. Uygun bir tümör yükünün oluşturulmasını takiben, CART19 hücreleri farelere uygulanır. Daha sonra, fareler refahı değerlendirmek için günlük olarak tartılır. NI’yi değerlendirmek için küçük hayvan manyetik rezonans görüntüleme (MRI), T hücresi genişlemesini ve sitokin / kemokin üretimini değerlendirmek için kuyruk kanaması ile birlikte yapılır. Aşağıda açıklanan tekniklerin, bir PDX modelinde CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri incelemek için bir model olarak kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Protocol

Bu protokol, Mayo Clinic’in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC A00001767) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi’nin (IBC, Bios00000006.04) yönergelerini takip eder. NOT: Farelerle çalışmak için kullanılan tüm malzemeler steril olmalıdır. 1. NSG farelerine busulfan enjeksiyonu Erkek, 8-12 haftalık, bağışıklığı baskılanmış, NOD-SCID IL2rγnull (NSG) fareler edinin ve enje…

Representative Results

Bu protokolün amacı, ALL’li hastaların tümör hücrelerinden bir PDX fare modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmektir (Şekil 1). İlk olarak, NSG fareleri, immünosupresif hale getirmek ve CART hücre aşılamasını kolaylaştırmak amacıyla i.p. busulfan (30 mg / kg) enjeksiyonları aldı28. Ertesi gün, TÜM hastalardan türetilen ~ 5 × 106 PBMC (i.v.) aldılar. Fareler, kuyruk kanaması testi ile ~ 13 h…

Discussion

Bu raporda, bir ALL PDX modeli kullanarak CART hücresi ile ilişkili toksisiteleri değerlendirmek için bir metodoloji tanımlanmıştır. Daha spesifik olarak, bu model, hastaların CART hücrelerinin infüzyonundan sonra sıklıkla yaşadığı yaşamı tehdit eden iki toksisiteyi, CRS ve NI’yi taklit etmeyi amaçlamaktadır. Klinikte gözlenen CART toksisitelerinin birçok ayırt edici özelliğini özetler: kilo kaybı, motor disfonksiyon, nöroinflamasyon, inflamatuar sitokin ve kemokin üretimi ve farklı efektö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R37CA266344, 1K99CA273304), Savunma Bakanlığı (CA201127), Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RLS) aracılığıyla desteklenmiştir. Ayrıca, Mayo Clinic NMR Çekirdek Tesis personeline teşekkür ederiz. Şekil 1 BioRender.com’de oluşturuldu

