زراعة وتجميد ومعالجة وتصوير عضويات وكرويات كاملة أثناء وجودها في هيدروجيل

Summary

تصف هذه الدراسة منهجيات زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ ووضع العلامات وفحص كرويات وعضويات كاملة تحت مجاهر مختلفة ، بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز متعدد الأغراض.

Abstract

أصبحت الكائنات العضوية والكروية ، وهي هياكل متنامية ثلاثية الأبعاد في مختبرات زراعة الخلايا ، معترف بها بشكل متزايد كنماذج متفوقة مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، لأنها تحاكي جسم الإنسان بشكل أفضل ولها مزايا على الدراسات على الحيوانات. ومع ذلك ، تواجه هذه الدراسات عادة مشاكل في التكاثر والاتساق. خلال العمليات التجريبية الطويلة – مع نقل المواد العضوية والكروية بين أوعية زراعة الخلايا المختلفة ، والماصات ، وأجهزة الطرد المركزي – غالبا ما تتلف هذه الهياكل المتنامية 3D الحساسة والهشة أو تضيع. في النهاية ، تتأثر النتائج بشكل كبير ، لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. تقلل الطرق الموضحة هنا من هذه الخطوات المجهدة وتضمن بيئة آمنة ومتسقة للعضويات والكروية طوال تسلسل المعالجة بينما لا تزال في هيدروجيل في جهاز متعدد الأغراض. يمكن للباحثين أن ينمووا ، ويتجمدوا ، ويذوبوا ، ويعالجوا ، ويلطخوا ، ويلصقوا ، ثم يفحصون بنية الكائنات العضوية أو الكروية تحت أدوات مختلفة عالية التقنية ، من المجاهر البؤرية إلى المجاهر الإلكترونية ، باستخدام جهاز واحد متعدد الأغراض. تعمل هذه التقنية على تحسين قابلية استنساخ الدراسات وموثوقيتها وصلاحيتها ، مع الحفاظ على بيئة مستقرة ووقائية للهياكل المتنامية 3D أثناء المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخلص من الخطوات المجهدة يقلل من أخطاء المعالجة ، ويقلل من الوقت المستغرق ، ويقلل من خطر التلوث.

Introduction

يكمن مستقبل أبحاث الخلايا والعلاج في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد¹،^2،3. تعمل النماذج العضوية والكروية على سد الفجوة بين التجارب في المختبر والنماذج الحيوانية من خلال إنشاء نماذج أفضل تحاكي نمو جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء والأمراض⁴،⁵،⁶،⁷،^8،9. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ وتكرار هذه النماذج لا تزال صعبة. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع هذه الهياكل وحصادها ونقلها وطردها بالطرد المركزي باستخدام التقنيات الحالية يؤدي إلى فقدان أو تلف المواد العضوية والكروية في العديد من الظروف ، مما يؤثر بشكل كبير على النتائج.

على الرغم من العديد من البروتوكولات الخاصة بالتلوين النسيجي ، والتلوين الكيميائي المناعي ، ووضع العلامات المناعية ، والحفظ بالتبريد ، لا يوجد نهج عالمي يتعلق بتوحيد الظروف التجريبية ، والتعامل مع هذه الهياكل الحساسة ومعالجتها دون فقدانها أو إتلافها. البروتوكولات الحالية هي أيضا طويلة بشكل لا يصدق ، بالتناوب من بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، وتشمل إجراءات معقدة مع الكواشف المختلفة¹⁰،^11،12،^13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحصاد ، والماصات ، والطرد المركزي ، ونقل الهياكل المتنامية 3D بين أوعية زراعة الخلايا و cryovials تسبب تغييرات في وضع الهياكل والقوى الميكانيكية ، وتؤثر في النهاية على تمايز ونضج المواد العضوية والكروية. تم الإبلاغ عن أن طوبولوجيا الأنسجة ، وتحديد مواقع الخلايا ، والقوى الميكانيكية تؤثر بشكل كبير على تمايز الخلايا ونضجها⁶،¹⁵،^16،17.

