Summary
Den nåværende protokollen beskriver generering av 3D-tumorkulturmodeller fra primære kreftceller og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av celle-levedyktighetsanalyser og mikroskopiske undersøkelser.
Abstract
Til tross for bemerkelsesverdige fremskritt i forståelsen av tumorbiologi, mislykkes det store flertallet av onkologiske legemiddelkandidater som går inn i kliniske studier, ofte på grunn av mangel på klinisk effekt. Denne høye feilfrekvensen belyser manglende evne til dagens prekliniske modeller til å forutsi klinisk effekt, hovedsakelig på grunn av deres utilstrekkelighet i å reflektere tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrensningene kan løses med 3-dimensjonale (3D) kulturmodeller (sfæroider) etablert fra humane tumorprøver avledet fra individuelle pasienter. Disse 3D-kulturene representerer virkelighetsbiologi bedre enn etablerte cellelinjer som ikke reflekterer tumorheterogenitet. Videre er 3D-kulturer bedre enn 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) siden de replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon, og bevarer den naturlige celleformen og veksten. I denne studien ble det utviklet en metode for å forberede primære kulturer av kreftceller fra individuelle pasienter som er 3D og vokser i multicellulære sfæroider. Cellene kan utledes direkte fra pasienttumorer eller pasientavledede xenotransplantater. Metoden er allment anvendelig for solide svulster (f.eks. Kolon, bryst og lunge) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. Her presenteres en protokoll for å generere 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluere deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. Disse multicellulære sfæroidene kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og resistens.
Introduction
In vitro og in vivo studier representerer komplementære tilnærminger for å utvikle kreftbehandling. In vitro-modeller muliggjør kontroll av de fleste eksperimentelle variabler og legger til rette for kvantitative analyser. De fungerer ofte som rimelige screeningplattformer og kan også brukes til mekanistiske studier1. Imidlertid er deres biologiske relevans iboende begrenset, da slike modeller bare delvis reflekterer tumormikromiljøet1. In vivo-modeller, som pasientavledede xenotransplantater (PDX), fanger derimot kompleksiteten i tumormikromiljøet og er mer egnet for translasjonsstudier og individualiserende behandling hos pasienter (dvs. undersøkelse av respons på legemidler i en modell avledet fra en individuell pasient)1. In vivo-modeller bidrar imidlertid ikke til høykapasitetstilnærminger for narkotikascreening, ettersom de eksperimentelle parametrene ikke kan kontrolleres like tett som in vitro-modeller, og fordi utviklingen er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar 1,2.
In vitro-modeller har vært tilgjengelige i over 100 år, og cellelinjer har vært tilgjengelige i over 70 år3. I løpet av de siste tiårene har imidlertid kompleksiteten til de tilgjengelige in vitro-modellene av solide svulster økt dramatisk. Denne kompleksiteten spenner fra 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) som enten er tumoravledede etablerte cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilnærmingene som involverer 3-dimensjonale (3D) modeller1. Innenfor 2D-modellene er det et sentralt skille mellom de etablerte og primære cellelinjene4. Etablerte cellelinjer er foreviget; Derfor kan den samme cellelinjen brukes globalt over mange år, noe som i et historisk perspektiv letter samarbeid, akkumulering av data og utvikling av mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske avvik i disse cellelinjene med hver passasje, og kompromitterer dermed deres biologiske relevans. Videre reflekterer det begrensede antallet tilgjengelige cellelinjer ikke heterogeniteten til svulster hos pasienter 4,5. Primære kreftcellelinjer er avledet direkte fra resekterte tumorprøver oppnådd via biopsier, pleural effusjoner eller reseksjoner. Derfor er primære kreftcellelinjer mer biologisk relevante da de bevarer elementer av tumormikromiljøet og tumoregenskapene, for eksempel intercellulær atferd (f.eks. Kryssprat mellom friske og kreftceller) og de stamlignende fenotypene av kreftceller. Imidlertid er replikasjonskapasiteten til primære cellelinjer begrenset, noe som fører til en smal kulturtid og begrenser antall tumorceller som kan brukes til analyser 4,5.
