Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel
Summary
El presente estudio describe metodologías para cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar esferoides y organoides completos bajo varios microscopios, mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un dispositivo multipropósito.
Abstract
Los organoides y esferoides, estructuras de cultivo tridimensionales en los laboratorios de cultivo celular, son cada vez más reconocidos como modelos superiores en comparación con los modelos de cultivo bidimensionales, ya que imitan mejor el cuerpo humano y tienen ventajas sobre los estudios en animales. Sin embargo, estos estudios comúnmente enfrentan problemas con la reproducibilidad y la consistencia. Durante los largos procesos experimentales, con transferencias de organoides y esferoides entre diferentes recipientes de cultivo celular, pipeteo y centrifugación, estas estructuras de crecimiento 3D susceptibles y frágiles a menudo se dañan o se pierden. En última instancia, los resultados se ven afectados significativamente, ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Los métodos descritos aquí minimizan estos pasos estresantes y garantizan un entorno seguro y consistente para organoides y esferoides a lo largo de la secuencia de procesamiento mientras todavía están en un hidrogel en un dispositivo multipropósito. Los investigadores pueden cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y luego examinar la estructura de organoides o esferoides bajo varios instrumentos de alta tecnología, desde microscopios confocales hasta microscopios electrónicos, utilizando un solo dispositivo multipropósito. Esta tecnología mejora la reproducibilidad, fiabilidad y validez de los estudios, al tiempo que mantiene un entorno estable y protector para las estructuras de cultivo 3D durante el procesamiento. Además, eliminar pasos estresantes minimiza los errores de manejo, reduce el tiempo necesario y disminuye el riesgo de contaminación.
Introduction
El futuro de la investigación y terapia celular está dentro de los cultivos celulares 3D 1,2,3. Los modelos organoides y esferoides cierran la brecha entre los experimentos in vitro y los modelos animales al crear mejores modelos que imitan el desarrollo del cuerpo humano, la fisiología y las enfermedades 4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la reproducibilidad y repetibilidad de estos modelos siguen siendo un desafío. Además, el manejo, la cosecha, la transferencia y la centrifugación de estas estructuras con las tecnologías actuales resultan en la pérdida o daño de los organoides y esferoides en muchas condiciones, lo que afecta significativamente los resultados.
A pesar de muchos protocolos para la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia y la criopreservación, no existe un enfoque universal relacionado con la estandarización de las condiciones experimentales, el manejo y el procesamiento de estas delicadas estructuras sin perderlas o dañarlas. Los protocolos actuales también son increíblemente largos, alternando desde unos pocos días hasta varias semanas, e incluyen procedimientos complejos con varios reactivos 10,11,12,13,14. Además, la recolección, el pipeteo, la centrifugación y la transferencia de estructuras de cultivo 3D entre los vasos de cultivo celular y los crioviales causan cambios en el posicionamiento de las estructuras y las fuerzas mecánicas y, en última instancia, afectan la diferenciación y maduración de los organoides y esferoides. Se ha reportado que la topología tisular, el posicionamiento de las células y las fuerzas mecánicas impactan significativamente la diferenciación y maduración celular 6,15,16,17.
Por lo tanto, es deseable mejorar las tecnologías convencionales actuales para generar organoides y esferoides con calidad estable. Un método / dispositivo que omita la centrifugación y otros pasos descritos anteriormente y proporcione el material en un solo entorno seguro desde el principio hasta el final de los múltiples procesos sería beneficioso para alcanzar los datos más consistentes y confiables. Además, esto reducirá las limitaciones de tiempo, mano de obra y costos.
El dispositivo multipropósito (MD) descrito aquí proporciona un único entorno seguro para múltiples procesos de organoides y esferoides (Figura complementaria 1). Este dispositivo y los protocolos complementarios eliminan los pasos de recolección, pipeteo, transferencia y centrifugación. Los organoides y esferoides permanecen en su ambiente in vitro durante los procesos secuenciales. Este entorno comprende principalmente componentes naturales o sintéticos de la matriz extracelular, como los hidrogeles disponibles comercialmente. En otras palabras, los métodos descritos aquí permiten procesar, examinar y congelar una muestra completa de organoides/esferoides mientras aún están en una gota de hidrogel.