لذلك ، من المستحسن تحسين التقنيات التقليدية الحالية لتوليد المواد العضوية والكروية بجودة مستقرة. إن الطريقة / الجهاز الذي سيتخطى الطرد المركزي والخطوات الأخرى الموضحة أعلاه ويوفر المواد في بيئة آمنة واحدة من بداية العمليات المتعددة إلى نهايتها سيكون مفيدا للوصول إلى البيانات الأكثر اتساقا وموثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تقليل قيود الوقت والعمالة والتكلفة.

يوفر الجهاز متعدد الأغراض (MD) الموصوف هنا بيئة آمنة واحدة لعمليات متعددة من المواد العضوية والكروية (الشكل التكميلي 1). يلغي هذا الجهاز والبروتوكولات المكملة خطوات الحصاد والماصات والنقل والطرد المركزي. تبقى المواد العضوية والكروية في بيئتها المختبرية أثناء العمليات المتسلسلة. تتكون هذه البيئة بشكل أساسي من مكونات مصفوفة خارج الخلية طبيعية أو اصطناعية ، مثل الهلاميات المائية المتاحة تجاريا. بمعنى آخر ، تسمح الطرق الموضحة هنا بمعالجة عينة كاملة من المواد العضوية / الكروية وفحصها وتجميدها أثناء وجودها في قطرة هيدروجيل.

الجهاز المتوافق حيويا مقاوم لدرجات الحرارة بين 60 درجة مئوية و -160 درجة مئوية ، مما يجعل من الممكن استعادة المواد العضوية / المنشطات في خزان النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية أو تحضير كتل الراتنج للمجهر الإلكتروني عند 60 درجة مئوية. تم تصميم مكانة الجهاز لتحديد مساحة محدودة للهياكل المتنامية ثلاثية الأبعاد وتحفيز تكوين الأجسام الكروية أو العضوية بناء على الدراسات السابقة¹⁸،¹⁹،^20،21،^22،23. هذا الجزء من الجهاز شفاف ويحتوي على بلاستيك محدد يوفر جودة بصرية عالية (معامل الانكسار: 1.43 ؛ قيمة آبي: 58 ؛ السماكة: 7.8 مل [0.0078 بوصة أو 198 ميكرومتر]). يتسبب كل من الكوة والجزء “الجانبي” المحيط في التألق الذاتي. تبلغ مساحة الكوة الشفافة في الوسط 80 مم 2 ، بينما يبلغ الجزء الجانبي 600 مم². عمق الحاوية 15 مم ، وسمكها 1.5 مم. هذه الميزات ، بالإضافة إلى حجم وتصميم الجهاز ، تجعل من الممكن إجراء ملاحظات تحت أنواع مختلفة من المجهر عالي التقنية وإعداد العينات للفحوصات المجهرية الإلكترونية (الشكل 2). يوفر نظام إغلاق الجهاز وضعين ، أحدهما مغلق في الثلاجة والآخر يسمح بتدفق الغاز في الحاضنة. تظهر فحوصات انتشار CCK8 والسمية الخلوية تأثيرات مماثلة على الخلايا مقارنة بأطباق زراعة الخلايا التقليدية (الشكل التكميلي 2). يوضح اختبار استبعاد التريبان الأزرق قابلية عالية للخلايا (94٪) أثناء زراعة الخلايا في MD (الشكل 3).

تشمل العمليات التي يمكن إجراؤها لعينة واحدة في الجهاز الواحد (1) الزراعة ، (2) التلوين النسيجي ، (3) التلطيخ المناعي ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية الكيميائية والتألقية المناعية ، (4) التجميد ، (5) الذوبان ، (6) الفحص تحت المجاهر الضوئية ، مثل برايتفيلد ، داركفيلد ، مضان ، مجاهر ، بؤرية ، وفائقة الدقة ، (7) طلاء وفحص مباشرة تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، أو (8) التحضير للمجهر الإلكتروني النافذ ( الشكل 2).