Modeller som bruker 3D-kulturer er mer biologisk relevante enn 2D-kulturmodeller siden in vivo-betingelsene beholdes. Dermed bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleformen og veksten og replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon. De mest brukte 3D-modellene i kreftforskning inkluderer flercellede sfæroider, stillasbaserte strukturer og matrise-innebygde kulturer 4,6,7.
Den nåværende protokollen genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluerer deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. De representative resultatene som presenteres her er fra bryst- og tykktarmskreft; Imidlertid er denne protokollen allment anvendelig for andre solide tumortyper (f.eks. Kolangiokarcinom, mage-, lunge- og bukspyttkjertelkreft) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. De multicellulære sfæroidene som genereres ved hjelp av denne tilnærmingen, kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og motstand.
Denne protokollen er delt inn i tre seksjoner: (1) generering, innsamling og telling av sfæroider som forberedelse til bruk som modell for testing av legemiddeleffektivitet; (2) MTT-analyse for å vurdere legemiddeleffekt på sfæroidene; og (3) mikroskopisk evaluering av morfologiske endringer etter behandling av sfæroidene med legemidler som en annen tilnærming for å evaluere legemiddeleffekt (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innsamlingen av humane tumorprøver som ble brukt til de primære tumorcellekulturene ble utført i henhold til IRB-godkjente protokoller ved Rabin Medical Center med skriftlig informert samtykke fra pasientene. Pasienter som var kvalifisert for deltakelse i studien, inkluderte mannlige og kvinnelige voksne og pediatriske kreftpasienter med ikke-metastatisk bryst-, tykktarms-, lever-, lunge-, nevroendokrine, ovarie- eller bukspyttkjertelkreft, barnekreft eller metastatisk kreft. Det eneste eksklusjonskriteriet var manglende samtykkekompetanse.
1. Generering og innsamling av sfæroider
MERK: Isoleringen av primære tumorceller kan utføres som beskrevet av Kodak et al.8. Det er viktig at primære tumorceller som brukes til å generere sfæroidene, kan utledes direkte fra pasientprøver oppnådd ved biopsi, reseksjon, etc., eller indirekte ved bruk av tumorprøver fra pasientavledede xenograft (PDX) modeller, som beskrevet av Moskovits et al.9.
- Klargjør en enkeltcellesuspensjon av adherente primære tumorcellekulturer på 75% -100% sammenløp ved å ta en liten kolbe (T25) med en enkeltcelle adherent primær cellekultur, fjerne cellekulturmediet, vaske med PBS, og deretter tilsette 1 ml 1x Accutase (en celledetachmentløsning) (se materialfortegnelsen) i 3 minutter ved 37 ° C.
- Nøytraliser Accutase-løsningen ved å tilsette 5 ml cellekulturmedium (RPMI-1640 kulturmedium supplert med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin, se materialtabellen).
- Aspirer cellene med en 10 ml serologisk pipette, og deponer dem i et 15 ml konisk rør. Sentrifuger røret ved 800 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern cellekulturmediet, tilsett 5 ml fersk cellekulturmedium på toppen av cellepelleten, og bland forsiktig.
- Telle levedyktige celler med et hemocytometer10. For å gjøre dette, ta en aliquot på 50 μL av cellesuspensjonen, og bland den med 50 μL trypanblå. Tell de levende cellene (cellene som er negative for blå farge), og beregn totalt antall levende celler i suspensjonen.
- Forbered et "3D-kulturmedium" (et cellekulturmedium supplert med 5% kjellermembranmatrise; se materialtabellen).
MERK: "3D-kulturmediet" er væskelignende ved romtemperatur. Ved 37 °C blir konsistensen mer gelelignende (slik at cellene holder seg sammen), selv om den fortsatt kan pipetteres (siden den bare inneholder 5% kjellermembranmatrise). - Beregn antall celler som trengs for analysen og det totale volumet som kreves; hver brønn må inneholde 2.000-8.000 celler i 200 μL medium.
- Forbered en cellesuspensjon med ønsket antall celler (f.eks. 4000 celler) i 200 μL av "3D-kulturmediet" og bland forsiktig med pipetten for å sikre en homogen fordeling.
- Overfør suspensjonen til et pipetteringsreservoar. Bruk en flerkanals pipette, tilsett 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn med en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg (se materialtabellen). Før hver samling av cellene, bland suspensjonen godt.
