Summary
El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.
Abstract
A pesar de los notables avances en la comprensión de la biología tumoral, la gran mayoría de los candidatos a fármacos oncológicos que ingresan a los ensayos clínicos fracasan, a menudo debido a la falta de eficacia clínica. Esta alta tasa de fracaso ilumina la incapacidad de los modelos preclínicos actuales para predecir la eficacia clínica, principalmente debido a su insuficiencia para reflejar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral. Estas limitaciones se pueden abordar con modelos de cultivo tridimensionales (3D) (esferoides) establecidos a partir de muestras de tumores humanos derivados de pacientes individuales. Estos cultivos 3D representan la biología del mundo real mejor que las líneas celulares establecidas que no reflejan la heterogeneidad tumoral. Además, los cultivos 3D son mejores que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa), ya que replican elementos del entorno tumoral, como hipoxia, necrosis y adhesión celular, y preservan la forma y el crecimiento natural de las células. En el presente estudio, se desarrolló un método para preparar cultivos primarios de células cancerosas de pacientes individuales que son 3D y crecen en esferoides multicelulares. Las células pueden derivarse directamente de tumores de pacientes o xenoinjertos derivados de pacientes. El método es ampliamente aplicable a tumores sólidos (por ejemplo, colon, mama y pulmón) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. En este documento, se presenta un protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los medicamentos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Estos esferoides multicelulares se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Introduction
Los estudios in vitro e in vivo representan enfoques complementarios para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Los modelos in vitro permiten el control de la mayoría de las variables experimentales y facilitan los análisis cuantitativos. A menudo sirven como plataformas de detección de bajo costo y también se pueden utilizar para estudios mecanicistas1. Sin embargo, su relevancia biológica es inherentemente limitada, ya que tales modelos sólo reflejan parcialmente el microambiente tumoral1. Por el contrario, los modelos in vivo, como los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), capturan la complejidad del microambiente tumoral y son más adecuados para estudios traslacionales y tratamiento individualizado en pacientes (es decir, investigar la respuesta a fármacos en un modelo derivado de un paciente individual)1. Sin embargo, los modelos in vivo no son propicios para enfoques de alto rendimiento para el cribado de fármacos, ya que los parámetros experimentales no pueden controlarse tan estrechamente como en los modelos in vitro y porque su desarrollo requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso 1,2.
Los modelos in vitro han estado disponibles por más de 100 años, y las líneas celulares han estado disponibles por más de 70 años3. Durante las últimas décadas, sin embargo, la complejidad de los modelos in vitro disponibles de tumores sólidos ha aumentado dramáticamente. Esta complejidad abarca desde modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa) que son líneas celulares establecidas derivadas de tumores o líneas celulares primarias hasta los enfoques más recientes que involucran modelos tridimensionales (3D)1. Dentro de los modelos 2D, una distinción clave es entre las líneas celulares establecidas y primarias4. Las líneas celulares establecidas son inmortalizadas; Por lo tanto, la misma línea celular se puede utilizar globalmente durante muchos años, lo que desde una perspectiva histórica, facilita la colaboración, la acumulación de datos y el desarrollo de muchas estrategias de tratamiento. Sin embargo, las aberraciones genéticas en estas líneas celulares se acumulan con cada paso, comprometiendo así su relevancia biológica. Además, el número limitado de líneas celulares disponibles no refleja la heterogeneidad de los tumores en los pacientes 4,5. Las líneas celulares de cáncer primario se derivan directamente de muestras tumorales resecadas obtenidas mediante biopsias, derrames pleurales o resecciones. Por lo tanto, las líneas celulares de cáncer primario son biológicamente más relevantes ya que preservan elementos del microambiente tumoral y las características del tumor, como los comportamientos intercelulares (por ejemplo, la diafonía entre células sanas y cancerosas) y los fenotipos similares a los vástagos de las células cancerosas. Sin embargo, la capacidad replicativa de las líneas celulares primarias es limitada, lo que conduce a un tiempo de cultivo estrecho y limita el número de células tumorales que pueden ser utilizadas para los análisis 4,5.
Los modelos que utilizan cultivos 3D son biológicamente más relevantes que los modelos de cultivo 2D, ya que se conservan las condiciones in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo 3D preservan la forma y el crecimiento natural de las células y replican elementos del entorno tumoral, como la hipoxia, la necrosis y la adhesión celular. Los modelos 3D más utilizados en la investigación del cáncer incluyen esferoides multicelulares, estructuras basadas en andamios y cultivos incrustados en matrices 4,6,7.
El presente protocolo genera modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evalúa su sensibilidad a los fármacos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Los resultados representativos presentados en este documento son de cáncer de mama y colon; Sin embargo, este protocolo es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos (por ejemplo, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, de pulmón y de páncreas) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. Los esferoides multicelulares generados utilizando este enfoque se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Este protocolo se divide en tres secciones: (1) la generación, recolección y conteo de los esferoides en preparación para su uso como modelo para probar la eficacia del fármaco; (2) ensayo MTT para evaluar la eficacia del fármaco en los esferoides; y (3) la evaluación microscópica de los cambios morfológicos después del tratamiento de los esferoides con fármacos como otro enfoque para evaluar la eficacia del fármaco (Figura 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La recolección de muestras de tumores humanos utilizados para los cultivos de células tumorales primarias se realizó según los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) en el Centro Médico Rabin con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los pacientes elegibles para participar en el estudio incluyeron hombres y mujeres adultos y pacientes pediátricos con cáncer de mama, colon, hígado, pulmón, neuroendocrino, ovario o páncreas no metastásico, cualquier cáncer pediátrico o cualquier cáncer metastásico. El único criterio de exclusión fue la falta de capacidad para dar su consentimiento informado.
1. Generación y recolección de esferoides
NOTA: El aislamiento de células tumorales primarias puede realizarse como lo describen Kodak et al.8. Es importante destacar que las células tumorales primarias utilizadas para generar los esferoides pueden derivarse directamente de muestras de pacientes obtenidas por biopsia, resección, etc., o indirectamente utilizando muestras tumorales de modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX), como lo describen Moskovits et al.9.
- Preparar una suspensión unicelular de cultivos de células tumorales primarias adherentes de confluencia del 75% al 100% tomando un matraz pequeño (T25) con un cultivo celular primario adherente de una sola célula, retirando los medios de cultivo celular, lavando con PBS y luego agregando 1 ml de 1x Accutase (una solución de desprendimiento celular) (consulte la Tabla de materiales) durante 3 min a 37 °C.
- Neutralice la solución de Accutase agregando 5 ml de medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1:100 de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina; consulte la Tabla de materiales).
- Aspirar las células con una pipeta serológica de 10 mL, y depositarlas en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Retire el medio de cultivo celular, agregue 5 ml de medio de cultivo celular fresco sobre el pellet celular y mezcle suavemente.
- Contar las células viables con un hemocitómetro10. Para ello, tome una alícuota de 50 μL de la suspensión celular y mézclela con 50 μL de azul de tripano. Cuente las celdas vivas (las celdas que son negativas para el color azul) y calcule el número total de celdas vivas en la suspensión.
- Prepare un "medio de cultivo 3D" (un medio de cultivo celular suplementado con una matriz de membrana basal al 5%; consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El "medio de cultivo 3D" es similar a un líquido a temperatura ambiente. A 37 °C, la consistencia se vuelve más gelatinosa (de modo que las células permanecen juntas), aunque todavía se puede pipetear (ya que contiene solo un 5% de matriz de membrana basal). - Calcular el número de células necesarias para el ensayo y el volumen total requerido; cada pocillo debe contener 2.000-8.000 células en 200 μL de medio.
- Prepare una suspensión celular con el número deseado de células (por ejemplo, 4.000 células) en 200 μL del "medio de cultivo 3D" y mezcle suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea.
- Transfiera la suspensión a un depósito de pipeteo. Con una pipeta multicanal, añadir 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja (véase la Tabla de materiales). Antes de cada recolección de las células, mezclar bien la suspensión.
- Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente para reforzar la agrupación de las células, mejorando así la agregación celular, e incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.
- Cada 2-3 días, actualice el "medio de cultivo 3D". Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente, retirar y desechar suavemente el 50% del medio (100 μL) y añadir 100 μL de "medio de cultivo 3D" fresco para reemplazar la solución existente. Repita el paso 1.11 y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada de 37 °C, 5% deCO2.
NOTA: La extracción del medio debe realizarse cuando la placa se mantiene a 45°, y el medio debe recogerse solo de la parte superior para evitar la recolección de las células. No se debe utilizar un sistema de aspiración al vacío. El medio fresco debe agregarse lenta y suavemente para no interrumpir los esferoides, que ya habrán comenzado a formarse. - Inspeccione las células bajo un microscopio cada 1-2 días para monitorear la formación de esferoides. Mida el diámetro de los esferoides formados utilizando la herramienta "escala" en el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: La inspección microscópica debe revelar primero cuerpos irregulares redondos a ovalados que asumen una forma esferoide a medida que avanza el tiempo11,12.- Cuando el diámetro del esferoide alcance 100-200 μm, realice los experimentos de eficacia del fármaco.
NOTA: Los experimentos de eficacia farmacológica se realizan cuando los esferoides alcanzan este diámetro ya que, en ese momento, la mayoría de las células están proliferando, lo que es propicio para evaluar la respuesta al tratamiento. Los esferoides de mayor diámetro contienen un núcleo necrótico y una capa quiescente11,12, lo que resulta en una menor proporción de células proliferantes que responden al tratamiento.
- Cuando el diámetro del esferoide alcance 100-200 μm, realice los experimentos de eficacia del fármaco.
- Para la recolección de esferoides, use una pipeta de 1,000 μL para recolectar los esferoides de cada pocillo y depositarlos en un tubo cónico de 15 ml.
NOTA: Los esferoides son inherentemente frágiles y requieren un manejo suave. Al transferir el medio con los esferoides al tubo cónico, sostenga el tubo a 45° y pipete lentamente en la pared del tubo. Los esferoides son visibles para el ojo. - Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, y aspirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 0,5 ml del medio de cultivo celular y resuspender el pellet bien pero suavemente. Evite hacer burbujas.
- Realice el conteo de esferoides siguiendo los pasos a continuación.
- Use una placa de 96 pocillos y dibuje un signo más en la parte inferior de un pozo para dividir el pozo en cuadrantes (para ayudar a rastrear el conteo).
- Agregue 50 μL de la suspensión al pocillo y cuente los esferoides manualmente bajo el microscopio (usando una lente de objetivo 10x).
- Cuente los esferoides en cada cuadrante, tenga cuidado de no contar dos veces y calcule el número total de esferoides en el pozo.
NOTA: Para mayor precisión del conteo, cuente al menos 50 esferoides en un pozo. Si hay menos de 50 esferoides, mezcle suavemente la suspensión para asegurar una distribución homogénea, y cuente nuevamente usando un volumen mayor de la suspensión agregada a un nuevo pozo. Alternativamente, si hay menos de 50 esferoides en un pozo, los esferoides pueden centrifugarse y resuspenderse suavemente en un volumen de <0,5 ml. Si hay más de 100 esferoides, agregue el medio de cultivo celular a la suspensión de esferoides, mezcle suavemente y vuelva a contar. - Calcule la concentración de esferoides (recuento de esferoides/volumen de recuento [μL]) y, a continuación, calcule el número total de esferoides en la suspensión (concentración de esferoides × volumen total).
2. Ensayo de eficacia farmacológica (ensayo MTT)
NOTA: Para más detalles, véase van Meerloo et al.13. Además, para el ensayo MTT, solo se debe usar el medio de cultivo celular y no el "medio de cultivo 3D" (agregar la matriz de membrana basal no es necesario y podría interferir potencialmente con el ensayo MTT).
- En un tubo nuevo, preparar una suspensión esferoide a una concentración de 200 esferoides por 200 μL de medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1:100 de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina).
- Para cada tratamiento farmacológico, prepare un stock de esferoides en un tubo de 15 ml. Calcule la cantidad necesaria para cada fármaco por el número de pocillos necesarios para las repeticiones: (5-8) × 200 μL. Agregue el medicamento al tubo hasta la concentración final necesaria.
NOTA: Consulte la sección de resultados representativos con respecto a los medicamentos utilizados para el presente estudio y su dosis. Además, los detalles comerciales de los medicamentos se enumeran en la Tabla de materiales.
- Para cada tratamiento farmacológico, prepare un stock de esferoides en un tubo de 15 ml. Calcule la cantidad necesaria para cada fármaco por el número de pocillos necesarios para las repeticiones: (5-8) × 200 μL. Agregue el medicamento al tubo hasta la concentración final necesaria.
- Transfiera 200 μL de la suspensión esferoide a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja e incube la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%. No utilice las filas y columnas externas de la placa de 96 pocillos para el ensayo, ya que estos pozos se caracterizan por una mayor evaporación, lo que podría conducir a una mayor variabilidad entre los experimentos repetidos; en su lugar, agregue PBS a estos pozos.
NOTA: Es clave que el cultivo de los esferoides sea homogéneo antes de que el cultivo se alifique en la placa de 96 pocillos. Además, se debe incluir una condición de control (es decir, esferoides no tratados) en cada experimento. - Después de incubar los esferoides con el fármaco del estudio durante 24-72 h, centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar suavemente 170 μL del medio de cultivo celular, dejando 30 μL (que incluye los esferoides) en el fondo del pozo.
NOTA: La extracción de los 170 μL de medio de cultivo celular debe hacerse con cuidado, para no eliminar los esferoides. Sostenga la placa a 45 ° y coloque una mano (con un guante oscuro para contrastar) debajo de los pocillos para que los esferoides sean visibles (puntos blancos). - Prepare la solución MTT (0.714 mg/ml en RPMI libre de fenol, ver la Tabla de materiales).
- Agregue 70 μL de solución MTT a cada pocillo hasta un volumen final de 100 μL por pocillo (la concentración final de MTT en el pocillo será de 0.05 mg por 100 μL). Además, prepare pozos "en blanco" con solución MTT sin células.
NOTA: MTT es sensible a la luz. Por lo tanto, la luz en la campana debe estar apagada y el tubo que contiene la solución MTT debe cubrirse con papel de aluminio. - Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5% durante 3-4 h hasta que se observe un cambio en el color de la solución en los pocillos (el color púrpura representa células vivas).
- Cuando se observe un cambio, agregue 100 μL de solución de parada (0.1N HCl en isopropanol) a cada pocillo y mezcle suavemente el contenido de los pocillos sin crear burbujas.
- Lea la absorbancia de la placa en un lector Fluorómetro-ELISA (consulte la Tabla de materiales) a una longitud de onda de 570 nm y una longitud de onda de fondo de 630-690 nM.
NOTA: Si el lector Fluorometer-ELISA disponible no puede leer la placa de 96 pocillos de accesorio ultra bajo, transfiera el contenido de cada pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo plano correspondiente. - Calcule la viabilidad celular siguiendo los pasos a continuación.
- Para cada pozo, calcule la "señal específica" ("señal específica" = la señal a 570 nm - la señal a 630-690 nm). Luego, calcule el valor promedio de los pozos "en blanco" y reste este valor de cada pozo.
- Calcular el promedio de las "señales específicas" en los pocillos de control que contienen células que no fueron tratadas con el fármaco del estudio ("AV-SS-unt").
- Calcule la viabilidad (porcentaje) de células en cada pocillo en relación con los pocillos con células no tratadas.
NOTA: Viabilidad = (señal específica en cada pozo/"AV-SS-unt") × 100
3. Seguimiento y análisis de los cambios morfológicos en los esferoides
NOTA: En cuanto al ensayo MTT, solo se debe usar el medio de cultivo celular y no el "medio de cultivo 3D" en esta evaluación (agregar la matriz de membrana basal no es necesario y podría interferir potencialmente con el análisis).
- Después de contar los esferoides, diluir la suspensión en medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 1:100 penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina) a aproximadamente 1-2 esferoides por 20 μL.
- Coloque 80 μL de medio de cultivo celular en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja, y luego agregue 20 μL de la suspensión esferoide a los pocillos.
NOTA: Por lo tanto, los pocillos contendrán 1-2 esferoides en un volumen de 100 μL. - Revise cuidadosamente los pocillos bajo el microscopio y marque los pozos que contienen un esferoide, ya que se utilizarán para este análisis.
- Prepare el fármaco del estudio en una concentración que sea el doble de la concentración de interés. Agregue 100 μL de la solución del fármaco a los pocillos relevantes (la concentración total en el pozo será entonces 1x).
- Capture una imagen de cada pocillo en el Día 0 (antes de agregar el fármaco del estudio) y use la herramienta "escala" en el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para determinar los diámetros de los esferoides.
- Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%, y examinar la morfología y medir el diámetro de los esferoides (utilizando la herramienta "escala") diariamente durante 3-7 días, dependiendo de cuándo se observe el efecto del fármaco (por ejemplo, diseminación celular, vainas invasivas, destrucción de estructuras, etc.).
- Al final del experimento, trace los cambios en los diámetros de los esferoides (en relación con el Día 0) a lo largo del tiempo.
NOTA: Cambio (porcentaje) = (diámetro del esferoide en un día específico/el diámetro de ese esferoide en el día 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo presenta procedimientos para generar un cultivo homogéneo de esferoides a partir de células tumorales primarias, evaluar cuantitativamente la eficacia del fármaco en el cultivo de esferoides (ensayo MTT) y determinar el efecto de los fármacos del estudio sobre la morfología del esferoide. Se presentan los datos de los experimentos representativos en esferoides generados a partir de cultivos celulares de cáncer de colon y mama. Se realizaron experimentos similares con otros tipos de tumores, incluidos el colangiocarcinoma, el cáncer gástrico, de pulmón y de páncreas (datos no mostrados). Todos los experimentos presentados en este documento se realizaron por triplicado.
La figura 2 muestra los esferoides que se generaron a partir del cultivo celular primario de cáncer de colon. Como se ve en la Figura 2, el número de esferoides generados depende del número de células inicialmente sembradas en cada pozo. El crecimiento de los esferoides a más de 100 μm de diámetro tomó 10-14 días. El origen de las células tumorales (por ejemplo, diferentes pacientes y diferentes orígenes) determinó la tasa de crecimiento. Sembrar los pozos con más células no acortó el tiempo requerido para la generación de esferoides, sino que aumentó el número de esferoides formados. En particular, tras el cultivo prolongado de los esferoides del cáncer de colon, comenzaron a unirse entre sí y formaron grupos de esferoides en estructuras similares a uvas (Figura 3), lo que impidió un cultivo homogéneo y, por lo tanto, prohibió el uso de los esferoides en los ensayos MTT.
La Figura 4 presenta el efecto de tres tratamientos (10 μM palbociclib, 10 μM sunitinib y su combinación a 10 μM cada uno) sobre la viabilidad de los esferoides derivados de dos cánceres primarios. En este caso, primero se estableció un modelo PDX, y las células tumorales utilizadas para el análisis esferoide se derivaron del modelo PDX9. El primer modelo PDX se estableció utilizando una muestra de cáncer de colon de un paciente masculino de 50 años, y el segundo utilizando una muestra de cáncer de mama de una mujer de 62 años. Como se demuestra en la Figura 4A,B, después de 3 días de tratamiento, la combinación de palbociclib más sunitinib condujo a una reducción significativa de la viabilidad medida por el ensayo MTT. Como se demuestra en la Figura 4C,D, los cambios morfológicos que ocurrieron con el tratamiento fueron muy claros. El día 0, todos los esferoides estaban intactos. En contraste, el día 3, los esferoides tratados con el control (DMSO) todavía estaban intactos, mientras que los esferoides tratados con la combinación fueron desmontados, y su morfología fue "abierta", con células desprendiéndose de la estructura sólida, lo que sugiere la destrucción de la estructura esferoide.
La figura 5 presenta el seguimiento de los esferoides a lo largo del tiempo. Estos esferoides, generados a partir de células de cáncer de mama derivadas de una paciente femenina de 44 años, se trataron con una de dos combinaciones (trastuzumab [10 μg/ml] más vinorelbina [1 μg/ml], o 5-fluorouracilo [200 μM] más cisplatino [300 μM]). Como se muestra en la Figura 5A, el tamaño de los esferoides tratados con 5-fluorouracilo más cisplatino se redujo en el día 3, y los esferoides se destruyeron completamente en el día 7. Por el contrario, el tratamiento con trastuzumab más vinorelbina tuvo solo un efecto menor sobre la morfología de los esferoides (p. ej., algún nivel de estructura "abierta"), pero el efecto no fue significativo. La Figura 5B presenta el cambio promedio en el diámetro de los esferoides en relación con el Día 0 (se siguieron cinco esferoides en cada grupo de tratamiento).
Figura 1: Descripción general del protocolo para establecer esferoides 3D a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluar su sensibilidad a los fármacos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Formación de esferoides a partir de un cultivo primario de células de cáncer de colon a lo largo del tiempo por el número de células inicialmente sembradas. Se sembraron diferentes números de células en "medio de cultivo 3D" en una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja y se observaron bajo el microscopio (aumento 4x). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esferoides de células primarias de cáncer de colon (con una siembra celular inicial de 2.000 por pocillo) después de 12 días en cultivo. Los dos ejemplos (A, B) muestran grupos creados por la unión de esferoides entre sí (aumento de 10x). Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de palbociclib (10 μM), sunitinib (10 μM) y su combinación (10 μM cada uno) sobre los esferoides de células tumorales primarias, incluido el cáncer de colon y de mama (derivado de PDX). Se realizó un ensayo MTT en esferoides derivados de (A) cáncer de colon y (B) células de cáncer de mama. Las señales MTT se normalizaron a valores de células tratadas con DMSO. Los valores representan las medias de cuatro a ocho réplicas. Las barras de error representan SEM. *p < 0,05 frente a un solo agente (prueba t). Los efectos de los diversos tratamientos sobre el crecimiento celular también se evaluaron microscópicamente en el día 0 y después de 3 días de tratamiento de los esferoides derivados de (C) cáncer de colon y (D) cáncer de mama (aumento 10x). Barra de escala = 100 μm. La figura está adaptada de Moskovits et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos de trastuzumab (10 μg/ml) más vinorelbina (1 μg/ml) y 5-fluorouracilo (200 μM) más cisplatino (300 μM) sobre los esferoides derivados del cáncer de mama a lo largo del tiempo. (A) Cada pocillo incluía un esferoide y fue monitoreado a lo largo del tiempo bajo el microscopio (aumento de 10x). Barra de escala = 100 μm. (B) El cambio en el diámetro de los esferoides (en relación con el día 0) por la duración del tratamiento. *p = 0,05 para 5-fluorouracilo más cisplatino versus controles (prueba T). Cada grupo de tratamiento incluyó de cuatro a seis pocillos, con un esferoide en cada pozo. Se presenta el cambio promedio. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El presente protocolo describe un método simple para generar cultivos celulares primarios 3D (esferoides) derivados de muestras de tumores humanos. Estos esferoides se pueden utilizar para diversos análisis, incluida la evaluación de posibles candidatos a fármacos y combinaciones de fármacos, la identificación de posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, y la investigación de los mecanismos de respuesta y resistencia. El protocolo utiliza células tumorales primarias derivadas directamente de muestras de pacientes o células tumorales de modelos PDX, que se pueden establecer utilizando muestras de pacientes. Este último enfoque permite realizar experimentos in vitro e in vivo con el mismo tumor primario. La consistencia ha sido previamente demostrada en los resultados de experimentos de sensibilidad a fármacos entre modelos PDX y cultivos 3D derivados de estos modelos9, apoyando así la relevancia de este enfoque in vitro/in vivo .
Las principales ventajas del protocolo actual incluyen su amplia aplicabilidad a la mayoría de los tumores sólidos y su rentabilidad, que se deriva de su compatibilidad con las capacidades / equipos típicos de los laboratorios de investigación / biología celular del cáncer (es decir, sin necesidad de equipos especializados o subcontratación). Además, el protocolo actual genera una población de esferoides homogénea, lo que permite el uso de ensayos de viabilidad cuantitativa de alto rendimiento (por ejemplo, MTT). La generación de una población de esferoides homogéneos es importante para obtener resultados significativos, ya que los estudios han demostrado que el tamaño del esferoide afecta la respuesta al tratamiento. Los esferoides más grandes, a diferencia de los esferoides más pequeños, se caracterizan por un núcleo necrótico. Sin embargo, la mayoría de las células están en la etapa de crecimiento lineal en esferoides más pequeños. Además, el tamaño del esferoide también afecta la rigidez de su estructura tisular, lo que podría afectar la difusión de compuestos (como los utilizados para los ensayos de viabilidad) en el esferoide14. La principal limitación del protocolo actual es que, incluso con su amplia aplicabilidad, hay casos en que el enfoque no logra generar esferoides. Es importante destacar que tal fracaso no es específico del tipo de tumor, sino más bien específico del paciente. Se requieren estudios adicionales para explorar por qué las muestras tumorales de ciertos pacientes no forman esferoides utilizando este protocolo.
El protocolo actual se basa en dos principios clave: (1) tener una suspensión celular sin grupos de células (es decir, una suspensión de una sola célula) y (2) usar una placa de fijación ultra baja con un medio que contiene una matriz de membrana basal del 5% (una matriz extracelular solubilizada). El número inicial de células sembradas afecta el número de esferoides que se forman, pero no el tiempo requerido para la formación de esferoides, lo que sugiere que cada esferoide se genera a partir de una sola célula tumoral. En particular, se produce la agrupación de esferoides, particularmente después de una incubación prolongada. Esta agrupación interrumpe el cultivo homogéneo y prohíbe el uso de MTT (debido a la dificultad de dispensar un número igual de esferoides en cada pozo). Esta agrupación se puede evitar diluyendo el cultivo y transfiriendo los esferoides a pozos más grandes. Si no se puede lograr un cultivo homogéneo, no se pueden utilizar ensayos MTT, aunque todavía se puede realizar la evaluación morfológica y la medición de los diámetros de los esferoides. Cabe señalar que la evaluación morfológica es más laboriosa ya que requiere la asignación de un esferoide por pocillo y el monitoreo de cada esferoide bajo el microscopio.
Determinar el número apropiado de esferoides para un ensayo MTT es importante para su interpretación. Por lo tanto, se recomienda generar primero una curva estándar con números conocidos de esferoides (por ejemplo, 50, 100, 200 y 400 por pozo, en réplicas) para determinar el número óptimo de esferoides para el ensayo MTT. El medio del rango lineal de la gráfica debe usarse para el análisis de modo que haya suficientes esferoides para detectar una señal pero no demasiados (es decir, para que no se alcance la fase de meseta de la señal). Además, el uso del rango medio permite mantener la señal dentro del rango lineal en casos de respuesta al fármaco (es decir, señal reducida), así como de no respuesta (es decir, el crecimiento continuo del esferoide y el aumento de la señal). Por último, dado que el ensayo MTT evalúa la actividad metabólica celular, que podría ser diferente entre tumores de diferentes pacientes, se debe generar una curva estándar para cada muestra de tumor primario.
En resumen, este protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los fármacos mediante un ensayo de viabilidad celular (MTT) y un examen morfológico bajo el microscopio representa una herramienta valiosa y biológicamente relevante que complementa los enfoques 2D in vitro actuales, así como los enfoques in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