توجد منهجيات مختلفة للتلطيخ النسيجي ، أو وضع العلامات المناعية الكيميائية ، أو وضع العلامات الفلورية على المواد العضوية والكروية 10،¹¹،¹²،¹³،¹⁴،^24،25. حصادها من هيدروجيل هو الخطوة الأولى والرئيسية للتكنولوجيا الحالية. بعد هذه الخطوة ، تسمح بعض الطرق بوضع العلامات المناعية بالكامل. يتم تضمين المواد العضوية المحصودة في البارافين ، مجزأة ، وموسومة للتلطيخ والمناعة في الآخرين. ومع ذلك ، قد لا تقدم الأقسام العينة بأكملها وتوفر بيانات محدودة فقط تتعلق ببنية 3D للهيكل. علاوة على ذلك ، فإن الأضرار التي لحقت بهذه الهياكل 3D وفقدان المستضدات هي الآثار الجانبية المعروفة لهذه التقنيات.

تسمح البروتوكولات الجديدة التكميلية للفحوصات المجهرية في هذه المقالة بتحليل عينات كاملة لا تزال في هيدروجيل. تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا تركيبتين مطورتين حديثا: محلول للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC) ومحلول لوضع العلامات المناعية (S-IF). تسمح طرق هذه الحلول للباحثين بالحصول على بيانات أكثر دقة ، حيث لا توجد آثار ضارة لسير العمل التقليدي ، مثل الطرد المركزي ، وسحب العينات ، ونقل الهياكل الحساسة. يلغي البروتوكول الموصوف هنا أيضا الحاجة إلى خطوات الحصاد والحجب والتطهير واسترجاع المستضد ، ويقصر الإجراء بأكمله إلى 6-8 ساعات. علاوة على ذلك ، تسمح المنهجية بإضافة واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة في وقت واحد إلى نفس S-IF. لذلك ، من الممكن الحصول على النتائج في نفس اليوم حتى بعد تجارب وضع العلامات المتعددة ، وهي ميزة أخرى للبروتوكول الموصوف هنا ؛ عادة ما تستغرق بروتوكولات وضع العلامات المناعية التقليدية الكاملة ما بين 3 أيام وعدة أسابيع¹⁰،^11،12،^13،14.

كما تم حذف تضمين البارافين ، وهو خطوة ضارة أخرى تقلل من المستضد. يبقى هيكل 3D في بيئته في المختبر من بداية إلى نهاية الفحص المجهري. نظرا لأن بنية 3D لا تزال في ظروف نموها ، فإن تعبير البروتين وبيانات التوطين تحاكي ظروف الجسم الحي بشكل أفضل. من المتوقع الحصول على نتائج أكثر دقة ، لأن المنهجية تلغي الخطوات التي تؤثر على تعبير مستضد العينة. يوضح الجدول 1 والجدول 2 كيف أن هذه البروتوكولات الجديدة تلغي الخطوات ، وتوفر الوقت والعمل في المختبر ، وتقلل التكاليف ومنتجات النفايات مقارنة بسير العمل التقليدي.