- Sentrifuger platen ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur for å håndheve klyngingen av cellene, og dermed forbedre celleaggregeringen, og inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Hver 2-3 dag, oppdater "3D-kulturmediet". Sentrifuger platen ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur, fjern og kast forsiktig 50% av mediet (100 μL), og tilsett 100 μL friskt "3D-kulturmedium" for å erstatte den eksisterende løsningen. Gjenta trinn 1.11, og plasser platen tilbake i 37 ° C, 5% CO2 fuktet inkubator.
MERK: Fjerning av mediet må utføres når platen holdes ved 45°, og mediet må bare samles opp fra den øvre delen for å unngå å samle cellene. Et vakuumsugesystem skal ikke brukes. Det friske mediet må tilsettes sakte og forsiktig for ikke å forstyrre sfæroidene, som allerede har begynt å danne seg. - Inspiser cellene under et mikroskop hver 1-2 dag for å overvåke sfæroiddannelse. Mål diameteren på sfæroidene dannet ved hjelp av "skala" -verktøyet i bildebehandlingsprogramvaren (se materialfortegnelsen).
MERK: Mikroskopisk inspeksjon skal først avsløre uregelmessige runde til ovale legemer som antar en sfæroid form etter hvert som tiden skrider11,12.- Når sfæroiddiameteren når 100-200 μm, utfør stoffeffektforsøkene.
MERK: Legemiddeleffektforsøkene utføres når sfæroidene når denne diameteren, da flertallet av cellene på den tiden sprer seg, noe som bidrar til å evaluere responsen på behandlingen. Sfæroider med større diameter inneholder en nekrotisk kjerne og et hvilende lag11,12, noe som resulterer i en mindre andel prolifererende celler som reagerer på behandlingen.
- Når sfæroiddiameteren når 100-200 μm, utfør stoffeffektforsøkene.
- For sfæroidoppsamling, bruk en 1000 μL pipette for å samle sfæroidene fra hver brønn, og deponer dem i et 15 ml konisk rør.
MERK: Sfæroider er iboende skjøre og krever skånsom håndtering. Når du overfører mediet med sfæroidene til det koniske røret, hold røret ved 45 ° og pipett sakte på rørets vegg. Sfæroider er synlige for øyet. - Sentrifuger det koniske røret ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og aspirer forsiktig og kast supernatanten med en pipette.
- Tilsett 0,5 ml av cellekulturmediet, og resuspender pelleten godt, men forsiktig. Unngå å lage bobler.
- Utfør sfæroidtelling ved å følge trinnene nedenfor.
- Bruk en plate med 96 brønner og tegn et plusstegn på undersiden av en brønn for å dele brønnen i kvadranter (for å spore tellingen).
- Legg 50 μL av suspensjonen til brønnen, og telle sfæroidene manuelt under mikroskopet (ved hjelp av en 10x objektivlinse).
- Telle sfæroider i hver kvadrant, vær forsiktig så du ikke dobbeltteller, og beregne totalt antall sfæroider i brønnen.
MERK: For nøyaktighet av tellingen, telle minst 50 sfæroider i en brønn. Hvis det er mindre enn 50 sfæroider, bland suspensjonen forsiktig for å sikre homogen fordeling, og tell igjen med et større volum av suspensjonen som er tilsatt en ny brønn. Alternativt, hvis det er mindre enn 50 sfæroider i en brønn, kan sfæroidene sentrifugeres og resuspenderes forsiktig i et volum på <0,5 ml. Hvis det er over 100 sfæroider, legg til cellekulturmedium til sfæroidsuspensjonen, bland forsiktig og fortell. - Beregn sfæroidkonsentrasjonen (sfæroidantall/tellevolum [μL]), og beregn deretter totalt antall sfæroider i suspensjonen (sfæroidkonsentrasjon × totalvolum).
2. Legemiddeleffektanalyse (MTT-analyse)
MERK: For detaljer, se van Meerloo et al.13. For MTT-analysen må bare cellekulturmediet og ikke "3D-kulturmediet" brukes (tilsetning av kjellermembranmatrisen er ikke nødvendig og kan potensielt forstyrre MTT-analysen).