El dispositivo biocompatible es resistente a temperaturas entre 60 °C y -160 °C, lo que hace posible restaurar los organoides/esteroides en un tanque de nitrógeno líquido a -160 °C o preparar bloques de resina para microscopía electrónica a 60 °C. El nicho en el dispositivo ha sido diseñado para definir un espacio limitado para estructuras de cultivo 3D y estimular la formación de esferoides u organoides basados en los estudios previos 18,19,20,21,22,23. Esa parte del dispositivo es transparente y contiene un plástico específico que proporciona una alta calidad óptica (índice de refracción: 1.43; valor abbe: 58; espesor: 7.8 mil [0.0078 in o 198 μm]). Tanto el nicho como la parte “lateral” circundante causan autofluorescencia. El nicho transparente en el centro tiene un área de80 mm 2, mientras que la parte lateral es de 600 mm2. La profundidad del contenedor es de 15 mm y el grosor es de 1,5 mm. Estas características, además del tamaño y el diseño del dispositivo, permiten realizar observaciones bajo diferentes tipos de microscopio de alta tecnología y preparar las muestras para exámenes microscópicos electrónicos (Figura 2). El sistema de cierre del dispositivo proporciona dos posiciones, una sellada en el congelador y la otra que permite el flujo de gas en la incubadora. Los ensayos de proliferación y citotoxicidad de CCK8 demuestran efectos similares en las células en comparación con las placas de cultivo celular tradicionales (Figura complementaria 2). La prueba de exclusión de azul de tripano demuestra una alta viabilidad celular (94%) durante el cultivo celular en la DM (Figura 3).
Los procesos que se pueden realizar para una muestra en el dispositivo único comprenden (1) cultivo, (2) tinción histológica, (3) inmunotinción, incluido el etiquetado inmunohistoquímico e inmunofluorescente, (4) congelación, (5) descongelación, (6) examen bajo microscopios ópticos, como microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia, confocales y de súper resolución, (7) recubrimiento y examen directamente bajo un microscopio electrónico de barrido, o (8) preparación para microscopía electrónica de transmisión ( Figura 2).
Existen diferentes metodologías para la tinción histológica, el marcaje inmunohistoquímico o el marcado fluorescente de organoides y esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Cosecharlos del hidrogel es el primer y principal paso de la tecnología actual. Después de este paso, algunos métodos permiten el inmunoetiquetado de montaje completo. Los organoides cosechados se incrustan en parafina, se seccionan y se etiquetan para teñir e inmunotinción en otros. Sin embargo, las secciones pueden no presentar toda la muestra y proporcionar solo datos limitados relacionados con la arquitectura 3D de la estructura. Además, el daño a estas estructuras 3D y la pérdida de antigenicidad son efectos secundarios bien conocidos de estas tecnologías.
Los nuevos protocolos complementarios para exámenes microscópicos en este artículo permiten un análisis de muestras de montaje completo aún en un hidrogel. Los protocolos descritos aquí incluyen dos formulaciones recientemente desarrolladas: solución para inmunohistoquímica (S-IHC) y solución para etiquetado de inmunofluorescencia (S-IF). Los métodos con estas soluciones permiten a los investigadores obtener datos más precisos, ya que no hay efectos nocivos de los flujos de trabajo tradicionales, como la centrifugación, el pipeteo y la transferencia de las estructuras delicadas. El protocolo descrito aquí también elimina la necesidad de recolección, bloqueo, limpieza y pasos de recuperación de antígenos, y acorta todo el procedimiento a 6-8 h. Además, la metodología permite agregar simultáneamente de uno a tres anticuerpos al mismo S-IF. Por lo tanto, es posible obtener los resultados el mismo día incluso después de los múltiples experimentos de etiquetado, que es otra ventaja del protocolo descrito aquí; Los protocolos tradicionales de etiquetado de inmunofluorescencia de montaje completo suelen tardar entre 3 días y varias semanas 10,11,12,13,14.
También se omite la incorporación de parafina, otro paso dañino que reduce la antigenicidad. La estructura 3D permanece en su entorno in vitro desde el principio hasta el final del examen microscópico. Dado que la estructura 3D permanece en sus condiciones de crecimiento, la expresión de proteínas y los datos de localización imitan mejor las condiciones in vivo. Se esperan resultados más precisos, ya que la metodología elimina los pasos que afectan la expresión del antígeno de la muestra. La Tabla 1 y la Tabla 2 demuestran cómo estos nuevos protocolos eliminan pasos, ahorran tiempo y mano de obra en el laboratorio y reducen los costos y los productos de desecho en comparación con los flujos de trabajo tradicionales.
