תרבות, הקפאה, עיבוד והדמיה של אורגנואידים וספרואידים שלמים בעודם בהידרוג'ל
Summary
המחקר הנוכחי מתאר מתודולוגיות לתרבות, הקפאה, הפשרה, עיבוד, צביעה, תיוג ובחינה של ספרואידים ואורגנואידים שלמים תחת מיקרוסקופים שונים, בעוד שהם נשארים שלמים בהידרוג’ל בתוך מכשיר רב תכליתי.
Abstract
אורגנואידים וספרואידים, מבני גידול תלת-ממדיים במעבדות של תרביות תאים, הופכים מוכרים יותר ויותר כמודלים מעולים בהשוואה למודלים של תרביות דו-ממדיות, מכיוון שהם מחקים את גוף האדם טוב יותר ויש להם יתרונות על פני מחקרים בבעלי חיים. עם זאת, מחקרים אלה בדרך כלל להתמודד עם בעיות עם שכפול ועקביות. במהלך התהליכים הניסיוניים הארוכים – עם העברות של אורגנואידים וספרואידים בין כלי תרבית תאים שונים, פיפטינג וצנטריפוגות – מבני הגידול התלת-ממדיים הרגישים והשבריריים האלה נפגעים לעתים קרובות או הולכים לאיבוד. בסופו של דבר, התוצאות מושפעות באופן משמעותי, שכן מבנים 3D לא יכול לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. השיטות המתוארות כאן ממזערות את הצעדים המלחיצים הללו ומבטיחות סביבה בטוחה ועקבית עבור אורגנואידים וספרואידים לאורך כל רצף העיבוד בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג’ל במכשיר רב תכליתי. החוקרים יכולים לגדל, להקפיא, להפשיר, לעבד, להכתים, לסמן ולאחר מכן לבחון את המבנה של אורגנואידים או ספרואידים תחת מכשירי היי-טק שונים, ממיקרוסקופים קונפוקליים ועד אלקטרונים, באמצעות מכשיר רב-תכליתי יחיד. טכנולוגיה זו משפרת את יכולת השכפול, האמינות והתוקף של המחקרים, תוך שמירה על סביבה יציבה ומגנה עבור מבני הגידול התלת-ממדיים במהלך העיבוד. בנוסף, ביטול צעדים מלחיצים ממזער טעויות טיפול, מפחית את הזמן שלוקח ומפחית את הסיכון לזיהום.
Introduction
עתיד המחקר והטיפול בתאים טמון בתרביות תאים תלת-ממדיות 1,2,3. מודלים אורגנואידים וספרואידים סוגרים את הפער בין ניסויים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים על ידי יצירת מודלים טובים יותר המחקים את התפתחות גוף האדם, פיזיולוגיה ומחלות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, יכולת השכפול והחזרה של מודלים אלה נותרה מאתגרת. יתר על כן, טיפול, קציר, העברה וצנטריפוגה של מבנים אלה בטכנולוגיות הנוכחיות גורמים לאובדן או נזק של האורגנואידים והספרואידים בתנאים רבים, ומשפיעים באופן משמעותי על התוצאות.
למרות פרוטוקולים רבים לצביעה היסטולוגית, צביעה אימונוהיסטוכימית, תיוג אימונופלואורסצנטי ושימור בהקפאה, אין גישה אוניברסלית הקשורה לסטנדרטיזציה של תנאי ניסוי, טיפול ועיבוד מבנים עדינים אלה מבלי לאבד או לפגוע בהם. הפרוטוקולים הנוכחיים הם גם ארוכים להפליא, לסירוגין בין כמה ימים למספר שבועות, וכוללים הליכים מורכבים עם ריאגנטים שונים 10,11,12,13,14. בנוסף, קציר, פיפטציה, צנטריפוגה והעברת מבני גידול תלת-ממדיים בין כלי תרבית תאים וקריביאלים גורמים לשינויים במיקום המבנים והכוחות המכניים, ובסופו של דבר משפיעים על ההתמיינות וההבשלה של האורגנואידים והספרואידים. דווח כי טופולוגיה של רקמות, מיקום התאים וכוחות מכניים משפיעים באופן משמעותי על התמיינות התאים והבשלתם 6,15,16,17.