- I et nytt rør, lag en sfæroid suspensjon i en konsentrasjon på 200 sfæroider per 200 μL cellekulturmedium (RPMI-1640 kulturmedium supplert med 10% FBS, 1: 100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin).
- For hver medisinbehandling, lag et lager av sfæroider i et 15 ml rør. Beregn mengden som trengs for hvert legemiddel med antall brønner som trengs for gjentakelser: (5-8) × 200 μL. Legg stoffet til røret til den endelige konsentrasjonen som trengs.
MERK: Vennligst se avsnittet om representative resultater angående legemidlene som brukes til denne studien og doseringen av dem. Også de kommersielle detaljene om stoffene er oppført i materialfortegnelsen.
- For hver medisinbehandling, lag et lager av sfæroider i et 15 ml rør. Beregn mengden som trengs for hvert legemiddel med antall brønner som trengs for gjentakelser: (5-8) × 200 μL. Legg stoffet til røret til den endelige konsentrasjonen som trengs.
- Overfør 200 μL av sfæroidsuspensjonen til brønnene i en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg, og inkuber platen ved 37 °C i en 5% CO2 fuktet inkubator. Ikke bruk de eksterne radene og kolonnene på 96-brønnsplaten til analysen, da disse brønnene er preget av økt fordampning, noe som kan føre til økt variabilitet mellom gjentatte eksperimenter; Legg i stedet PBS til disse brønnene.
MERK: Det er viktig at kulturen til sfæroidene er homogen før kulturen blir alisitert i 96-brønnplaten. Også en kontrollbetingelse (dvs. ubehandlede sfæroider) må inkluderes i hvert eksperiment. - Etter å ha inkubert sfæroidene med studiemedisinen i 24-72 timer, sentrifuge platen ved 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og fjern forsiktig 170 μL av cellekulturmediet, og etterlater 30 μL (som inkluderer sfæroidene) i bunnen av brønnen.
MERK: Fjerning av 170 μL cellekulturmedium må gjøres nøye, for ikke å fjerne sfæroider. Hold tallerkenen på 45°, og legg en hånd (iført en mørk hanske for kontrast) under brønnene slik at sfæroidene er synlige (hvite prikker). - Klargjør MTT-oppløsningen (0,714 mg/ml i fenolfri RPMI, se materialtabellen).
- Tilsett 70 μL MTT-løsning til hver brønn til et endelig volum på 100 μL per brønn (den endelige MTT-konsentrasjonen i brønnen vil være 0,05 mg per 100 μL). I tillegg må du forberede "Blanke" brønner med MTT-løsning uten celler.
MERK: MTT er lysfølsom. Derfor må lyset i hetten slås av, og røret som inneholder MTT-løsningen må dekkes med aluminiumsfolie. - Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator i 3-4 timer til en endring i fargen på løsningen i brønnene (lilla farge representerer levende celler) observeres.
- Når en endring observeres, tilsett 100 μL stoppløsning (0,1N HCl i isopropanol) til hver brønn, og bland innholdet i brønnene forsiktig uten å skape bobler.
- Les absorbansen av platen i en fluorometer-ELISA-leser (se materialtabellen) ved en bølgelengde på 570 nm og en bakgrunnsbølgelengde på 630-690 nM.
MERK: Hvis den tilgjengelige fluorometer-ELISA-leseren ikke kan lese 96-brønnsplaten med ultralavt vedlegg, overfør innholdet i hver brønn til en tilsvarende flatbunnet 96-brønnsplate. - Beregn cellens levedyktighet ved å følge trinnene nedenfor.
- For hver brønn beregner du "spesifikt signal" ("spesifikt signal" = signalet ved 570 nm - signalet ved 630-690 nm). Deretter beregner du gjennomsnittsverdien av de "tomme" brønnene, og trekker denne verdien fra hver brønn.
- Beregn gjennomsnittet av de "spesifikke signalene" i kontrollbrønnene som inneholder celler som ikke ble behandlet med studiemedisinen ("AV-SS-unt").
- Beregne levedyktigheten (prosent) av celler i hver brønn i forhold til brønner med ubehandlede celler.