Materials

 APC Anti-Human CD19 Biolegend 302211
Alcohol Prep Pad Wecol 6818
Analyze 14.0 software AnalyzeDirect Inc. N/A https://analyzedirect.com/analyze14/
Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) Akorn 17478-062-35 Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness
BD FACS Lysing Solution  BD 349202 Red blood cells lysing buffer
BD Micro-Fin IV insulin syringes BD 329461
Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 Biolegend 304032
Bruker Avance II 7 Tesla  Bruker Biospin N/A MRI machine
Busulfan (NSC-750) Selleckchem S1692
CountBright absolute counting beads Invitrogen C36950
CytoFLEX System B4-R2-V2 Beckman Coulter C10343 flow cytometer
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144 
ERT Control/Gating Module  SA Instruments Model 1030 Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Hemocytometer Bright-Line Z359629-1EA
Human AB Serum; Male Donors; type AB; US Corning 35-060-CI
Isoflurane (Liquid) Sigma-Aldrich 792632
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Microvette 500 Lithium heparin Sarstedt 20.1345.100 Blood collection tube
MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel Millipore Sigma HCYTMAG-60K-PX38 Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines
Omniscan Ge Healthcare Inc. 0407-0690-10 Gadolinium-based constrast agent
Pd Anti-Mouse CD45 Biolegend 103106
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
Round Bottom Polysterene Test tube Corning 352008
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
Stainless Steel Surgical Blade Bard-Parker 371215
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Turtle, C. J., et al. Immunotherapy of non-Hodgkin’s lymphoma with a defined ratio of CD8+ and CD4+ CD19-specific chimeric antigen receptor-modified T cells. Science Translational Medicine. 8 (355), (2016).
  2. Kochenderfer, J. N., et al. Long-duration complete remissions of diffuse large B cell lymphoma after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cell therapy. Molecular Therapy. 25 (10), 2245-2253 (2017).
  3. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma remissions caused by anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with high serum interleukin-15 levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  4. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  5. Park, J. H., et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 449-459 (2018).
  6. Kochenderfer, J. N., et al. Chemotherapy-refractory diffuse large B-cell lymphoma and indolent B-cell malignancies can be effectively treated with autologous T cells expressing an anti-CD19 chimeric antigen receptor. Journal of Clinical Oncology. 33 (6), 540-549 (2015).
  7. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: A systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  8. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T cell therapy: Insights into mechanisms and novel therapies. Frontiers in immunology. 11, 1973 (2020).
  9. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  10. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  11. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 6 (6), 664-679 (2016).
  12. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  13. Locke, F. L., et al. Long-term safety and activity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma (ZUMA-1): A single-arm, multicentre, phase 1-2 trial. The Lancet. Oncology. 20 (1), 31-42 (2019).
  14. Hunter, B. D., Jacobson, C. A. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. Journal of the National Cancer Institute. 111 (7), 646-654 (2019).
  15. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  16. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  17. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).
  18. Lee, D. W., et al. Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome. Blood. 124 (2), 188-195 (2014).
  19. Chen, F., et al. Measuring IL-6 and sIL-6R in serum from patients treated with tocilizumab and/or siltuximab following CAR T cell therapy. Journal of Immunological Methods. 434, 1-8 (2016).
  20. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A concise review of neurologic complications associated with chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  21. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: Implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  22. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  23. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  24. Siegler, E. L., Wang, P. Preclinical models in chimeric antigen receptor-engineered T-cell therapy. Human Gene Therapy. 29 (5), 534-546 (2018).
  25. Mhaidly, R., Verhoeyen, E. Humanized mice are precious tools for preclinical evaluation of CAR T and CAR NK cell therapies. Cancers. 12 (7), 1915 (1915).
  26. Sakemura, R., et al. Development of a clinically relevant reporter for chimeric antigen receptor T-cell expansion, trafficking, and toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  27. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  28. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  29. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Dynamic imaging of chimeric antigen receptor T cells with [18F]tetrafluoroborate positron emission tomography/computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (180), e62334 (2022).
  31. Cox, M. J., Kenderian, S. S., et al. GM-CSF disruption in CART cells modulates T cell activation and enhances CART cell anti-tumor activity. Leukemia. 36 (6), 1635-1645 (2022).
  32. Pirko, I., Suidan, G. L., Rodriguez, M., Johnson, A. J. Acute hemorrhagic demyelination in a murine model of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 5, 31 (2008).
  33. Denic, A., et al. MRI in rodent models of brain disorders. Neurotherapeutics. 8 (1), 3-18 (2011).
  34. Johnson, H. L., et al. CD8 T cell-initiated blood-brain barrier disruption is independent of neutrophil support. Journal of Immunology. 189 (4), 1937-1945 (2012).
  35. Johnson, H. L., et al. Perforin competent CD8 T cells are sufficient to cause immune-mediated blood-brain barrier disruption. PLoS One. 9 (10), 111401 (2014).
  36. Huggins, M. A., et al. Perforin expression by CD8 T cells is sufficient to cause fatal brain edema during experimental cerebral malaria. Infection and Immunity. 85 (5), 00985 (2017).
  37. Pennell, C. A., et al. Human CD19-targeted mouse T cells induce B cell aplasia and toxicity in human CD19 transgenic mice. Molecular Therapy. 26 (6), 1423-1434 (2018).
  38. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  39. Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology. 27 (7), 1190-1198 (2016).
  40. Mardiana, S., et al. A multifunctional role for adjuvant anti-4-1BB therapy in augmenting antitumor response by chimeric antigen receptor T cells. 암 연구학. 77 (6), 1296-1309 (2017).
  41. Pegram, H. J., et al. Tumor-targeted T cells modified to secrete IL-12 eradicate systemic tumors without need for prior conditioning. Blood. 119 (18), 4133-4141 (2012).
  42. Kalscheuer, H., et al. A model for personalized in vivo analysis of human immune responsiveness. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  43. Xia, J., et al. Modeling human leukemia immunotherapy in humanized mice. EBioMedicine. 10, 101-108 (2016).
  44. Holzapfel, B. M., Wagner, F., Thibaudeau, L., Levesque, J. P., Hutmacher, D. W. Concise review: humanized models of tumor immunology in the 21st century: Convergence of cancer research and tissue engineering. Stem Cells. 33 (6), 1696-1704 (2015).
  45. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).

Tags

CAR-TAcute Lymphoblastic LeukemiaPatient-derived XenograftToxicity AssessmentMotor WeaknessWeight LossCytokine AnalysisMRI ImagingBreathing MonitoringParaVision Software

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manriquez Roman, C., Sakemura, R. L., Kimball, B. L., Jin, F., Khadka, R. H., Adada, M. M., Siegler, E. L., Johnson, A. J., Kenderian, S. S. Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model. J. Vis. Exp. (192), e64535, doi:10.3791/64535 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image