לכן, רצוי לשפר את הטכנולוגיות הקונבנציונליות הנוכחיות כדי ליצור אורגנואידים וספרואידים באיכות יציבה. שיטה/מכשיר שידלג על הצנטריפוגה ועל שלבים אחרים שתוארו לעיל ויספק את החומר בסביבה בטוחה אחת מההתחלה ועד הסוף של התהליכים המרובים יועיל להגיע לנתונים העקביים והאמינים ביותר. בנוסף, זה יפחית את מגבלות הזמן, העבודה והעלויות.
ההתקן הרב-תכליתי (MD) המתואר כאן מספק סביבה בטוחה אחת לתהליכים מרובים של אורגנואידים וספרואידים (איור משלים 1). התקן זה ופרוטוקולים משלימים מבטלים את שלבי הקציר, הפיפטציה, ההעברה והצנטריפוגה. האורגנואידים והספרואידים נשארים בסביבת המבחנה שלהם במהלך התהליכים הרציפים. סביבה זו כוללת בעיקר רכיבי מטריצה חוץ-תאית טבעיים או סינתטיים, כמו הידרוג’לים זמינים מסחרית. במילים אחרות, השיטות המתוארות כאן מאפשרות לעבד, לבחון ולהקפיא דגימה שלמה של אורגנואידים/ספרואידים בעודה בתוך טיפת הידרוג’ל.
המכשיר התואם ביולוגית עמיד לטמפרטורות שבין 60 °C ל-160 °C, מה שהופך אותו אפשרי לשחזר את האורגנואידים / סטרואידים במיכל חנקן נוזלי ב -160 °C או להכין בלוקים שרף עבור מיקרוסקופ אלקטרונים ב 60 °C. הנישה במכשיר תוכננה להגדיר מרחב מוגבל למבני גידול תלת-ממדיים ולעורר היווצרות של ספרואידים או אורגנואידים בהתבסס על המחקרים הקודמים 18,19,20,21,22,23. חלק זה של המכשיר שקוף ומכיל פלסטיק ספציפי המספק איכות אופטית גבוהה (מקדם שבירה: 1.43; ערך abbe: 58; עובי: 7.8 מיל [0.0078 אינץ’ או 198 מיקרומטר]). גם הגומחה וגם החלק ה’צדדי’ שמסביב גורמים לפלואורסצנטיות אוטומטית. הגומחה השקופה במרכזיש 80 מ”מ 2 שטח, בעוד החלק הצדדי הוא 600 מ”מ2. עומק המיכל הוא 15 מ”מ, והעובי הוא 1.5 מ”מ. תכונות אלה, בנוסף לגודלו ולעיצובו של המכשיר, מאפשרות לבצע תצפיות תחת סוגים שונים של מיקרוסקופ היי-טק ולהכין את הדגימות לבדיקות מיקרוסקופיות אלקטרונים (איור 2). מערכת הסגירה של המכשיר מספקת שתי עמדות, האחת אטומה במקפיא והשנייה מאפשרת זרימת גז באינקובטור. מבחני ההתרבות והציטוטוקסיות של CCK8 מדגימים השפעות דומות על התאים בהשוואה למנות המסורתיות של תרביות תאים (איור משלים 2). בדיקת אי-הכללה כחולה של טריפאן מדגימה כדאיות גבוהה של תאים (94%) במהלך תרבית התאים ב-MD (איור 3).
התהליכים שניתן לבצע עבור דגימה אחת במכשיר היחיד כוללים (1) תרבות, (2) צביעה היסטולוגית, (3) אימונוסטינינג, כולל תיוג אימונוהיסטוכימי ואימונופלואורסצנטי, (4) הקפאה, (5) הפשרה, (6) בדיקה תחת מיקרוסקופים אופטיים, כגון שדה בהיר, שדה כהה, פלואורסצנציה, קונפוקל ומיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה, (7) ציפוי ובדיקה ישירות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או (8) הכנה למיקרוסקופ אלקטרונים ( איור 2).