MERK: levedyktighet = (spesifikt signal i hver brønn / "AV-SS-unt") × 100
3. Overvåking og analyse av de morfologiske endringene i sfæroidene
MERK: Når det gjelder MTT-analysen, bør bare cellekulturmediet og ikke "3D-kulturmediet" brukes i denne evalueringen (å legge til kjellermembranmatrisen er ikke nødvendig og kan potensielt forstyrre analysen).
- Etter å ha talt sfæroidene, fortynn suspensjonen i cellekulturmedium (RPMI-1640 kulturmedium supplert med 10% FBS, 1:100 penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% L-glutamin) til ca. 1-2 sfæroider per 20 μL.
- Sett 80 μL cellekulturmedium inn i brønnene i en 96-brønnplate med ultralavt vedlegg, og tilsett deretter 20 μL av sfæroidsuspensjonen til brønnene.
MERK: Brønnene vil derfor inneholde 1-2 sfæroider i et volum på 100 μL. - Kontroller nøye brønnene under mikroskopet, og merk brønnene som inneholder en sfæroid, da de vil bli brukt til denne analysen.
- Forbered studiemedisinen i en konsentrasjon som er to ganger konsentrasjonen av interesse. Tilsett 100 μL av legemiddelløsningen til de aktuelle brønnene (den totale konsentrasjonen i brønnen vil da være 1x).
- Ta et bilde av hver brønn på dag 0 (før du legger til studiemedisinen) og bruk "skala" -verktøyet i bildebehandlingsprogramvaren (se materialtabellen) for å bestemme diametrene til sfæroidene.
- Inkuber platen ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator, og undersøk morfologien og måle diameteren på sfæroidene (ved hjelp av "skala" -verktøyet) daglig i 3-7 dager, avhengig av når legemiddeleffekten observeres (f.eks. cellespredning, invasive pods, strukturødeleggelse, etc.).
- På slutten av forsøket, plott endringene i sfæroiddiametre (i forhold til dag 0) over tid.
MERK: Endring (prosent) = (sfæroiddiameter på en bestemt dag / diameteren av den sfæroiden på dag 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen presenterer prosedyrer for å generere en homogen kultur av sfæroider fra primære tumorceller, kvantitativt evaluere legemiddeleffekt på sfæroidkultur (MTT-analyse) og bestemme effekten av studiemedisiner på sfæroid morfologi. Data fra representative eksperimenter i sfæroider generert fra kolon- og brystkreftcellekulturer presenteres. Lignende eksperimenter ble utført ved bruk av andre tumortyper, inkludert kolangiokarcinom, mage-, lunge- og bukspyttkjertelkreft (data ikke vist). Alle forsøkene som presenteres her ble utført i tre eksemplarer.
Figur 2 viser sfæroidene som ble generert fra den primære tykktarmskreftcellekulturen. Som vist i figur 2, avhenger antall sfæroider som genereres av antall celler som opprinnelig ble sådd i hver brønn. Veksten av sfæroider til over 100 μm i diameter tok 10-14 dager. Opprinnelsen til tumorcellene (f.eks. forskjellige pasienter og forskjellige opprinnelser) bestemte veksthastigheten. Såing av brønnene med flere celler forkortet ikke tiden som kreves for sfæroidgenerering, men økte heller antall sfæroider dannet. Spesielt ved langvarig kultur av tykktarmskreftsfæroidene begynte de å feste seg til hverandre og dannet klynger av sfæroider i druelignende strukturer (figur 3), noe som forhindret en homogen kultur og dermed forbød bruken av sfæroidene i MTT-analysene.
Figur 4 viser effekten av tre behandlinger (10 μM palbociklib og 10 μM sunitinib og deres kombinasjon ved 10 μM hver) på levedyktigheten til sfæroider avledet fra to primære kreftformer. I dette tilfellet ble det først etablert en PDX-modell, og tumorcellene som ble brukt til sfæroidanalysen ble avledet fra PDX-modellen9. Den første PDX-modellen ble etablert ved hjelp av en tykktarmskreftprøve fra en 50 år gammel mannlig pasient, og den andre ved hjelp av en brystkreftprøve fra en 62 år gammel kvinne. Som vist i figur 4A,B førte kombinasjonen av palbociklib pluss sunitinib etter 3 dagers behandling til en signifikant reduksjon i levedyktighet målt ved MTT-analysen. Som vist i figur 4C,D var de morfologiske endringene som skjedde ved behandling svært tydelige. På dag 0 var alle sfæroidene intakte. I kontrast, på dag 3, var sfæroidene behandlet med kontrollen (DMSO) fortsatt intakte, mens sfæroidene behandlet med kombinasjonen ble demontert, og deres morfologi var "åpen", med celler som løsnet fra den faste strukturen, noe som tyder på ødeleggelsen av sfæroidstrukturen.