بالإضافة إلى الخطوات الحاسمة الموضحة أعلاه ، هناك مشكلة أخرى تتمثل في توفير وسيط حفظ بالتبريد وطريقة للحفاظ على بنية 3D للعينة بمعدلات صلاحية خلية أعلى²⁶،²⁷،^28،29،^30،31. يعد الحفظ بالتبريد ضروريا لإنشاء نظام نموذجي مستقر وتمكين البنوك الحيوية للعضويات والكروية^32,33. البنوك الحيوية سيسمح هيكل 3D الأصلي بأكمله بتلخيص أكثر إخلاصا للحالة الطبيعية للصحة أو المرض. الاعتبارات الرئيسية هي راحة وموثوقية الحفظ بالتبريد وذوبان المواد العضوية / الكروية. الانتعاش العضوي بعد الذوبان منخفض جدا في معظم التقنيات الحالية ، وغالبا ما يكون أقل من 50٪. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة نتائج واعدة مع تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة²⁶،²⁷،^28،29. أظهر Lee et al. أن 78٪ من الخلايا الكروية نجت بعد الحفظ بالتبريد عندما استخدموا محلول جامعة ويسكونسن الذي يحتوي على 15٪ DMSO²⁸. زادت نسبة بقاء الخلية إلى 83٪ في دراسة Arai et ^al.29. ومع ذلك ، تتأثر النتائج بعد الحفظ بالتبريد بشكل كبير لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكواشف الخالية من المصل مطلوبة لممارسة التصنيع الجيدة في الإعدادات الصيدلانية والتشخيصية. تستخدم تدفقات العمل التقليدية وسيطا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لطريقة التجميد البطيء ، وكلاهما مرتبط بالإعاقات. FBS هو منتج مشتق من الحيوانات ويمكن أن يكون له اختلافات في الدفعات. DMSO هو مادة واقية من التبريد ناجحة للغاية ، ولكن التعرض طويل الأمد ، خاصة أثناء الذوبان ، قد يسبب تأثيرات سامة للخلايا^30,31.

توضح هذه المقالة أيضا منهجية التجميد / الذوبان للعضويات أو الكرويات بأكملها أثناء وجودها في هيدروجيل. تم استخدام صيغتين لتجميد المواد العضوية والكروية في الدراسة: (1) 10٪ DMSO يحتوي على محلول تجميد تقليدي (FS) و (2) وسط حفظ بالتبريد خال من المصل و DMSO. يحتوي وسيط الحفظ بالتبريد هذا على مكونات مصفوفة خارج الخلية ، والتي تختلف عن الصيغ الحالية. تتكون المصفوفة خارج الخلية من فئتين رئيسيتين من الجزيئات الكبيرة ، البروتيوغليكان ، والبروتينات الليفية ، والتي تعتبر ضرورية للسقالات الفيزيائية للمكونات الخلوية ، ولكنها تبدأ أيضا العمليات المطلوبة لتشكل الأنسجة والتمايز والتوازن³⁴،35،36،37،³⁸،^39،40 . توفر الكولاجين قوة الشد ، وتنظم التصاق الخلايا ، وتدعم الانجذاب الكيميائي والهجرة ، وتطور الأنسجة المباشر³⁷. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ألياف الإيلاستين ارتدادا للأنسجة التي تخضع لتمدد متكرر³⁸. يوجه بروتين ليفي ثالث ، الفبرونيكتين ، تنظيم المصفوفة الخلالية خارج الخلية وله دور حاسم في التوسط في ارتباط الخلية ويعمل كمنظم ميكانيكي خارج الخلية³⁹. أظهر Du et al. التأثير الواقي من البرودة لهيدروليزات كولاجين الدجاج على نظام نموذج الأكتوميوسين الطبيعي⁴¹. تشير نتائجهم إلى أن تحلل الكولاجين يمكن أن يمنع نمو بلورات الجليد ، ويقلل من تمسخ تجميد البروتين والأكسدة بشكل مشابه للمواد الواقية من التبريد التجارية ، ويوفر بنية هلام أفضل بعد دورات التجميد والذوبان. لذلك ، فإن إضافة مكونات المصفوفة خارج الخلية إلى وسائط الحفظ بالتبريد توفر بيئة أكثر أمانا وحماية للعينة وتدعم الهياكل الحية للشفاء بعد التجميد والذوبان.

بالإضافة إلى ذلك ، تصف الدراسة الحالية بروتوكولا مباشرا لتسمية الأغشية السيتوبلازمية ونوى الكائنات العضوية الحية والكروية أثناء وجودها في الهيدروجيل.