קיימות מתודולוגיות שונות להכתמה היסטולוגית, תיוג אימונוהיסטוכימי, או תיוג פלואורסצנטי של אורגנואידים וספרואידים 10,11,12,13,14,24,25. קצירתם מההידרוג’ל היא הצעד הראשון והעיקרי של הטכנולוגיה הנוכחית. לאחר שלב זה, שיטות מסוימות מאפשרות תיוג חיסוני שלם. האורגנואידים שנקטפו מוטבעים בפרפין, מחולקים ומסומנים להכתמה וחיסונית אצל אחרים. עם זאת, ייתכן שהסעיפים לא יציגו את המדגם כולו ויספקו רק נתונים מוגבלים הקשורים לארכיטקטורה התלת-ממדית של המבנה. יתר על כן, נזק למבנים תלת-ממדיים אלה ואובדן אנטיגניות הם תופעות לוואי ידועות של טכנולוגיות אלה.
הפרוטוקולים החדשים המשלימים לבדיקות מיקרוסקופיות במאמר זה מאפשרים ניתוח של דגימות שלמות שעדיין נמצאות בהידרוג’ל. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים שתי פורמולציות שפותחו לאחרונה: פתרון לאימונוהיסטוכימיה (S-IHC) ופתרון לתיוג אימונופלואורסצנטי (S-IF). השיטות עם פתרונות אלה מאפשרות לחוקרים לקבל נתונים מדויקים יותר, שכן אין השפעות מזיקות של זרימות עבודה מסורתיות, כגון צנטריפוגה, פיפטינג והעברה של המבנים העדינים. הפרוטוקול המתואר כאן גם מבטל את הצורך בשלבי קציר, חסימה, ניקוי ואחזור אנטיגן, ומקצר את כל ההליך ל-6-8 שעות. יתר על כן, המתודולוגיה מאפשרת להוסיף בו זמנית נוגדנים אחד עד שלושה נוגדנים לאותו S-IF. לכן, ניתן לקבל את התוצאות באותו יום גם לאחר ניסויי הסימון המרובים, וזה יתרון נוסף של הפרוטוקול המתואר כאן; פרוטוקולים מסורתיים לתיוג אימונופלואורסצנציה בהרכבה מלאה נמשכים בדרך כלל בין 3 ימים למספר שבועות 10,11,12,13,14.
גם הטמעת פרפין, צעד מזיק נוסף שמפחית את האנטיגניות, מושמטת. המבנה התלת-ממדי נשאר בסביבת המבחנה שלו מתחילת הבדיקה המיקרוסקופית ועד סופה. מאחר שהמבנה התלת-ממדי נשאר בתנאי הגידול שלו, ביטוי החלבון ונתוני הלוקליזציה מחקים טוב יותר את תנאי ה-in vivo. צפויות תוצאות מדויקות יותר, שכן המתודולוגיה מבטלת את השלבים המשפיעים על ביטוי האנטיגן של הדגימה. טבלה 1 וטבלה 2 מדגימות כיצד פרוטוקולים חדשים אלה מבטלים שלבים, חוסכים זמן ועבודה במעבדה ומפחיתים עלויות ומוצרי פסולת בהשוואה לזרימות עבודה מסורתיות.
בנוסף לשלבים המכריעים שתוארו לעיל, בעיה נוספת היא מתן מדיום ושיטה לשימור בהקפאה לשימור המבנה התלת-ממדי של הדגימה עם שיעורי כדאיות תאים גבוהים יותר 26,27,28,29,30,31. שימור בהקפאה חיוני ליצירת מערכת מודל יציבה ולאפשר ביו-בנקציה של אורגנואידים וספרואידים32,33. ביו-בנקאיות של כל המבנה התלת-ממדי המקורי תאפשר סיכום נאמן יותר של המצב הטבעי של בריאות או מחלה. השיקולים המרכזיים הם הנוחות והאמינות של שימור בהקפאה והפשרת אורגנואידים/ספרואידים. התאוששות אורגנואידית לאחר הפשרה היא נמוכה מאוד ברוב הטכנולוגיות הנוכחיות, לעתים קרובות פחות מ -50%. עם זאת, מחקרים אחרונים הראו תוצאות מבטיחות עם שיעורי הישרדות משופרים26,27,28,29. Lee et al. הראו כי 78% מהתאים הספרואידים שרדו לאחר שימור בהקפאה כאשר השתמשו בתמיסה של אוניברסיטת ויסקונסין המכילה 15% DMSO28. יחס הישרדות התאים עלה ל-83% במחקר של Arai et al.29. עם זאת, התוצאות לאחר שימור בהקפאה מושפעות באופן משמעותי מכיוון שהמבנים התלת-ממדיים אינם יכולים לשמור על אותם מאפיינים ואיכות. בנוסף, ריאגנטים ללא סרום נדרשים לתרגול ייצור טוב במסגרות פרמצבטיות ואבחון. תהליכי עבודה מסורתיים משתמשים במדיום המכיל סרום בקר עוברי (FBS) ודימתיל סולפוקסיד (DMSO) לשיטת ההקפאה האיטית, שניהם קשורים לנכים. FBS הוא מוצר שמקורו בבעלי חיים ויכולות להיות לו וריאציות אצווה. DMSO הוא מגן קריוטרסי מוצלח מאוד, אך חשיפה ארוכת טווח, במיוחד במהלך הפשרה, עלולה לגרום להשפעות ציטוטוקסיות30,31.