Figur 5 viser oppfølgingen av sfæroidene over tid. Disse sfæroidene, generert fra brystkreftceller avledet fra en 44 år gammel kvinnelig pasient, ble behandlet med en av to kombinasjoner (trastuzumab [10 μg / ml] pluss vinorelbin [1 μg / ml] eller 5-fluorouracil [200 μM] pluss cisplatin [300 μM]). Som vist i figur 5A ble størrelsen på sfæroidene behandlet med 5-fluorouracil pluss cisplatin redusert innen dag 3, og sfæroidene ble fullstendig ødelagt innen dag 7. I motsetning til dette hadde behandlingen med trastuzumab pluss vinorelbin bare en liten effekt på morfologien til sfæroidene (f.eks. en viss grad av en "åpen" struktur), men effekten var ikke signifikant. Figur 5B viser gjennomsnittlig endring i diameter på sfæroidene i forhold til dag 0 (fem sfæroider ble fulgt i hver behandlingsgruppe).
Figur 1: Oversikt over protokollen for å etablere 3D-sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluere deres følsomhet for legemidler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Dannelse av sfæroider fra en primær tykktarmskreftcellekultur over tid etter antall initialt sådde celler. Ulike antall celler ble sådd i "3D-kulturmedium" i en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg og observert under mikroskopet (4x forstørrelse). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sfæroider fra primære tykktarmskreftceller (med initial cellesåing på 2000 per brønn) etter 12 dager i dyrkning. De to eksemplene (A,B) viser klynger skapt ved festing av sfæroider til hverandre (10x forstørrelse). Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Effekten av palbociklib (10 μM), sunitinib (10 μM) og deres kombinasjon (10 μM hver) på sfæroider fra primære tumorceller, inkludert tykktarm og brystkreft (PDX-avledet). En MTT-analyse ble utført på sfæroider avledet fra (A) kolon og (B) brystkreftceller. MTT-signalene ble normalisert til verdier fra DMSO-behandlede celler. Verdiene representerer gjennomsnittet fra fire til åtte replikater. Feilfeltene representerer SEM. *p < 0,05 kontra en enkelt agent (t-test). Effekten av de ulike behandlingene på cellevekst ble også evaluert mikroskopisk på dag 0 og etter 3 dagers behandling av sfæroider avledet fra (C) kolon og (D) brystkreftceller (10x forstørrelse). Skala bar = 100 μm. Figuren er tilpasset fra Moskovits et al.9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av trastuzumab (10 μg/ml) pluss vinorelbin (1 μg/ml) og 5-fluorouracil (200 μM) pluss cisplatin (300 μM) på sfæroider avledet av brystkreft over tid. (A) Hver brønn inneholdt en sfæroid og ble overvåket over tid under mikroskopet (10x forstørrelse). Skala bar = 100 μm. (B) Endringen i diameteren av sfæroidene (i forhold til dag 0) etter behandlingens varighet. *p = 0,05 for 5-fluorouracil pluss cisplatin versus kontroller (t-test). Hver behandlingsgruppe omfattet fire til seks brønner, med en sfæroid i hver brønn. Den gjennomsnittlige endringen presenteres. Feilfeltene representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende protokollen beskriver en enkel metode for å generere 3D primære cellekulturer (sfæroider) avledet fra humane tumorprøver. Disse sfæroidene kan brukes til ulike analyser, inkludert evaluering av potensielle legemiddelkandidater og legemiddelkombinasjoner, identifisering av potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøkelse av mekanismer for respons og resistens. Protokollen bruker enten primære tumorceller avledet direkte fra pasientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan etableres ved hjelp av pasientprøver. Sistnevnte tilnærming tillater gjennomføring in vitro og in vivo eksperimenter med samme primære tumor. Konsistens har tidligere blitt vist i resultatene av legemiddelsensitivitetseksperimenter mellom PDX-modeller og 3D-kulturer avledet fra disse modellene9, og støtter dermed relevansen av denne in vitro/in vivo-tilnærmingen .