Además de los pasos cruciales descritos anteriormente, otro problema es proporcionar un medio de criopreservación y un método para preservar la estructura 3D de la muestra con mayores tasas de viabilidad celular 26,27,28,29,30,31. La criopreservación es esencial para crear un sistema modelo estable y permitir el biobanco de organoides y esferoides32,33. Biobanco toda la estructura 3D original permitirá una recapitulación más fiel del estado natural de salud o enfermedad. Las consideraciones clave son la conveniencia y confiabilidad de la criopreservación y la descongelación de organoides / esferoides. La recuperación de organoides post-deshielo es muy baja en la mayoría de las tecnologías actuales, a menudo menos del 50%. Sin embargo, estudios recientes han mostrado resultados prometedores con mejores tasas de supervivencia26,27,28,29. Lee et al. demostraron que el 78% de las células esferoides sobrevivieron después de la criopreservación cuando utilizaron la solución de la Universidad de Wisconsin que contenía 15% de DMSO28. La razón de supervivencia celular aumentó al 83% en el estudio de Arai et al.29. Sin embargo, los resultados después de la criopreservación se ven afectados significativamente ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Además, se requieren reactivos sin suero para las buenas prácticas de fabricación en entornos farmacéuticos y de diagnóstico. Los flujos de trabajo tradicionales utilizan un medio que contiene suero bovino fetal (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) para el método de congelación lenta, ambos asociados con discapacidades. FBS es un producto derivado de animales y puede tener variaciones de lotes. El DMSO es un crioprotector muy exitoso, pero la exposición a largo plazo, especialmente durante la descongelación, puede causar efectos citotóxicos30,31.
Este artículo también describe la metodología de congelación/descongelación de organoides o esferoides enteros mientras aún están en un hidrogel. En el estudio se utilizan dos fórmulas para congelar organoides y esferoides: (1) DMSO al 10% que contiene solución de congelación tradicional (FS) y (2) un medio de criopreservación libre de suero y DMSO. Este medio de criopreservación contiene componentes de matriz extracelular, que son diferentes de las fórmulas actuales. La matriz extracelular comprende dos clases principales de macromoléculas, proteoglicanos y proteínas fibrosas, que son esenciales para el andamiaje físico de los constituyentes celulares, pero también inician procesos necesarios para la morfogénesis, diferenciación y homeostasis tisulares 34,35,36,37,38,39,40 . Los colágenos proporcionan resistencia a la tracción, regulan la adhesión celular, apoyan la quimiotaxis y la migración, y dirigen el desarrollo de los tejidos37. Además, las fibras de elastina proporcionan retroceso a los tejidos que sufren estiramientos repetidos38. Una tercera proteína fibrosa, la fibronectina, dirige la organización de la matriz extracelular intersticial y tiene un papel crucial en la mediación de la unión celular y funciona como un mecano-regulador extracelular39. Du et al. han demostrado el efecto crioprotector del hidrolizado de colágeno de pollo sobre el sistema modelo de actomiosina natural41. Sus resultados sugieren que el hidrolizado de colágeno puede inhibir el crecimiento de cristales de hielo, reducir la desnaturalización por congelación de proteínas y la oxidación de manera similar a los crioprotectores comerciales, y proporcionar una mejor estructura de gel después de los ciclos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la adición de componentes de matriz extracelular a los medios de criopreservación proporciona un entorno más seguro y protector para la muestra y ayuda a las estructuras vivas a sanar después de la congelación-descongelación.
Además, el presente estudio describe un protocolo sencillo para etiquetar las membranas citoplasmáticas y los núcleos de organoides y esferoides vivos mientras aún están en el hidrogel.
Protocol
Representative Results
Discussion
El MD, complementando las formulaciones y protocolos descritos aquí, facilita el crecimiento 3D rápido y espontáneo de organoides y esferoides en un entorno más controlado y continúa el experimento en las mismas condiciones. El espécimen permanece en el mismo entorno durante todo el proceso, y casi el 100% de las arquitecturas de cultivo 3D permanecen intactas en el contenedor. Esto mejora la homogeneidad durante los experimentos secuenciales y permite un período de cultivo prolongado. Además, el número de pasos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dale Mertes de la Universidad de Chicago por la preparación de diagramas, al Dr. Mehmet Serif Aydin por su apoyo técnico en el Instituto de Investigación de Ciencias y Tecnologías de la Salud de la Universidad Medipol de Estambul, y al Dr. Rana Kazemi de la Universidad de Maltepe por editar el manuscrito.
Materials
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
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