מאמר זה מתאר גם את מתודולוגיית ההקפאה/הפשרה של אורגנואידים או ספרואידים שלמים בעודם בהידרוג’ל. במחקר נעשה שימוש בשתי נוסחאות להקפאת אורגנואידים וספרואידים: (1) 10% DMSO המכיל תמיסת הקפאה מסורתית (FS) ו-(2) מדיום שימור בהקפאה ללא סרום ו-DMSO. מדיום שימור בהקפאה זה מכיל רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, השונים מהנוסחאות הנוכחיות. המטריצה החוץ-תאית מורכבת משני סוגים עיקריים של מקרומולקולות, פרוטאוגליקנים וחלבונים סיביים, החיוניים לפיגומים פיזיקליים עבור מרכיבי התאים, אך גם יוזמים תהליכים הדרושים למורפוגנזה של רקמות, התמיינות והומאוסטזיס 34,35,36,37,38,39,40 . קולגן מספק חוזק מתיחה, מווסת את הידבקות התאים, תומך בכימוטקסיס ובנדידה ומפתח רקמות ישיר37. בנוסף, סיבי אלסטין מספקים רתיעה לרקמות שעוברות מתיחה חוזרתונשנית 38. חלבון סיבי שלישי, פיברונקטין, מכוון את הארגון של המטריצה הבין-תאית הבין-תאית ויש לו תפקיד מכריע בתיווך ההתקשרות של התא ומתפקד כמווסת מכני חוץ-תאי39. Du et al. הדגימו את ההשפעה המגנה על הקרינה של הידרוליזט קולגן עוף על מערכת המודל הטבעית של אקטומיוזין41. התוצאות שלהם מצביעות על כך שהידרוליזט קולגן יכול לעכב צמיחה של גבישי קרח, להפחית את הדנטורציה והחמצון של חלבונים באופן דומה למגיני קרינה מסחריים, ולספק מבנה ג’ל טוב יותר לאחר מחזורי הפשרה בהקפאה. לכן, הוספת רכיבי מטריצה חוץ-תאית למדיית השימור בהקפאה מספקת סביבה בטוחה ומגנה יותר עבור הדגימה ותומכת במבנים החיים להחלים לאחר הקפאה-הפשרה.
בנוסף, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט לסימון ממברנות ציטופלסמיות וגרעינים של אורגנואידים חיים וספרואידים בזמן שהם עדיין נמצאים בהידרוג’ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ה-MD, המשלים את הפורמולציות והפרוטוקולים המתוארים כאן, מאפשר צמיחה תלת-ממדית מהירה וספונטנית של אורגנואידים וספרואידים בסביבה מבוקרת יותר וממשיך את הניסוי באותם תנאים. הדגימה נשארת באותה סביבה במהלך כל התהליך, וכמעט 100% מארכיטקטורות הגידול התלת-ממדיות נשארות שלמות במיכל. זה משפר את ההומוג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדייל מרטס מאוניברסיטת שיקגו על הכנת הדיאגרמות, לד”ר מהמט סריף איידין על תמיכתו הטכנית במכון המחקר למדעי הבריאות והטכנולוגיות של אוניברסיטת איסטנבול מדיפול, ולד”ר ראנה קאזמי מאוניברסיטת מלטפה על עריכת כתב היד.
Materials
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
References
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
- Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
- Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
- Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
- Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. 발생학. 278 (1), 255-263 (2005).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
- Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
- Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
- Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), 1015-1017 (2012).
- Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
- Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
- Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
- De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
- Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. 발생학. 341 (1), 126-140 (2010).
- Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
- Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
- Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
- Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. 의학. 99 (9), 19159 (2020).
- Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
- Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
- Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).