De viktigste fordelene ved den nåværende protokollen inkluderer dens brede anvendelighet for de fleste solide svulster og dens kostnadseffektivitet, som stammer fra dens kompatibilitet med de typiske evner / utstyr for kreftforskning / cellebiologiske laboratorier (dvs. ikke behov for spesialisert utstyr eller outsourcing). I tillegg genererer den nåværende protokollen en homogen sfæroidpopulasjon, som tillater bruk av kvantitative levedyktighetsanalyser med høy gjennomstrømning (f.eks. MTT). Generering av en homogen sfæroidpopulasjon er viktig for å oppnå meningsfulle resultater, da studier har vist at sfæroidstørrelsen påvirker responsen på behandlingen. Større sfæroider, i motsetning til mindre sfæroider, er preget av en nekrotisk kjerne. Imidlertid er de fleste celler i det lineære vekststadiet i mindre sfæroider. Videre påvirker størrelsen på sfæroid også stivheten i vevstrukturen, noe som kan påvirke diffusjonen av forbindelser (som de som brukes til levedyktighetsanalysene) i sfæroid14. Hovedbegrensningen i den nåværende protokollen er at selv med sin brede anvendelighet, er det tilfeller når tilnærmingen ikke klarer å generere sfæroider. Det er viktig at en slik feil ikke er tumortypespesifikk, men heller pasientspesifikk. Ytterligere studier er nødvendig for å undersøke hvorfor tumorprøver fra enkelte pasienter ikke danner sfæroider ved hjelp av denne protokollen.
Den nåværende protokollen er basert på to hovedprinsipper: (1) å ha en cellesuspensjon uten celleklynger (dvs. en enkeltcellesuspensjon) og (2) ved bruk av en ultra-lav festeplate med et medium som inneholder 5% kjellermembranmatrise (en solubilisert ekstracellulær matrise). Det opprinnelige antallet frøede celler påvirker antall sfæroider som dannes, men ikke tiden som kreves for sfæroiddannelse, noe som tyder på at hver sfæroid genereres fra en enkelt tumorcelle. Spesielt forekommer klynging av sfæroider, spesielt etter langvarig inkubasjon. Denne klyngen forstyrrer den homogene kulturen og forbyder bruk av MTT (på grunn av vanskeligheten ved å dispensere like mange sfæroider i hver brønn). Denne klyngen kan unngås ved å fortynne kulturen og overføre sfæroidene til større brønner. Hvis en homogen kultur ikke kan oppnås, kan MTT-analyser ikke brukes, selv om den morfologiske vurderingen og målingen av sfæroiddiametrene fortsatt kan utføres. Det må bemerkes at den morfologiske vurderingen er mer arbeidsintensiv, siden den krever tildeling av en sfæroid per brønn og overvåking av hver sfæroid under mikroskopet.
Bestemmelse av riktig antall sfæroider for en MTT-analyse er viktig for tolkningen. Det anbefales derfor å først generere en standardkurve med kjent antall sfæroider (f.eks. 50, 100, 200 og 400 per brønn, i replikater) for å bestemme det optimale antall sfæroider for MTT-analysen. Midten av plottets lineære område må brukes til analysen slik at det er nok sfæroider til å oppdage et signal, men ikke for mange (dvs. slik at platåfasen av signalet ikke nås). Videre tillater bruk av mellomområdet å holde signalet innenfor det lineære området i tilfeller av respons på stoffet (dvs. redusert signal), samt frafall (dvs. fortsatt vekst av sfæroid og økt signal). Til slutt, siden MTT-analysen vurderer cellemetabolsk aktivitet, som kan være forskjellig mellom svulster fra forskjellige pasienter, bør en standardkurve genereres for hver primærtumorprøve.
Oppsummert representerer denne protokollen for å generere 3D-tumorkulturmodeller fra primære kreftceller og evaluere deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og morfologisk undersøkelse under mikroskopet, et verdifullt, biologisk relevant verktøy som utfyller dagens 2D in vitro-tilnærminger samt in vivo-tilnærmingene .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