Protocol

1. زراعة المواد العضوية والكروية ضع الهيدروجيل على الثلج طوال الليل (في الثلاجة أو غرفة باردة) ليذوب. ضع الجهاز متعدد الأغراض المتاح تجاريا (MD ؛ انظر جدول المواد) في الحاضنة قبل يوم واحد من التجربة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للتدفئة. ضع أطراف ماصة معقمة عريض?…

Representative Results

تمثل هذه المقالة جهازا متعدد الأغراض (MD) ومنهجيات تكميلية للزراعة والتجميد والذوبان والتلوين النسيجي والتلوين الكيميائي المناعي ووضع العلامات المناعية والطلاء ومعالجة المواد العضوية أو الكروية بأكملها بينما لا تزال في هيدروجيل في بيئة واحدة مصممة بشكل فريد. تم تصميم الدراسة الحالية لإ?…

Discussion

MD ، المكمل للتركيبات والبروتوكولات الموصوفة هنا ، يسهل النمو السريع والعفوي 3D للعضويات والكروية في بيئة أكثر تحكما ويواصل التجربة في نفس الظروف. تبقى العينة في نفس البيئة خلال العملية بأكملها ، ويبقى ما يقرب من 100٪ من البنى المتنامية 3D سليمة في الحاوية. هذا يحسن التجانس أثناء التجارب المت?…

Materials

Absolute Ethanol (EtOH)	Merck	8187602500	Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone	Merck	8222512500	Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody	Biocare Medical	CP 028 A	Store at +4 °C
Anti-albumin antibody	Abcam	EPR20195	Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal	Abcam	134435	Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5	Abcam	53121	Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody	Biocare Medical	ACI 3058 A, B	Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-500G	Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)	Abcam	ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL	Nest	601051
Centrifuge tubes, 50 mL	Nest	602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 Incubator	Panasonic	KM-CC17RU2
Copper Grids	Electron Microscopy Sciences	G100-Cu	Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer	Leica	EM CPD300	For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture	Sigma Aldrich	AEC101	Store at +4 °C
Diamond knife	Diatome	Ultra 45°, 40-US	Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology	Biofroxx	67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes	Nest
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	41966-029	Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic	Bright Slide	2.BS01-105-1000
Epon resin	Sigma	45359-1EA-F	Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier	Pan Biotech	P30-3304	Store at +4 °C
Freezing Solution (FS)	Cellorama	CellO-F	Store at +4 °C
Glass knife maker	Leica	EM KMR3	For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)	Leica	7890-08	Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%	Electron Microscopy Sciences	16210	Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution	Sigma Aldrich	56-81-5	Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647	Invitrogen	A32933	Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488	Invitrogen	35502	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550	Invitrogen	84540	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488	Invitrogen	35552	Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550	Invitrogen	84541	Store at +4 °C
Hematoxylin Harris	Bright Slide	2.BS01-104-1000
HepG2 cells	ATCC	HB-8065	Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6	R&D Systems	MAB2020	Store at -20 °C
Hydrogel	Corning	354248	Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel	Corning	354234	Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel	ThermoFischer Scientific	A1413201	Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel	Biotechne, R&D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative			%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid	Sigma	11189-100G	Store at RT
Lead aspartate solution			Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate	Electron Microscopy Sciences	17900	Store at RT
Leica Confocal Microscope	Leica	DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss
Microplate reader	Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD)	Cellorama	CellO-M
Nuclear-DNA stain	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain	ThermoFischer Scientific	62248	DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%	Electron Microscopy Sciences	19190	Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody	R&D systems	MAB2020	Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%	Sigma	1.04005.1000	Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets	MP Biomedicals, LLC	2810305
Post-fixative solution			%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%	Electron Microscopy Sciences	26603-01	Store at RT
Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS	Zeiss	Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL	Nest	620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment	Zeiss	GeminiSEM 500	We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack	ScyTek Laboratories	SHP125	Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2	Electron Microscopy Sciences	11655	Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)	Cellorama	CellO-IF	Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)	Cellorama	CellO-P	Store at +4 °C
Specimen trimming device	Leica	EM TRIM2	For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater	Leica	EM ACE200	Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma	223220-5G	Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Ultra gel super glue	Pattex	PSG2C	For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome	Leica	EM UC7	For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL	Nest	171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL	Isolab	L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL	Nest	110919HA01
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400	Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT