Summary
Настоящий протокол описывает создание 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток и оценку их чувствительности к лекарственным средствам с использованием анализов жизнеспособности клеток и микроскопических исследований.
Abstract
Несмотря на замечательные успехи в понимании биологии опухоли, подавляющее большинство кандидатов на онкологические препараты, участвующие в клинических испытаниях, терпят неудачу, часто из-за отсутствия клинической эффективности. Эта высокая частота неудач подчеркивает неспособность современных доклинических моделей предсказывать клиническую эффективность, главным образом из-за их неадекватности в отражении гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли. Эти ограничения могут быть устранены с помощью 3-мерных (3D) культуральных моделей (сфероидов), созданных из образцов опухолей человека, полученных от отдельных пациентов. Эти 3D-культуры представляют реальную биологию лучше, чем установленные клеточные линии, которые не отражают гетерогенность опухоли. Кроме того, 3D-культуры лучше, чем 2-мерные (2D) модели культур (монослойные структуры), поскольку они воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия, и сохраняют естественную форму и рост клеток. В настоящем исследовании был разработан метод получения первичных культур раковых клеток от отдельных пациентов, которые являются 3D и растут в многоклеточных сфероидах. Клетки могут быть получены непосредственно из опухолей пациента или ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Метод широко применим к солидным опухолям (например, толстой кишки, молочной железы и легких), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен в полном объеме в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Представлен протокол генерации 3D-моделей опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценки их чувствительности к лекарственным препаратам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Эти многоклеточные сфероиды могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов в лекарства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.
Introduction
Исследования in vitro и in vivo представляют собой взаимодополняющие подходы к разработке методов лечения рака. Модели in vitro позволяют контролировать большинство экспериментальных переменных и облегчают количественный анализ. Они часто служат недорогими платформами для скрининга, а также могут использоваться для механистических исследований1. Однако их биологическая значимость по своей сути ограничена, поскольку такие модели лишь частично отражают микроокружение опухоли1. Напротив, модели in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), фиксируют сложность микроокружения опухоли и больше подходят для трансляционных исследований и индивидуализации лечения у пациентов (т.е. исследования реакции на лекарства в модели, полученной от отдельного пациента)1. Однако модели in vivo не способствуют высокопроизводительным подходам к скринингу лекарств, поскольку экспериментальные параметры не могут контролироваться так же жестко, как модели in vitro, и потому что их разработка требует много времени, труда и средств 1,2.
Модели in vitro доступны уже более 100 лет, а клеточные линии доступны уже более 70 лет3. Однако за последние несколько десятилетий сложность доступных моделей солидных опухолей in vitro резко возросла. Эта сложность варьируется от 2-мерных (2D) моделей культивирования (монослойных структур), которые являются либо укоренившимися клеточными линиями, полученными из опухоли, либо первичными клеточными линиями, до более поздних подходов, включающих 3-мерные (3D) модели1. В 2D-моделях ключевое различие между установленными и первичными клеточными линиями4. Установленные клеточные линии увековечены; Таким образом, одна и та же клеточная линия может использоваться во всем мире в течение многих лет, что с исторической точки зрения облегчает сотрудничество, накопление данных и разработку многих стратегий лечения. Однако генетические аберрации в этих клеточных линиях накапливаются с каждым проходом, что ставит под угрозу их биологическую значимость. Кроме того, ограниченное количество доступных клеточных линий не отражает гетерогенность опухолей у пациентов 4,5. Первичные линии раковых клеток получают непосредственно из резецированных образцов опухолей, полученных с помощью биопсии, плеврального выпота или резекций. Таким образом, первичные линии раковых клеток более биологически значимы, поскольку они сохраняют элементы микроокружения опухоли и характеристики опухоли, такие как межклеточное поведение (например, перекрестные помехи между здоровыми и раковыми клетками) и стволовые фенотипы раковых клеток. Однако репликативная способность первичных клеточных линий ограничена, что приводит к узкому времени культивирования и ограничивает количество опухолевых клеток, которые могут быть использованы для анализов 4,5.
Модели, использующие 3D-культуры, более биологически значимы, чем модели 2D-культур, поскольку сохраняются условия in vivo. Таким образом, 3D-модели культур сохраняют естественную форму и рост клеток и воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия. Наиболее часто используемые 3D-модели в исследованиях рака включают многоклеточные сфероиды, структуры на основе скаффолдов и культуры с матрицей 4,6,7.
Настоящий протокол генерирует 3D-модели опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценивает их чувствительность к лекарственным средствам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, относятся к раку молочной железы и толстой кишки; Тем не менее, этот протокол широко применим к другим типам солидных опухолей (например, холангиокарциноме, раку желудка, легких и поджелудочной железы), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен полностью в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Многоклеточные сфероиды, полученные с использованием этого подхода, могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов на лекарственные средства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.
Этот протокол разделен на три раздела: (1) генерация, сбор и подсчет сфероидов при подготовке к их использованию в качестве модели для тестирования эффективности лекарств; (2) анализ МТТ для оценки эффективности лекарственного средства на сфероидах; и (3) микроскопическая оценка морфологических изменений после обработки сфероидов лекарственными препаратами в качестве еще одного подхода к оценке эффективности лекарственного средства (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сбор образцов опухолей человека, используемых для первичных культур опухолевых клеток, проводился в соответствии с протоколами, одобренными институциональным наблюдательным советом (IRB) в Медицинском центре им. Рабина, с письменного информированного согласия пациентов. Пациенты, имеющие право на участие в исследовании, включали взрослых и детей мужского и женского пола с неметастатическим раком молочной железы, толстой кишки, печени, легких, нейроэндокринным раком, раком яичников или поджелудочной железы, любым детским раком или любым метастатическим раком. Единственным критерием исключения является отсутствие возможности дать информированное согласие.
1. Генерация и сбор сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение первичных опухолевых клеток может быть выполнено, как описано Kodak et al.8. Важно отметить, что первичные опухолевые клетки, используемые для генерации сфероидов, могут быть получены непосредственно из образцов пациентов, полученных с помощью биопсии, резекции и т. д., или косвенно с использованием образцов опухолей из моделей ксенотрансплантата пациента (PDX), как описано Moskovits et al.9.
- Приготовьте одноклеточную суспензию адгезивных первичных опухолевых клеточных культур с 75%-100% слиянием, взяв небольшую колбу (T25) с одноклеточной адгезивной первичной клеточной культурой, удалив среду для клеточных культур, промыв PBS, а затем добавив 1 мл 1x Accutase (раствор для отсоединения клеток) (см. Таблицу материалов) в течение 3 мин при 37 ° C.
- Нейтрализуют раствор аккутазы, добавляя 5 мл среды для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина; см. Таблицу материалов).
- Аспирируйте клетки серологической пипеткой объемом 10 мл и поместите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте пробирку при 800 x g в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалите среду для культивирования клеток, добавьте 5 мл свежей среды для культивирования клеток поверх гранулы клеток и аккуратно перемешайте.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра10. Для этого берут аликвоту 50 мкл клеточной суспензии, и смешивают ее с 50 мкл трипанового синего. Подсчитайте живые клетки (клетки, которые отрицательны для синего цвета) и рассчитайте общее количество живых клеток в суспензии.
- Приготовьте «3D-питательную среду» (среду для культивирования клеток, дополненную 5% матриксом базальной мембраны; см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: «3D-питательная среда» имеет жидкую форму при комнатной температуре. При 37 ° C консистенция становится более гелеобразной (так что клетки остаются вместе), хотя ее все еще можно пипетировать (поскольку она содержит только 5% матрикса базальной мембраны). - Рассчитайте количество клеток, необходимых для анализа, и общий требуемый объем; каждая лунка должна содержать 2 000-8 000 клеток в 200 мкл среды.
- Приготовьте клеточную суспензию с желаемым количеством клеток (например, 4000 клеток) в 200 мкл «3D-питательной среды» и аккуратно перемешайте с пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение.
- Перенесите суспензию в резервуар для пипетки. Используя многоканальную пипетку, добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой (см. Таблицу материалов). Перед каждым сбором клеток хорошо перемешивайте суспензию.
- Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы усилить кластеризацию клеток, тем самым улучшая агрегацию клеток, и инкубируйте планшет при 37 ° C в 5% увлажненном инкубаторе CO2.
- Каждые 2-3 дня обновляйте «3D-питательную среду». Центрифугируйте пластину при 300 x g в течение 10 мин при комнатной температуре, осторожно удалите и выбросьте 50% среды (100 мкл) и добавьте 100 мкл свежей «3D-питательной среды» для замены существующего раствора. Повторите шаг 1.11 и поместите тарелку обратно в увлажненный инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление среды должно производиться, когда пластина удерживается под углом 45°, и среда должна собираться только из верхней части, чтобы избежать скопления клеток. Не следует использовать вакуумную систему всасывания. Свежую среду нужно добавлять медленно и аккуратно, чтобы не нарушить сфероиды, которые уже начнут формироваться. - Осматривайте клетки под микроскопом каждые 1-2 дня, чтобы контролировать образование сфероидов. Измерьте диаметр сформированных сфероидов с помощью инструмента «масштаб» в программном обеспечении для обработки изображений (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопический осмотр должен сначала выявить неправильные круглые и овальные тела, которые принимают сфероидальную форму с течением времени11,12.- Когда диаметр сфероида достигнет 100-200 мкм, проводят эксперименты по эффективности препарата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по эффективности лекарств проводятся, когда сфероиды достигают этого диаметра, поскольку в это время большинство клеток размножаются, что способствует оценке ответа на лечение. Сфероиды большего диаметра содержат некротическое ядро и покойный слой11,12, что приводит к меньшей доле пролиферирующих клеток, которые реагируют на лечение.
- Когда диаметр сфероида достигнет 100-200 мкм, проводят эксперименты по эффективности препарата.
- Для сбора сфероидов используйте пипетку объемом 1000 мкл, чтобы собрать сфероиды из каждой лунки и поместить их в коническую пробирку объемом 15 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды по своей природе хрупкие и требуют бережного обращения. При переносе среды со сфероидами в коническую трубку держите пробирку под углом 45° и медленно пипеткой наносите на стенку пробирки. Сфероиды видны глазу. - Центрифугируйте коническую пробирку при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Добавьте 0,5 мл среды для культивирования клеток и хорошо и осторожно ресуспендируйте гранулу. Избегайте образования пузырей.
- Выполните подсчет сфероидов, выполнив следующие действия.
- Используйте табличку с 96 лунками и нарисуйте знак плюса на нижней стороне колодца, чтобы разделить скважину на квадранты (чтобы помочь отслеживать подсчет).
- Добавьте 50 мкл суспензии в лунку и подсчитайте сфероиды вручную под микроскопом (используя 10-кратную линзу объектива).
- Подсчитайте сфероиды в каждом квадранте, будьте осторожны, чтобы не пересчитать дважды, и рассчитайте общее количество сфероидов в колодце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для точности подсчета насчитайте не менее 50 сфероидов в лунке. Если сфероидов менее 50, аккуратно перемешайте суспензию, чтобы обеспечить однородное распределение, и снова посчитайте, используя больший объем суспензии, добавленный в новую лунку. В качестве альтернативы, если в лунке менее 50 сфероидов, сфероиды можно центрифугировать и осторожно ресуспендировать в объеме <0,5 мл. Если сфероидов более 100, добавьте среду для культивирования клеток в суспензию сфероида, аккуратно перемешайте и пересчитайте. - Рассчитайте концентрацию сфероидов (количество сфероидов/объем подсчета [мкл]), а затем рассчитайте общее количество сфероидов в суспензии (концентрация сфероида × общий объем).
2. Анализ эффективности лекарственного средства (анализ МТТ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробнее см. van Meerloo et al.13. Кроме того, для анализа МТТ необходимо использовать только среду для культивирования клеток, а не «3D-питательную среду» (добавление матрицы базальной мембраны не требуется и потенциально может помешать анализу МТТ).
- В новой пробирке готовят сфероидную суспензию в концентрации 200 сфероидов на 200 мкл среды для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина).
- Для каждого медикаментозного лечения подготовьте запас сфероидов в пробирке объемом 15 мл. Рассчитайте количество, необходимое для каждого препарата, по количеству лунок, необходимых для повторов: (5-8) × 200 мкл. Добавьте препарат в пробирку до конечной необходимой концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с репрезентативным разделом результатов, касающимся лекарств, используемых для настоящего исследования, и их дозировки. Кроме того, коммерческие детали препаратов перечислены в Таблице материалов.
- Для каждого медикаментозного лечения подготовьте запас сфероидов в пробирке объемом 15 мл. Рассчитайте количество, необходимое для каждого препарата, по количеству лунок, необходимых для повторов: (5-8) × 200 мкл. Добавьте препарат в пробирку до конечной необходимой концентрации.
- Перенесите 200 мкл сфероидной суспензии в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой и инкубируйте пластину при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Не используйте для анализа внешние ряды и колонки 96-луночной пластины, так как эти лунки характеризуются повышенным испарением, что может привести к повышенной вариабельности между повторными экспериментами; вместо этого добавьте PBS в эти скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы культура сфероидов была однородной до того, как культура будет аликвотирована в 96-луночную пластину. Кроме того, контрольное условие (т.е. необработанные сфероиды) должно быть включено в каждый эксперимент. - После инкубации сфероидов с исследуемым препаратом в течение 24-72 ч центрифугируют планшет при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют 170 мкл среды для культивирования клеток, оставляя 30 мкл (включая сфероиды) на дне лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление 170 мкл среды для культивирования клеток должно производиться осторожно, чтобы не удалить сфероиды. Держите пластину под углом 45° и положите одну руку (в темной перчатке для контраста) под лунки так, чтобы были видны сфероиды (белые точки). - Приготовьте раствор МТТ (0,714 мг/мл в RPMI, не содержащем фенола, см. Таблицу материалов).
- Добавьте 70 мкл раствора МТТ в каждую лунку до конечного объема 100 мкл на лунку (конечная концентрация МТТ в лунке составит 0,05 мг на 100 мкл). Кроме того, подготовьте «Холостые» лунки с раствором МТТ без ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: МТТ чувствителен к свету. Поэтому свет в вытяжке необходимо выключить, а трубку, содержащую раствор МТТ, накрыть алюминиевой фольгой. - Инкубируют планшет при 37 °C в 5%-ном увлажненном инкубаторе CO2 в течение 3-4 ч до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение цвета раствора в лунках (фиолетовый цвет представляет собой живые клетки).
- При наблюдении изменения добавьте 100 мкл стоп-раствора (0,1 Н HCl в изопропаноле) в каждую лунку и аккуратно перемешайте содержимое лунок, не создавая пузырьков.
- Считайте поглощение пластины в считывателе флуорометра-ИФА (см. Таблицу материалов) при длине волны 570 нм и фоновой длине волны 630-690 нМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеющийся считыватель флуорометра-ИФА не может считывать 96-луночную пластину со сверхнизкой насадкой, перенесите содержимое каждой лунки на соответствующую 96-луночную пластину с плоским дном. - Рассчитайте жизнеспособность клеток, выполнив следующие действия.
- Для каждой скважины рассчитайте «удельный сигнал» («удельный сигнал» = сигнал на длине волны 570 нм – сигнал на длине волны 630-690 нм). Затем рассчитайте среднее значение скважин «Холостые» и вычтите это значение из каждой скважины.
- Рассчитайте среднее значение «специфических сигналов» в контрольных лунках, которые содержат клетки, которые не были обработаны исследуемым препаратом («AV-SS-unt»).
- Рассчитайте жизнеспособность (процент) клеток в каждой лунке относительно лунок с необработанными клетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность = (удельный сигнал в каждой скважине/"AV-SS-unt") × 100
3. Мониторинг и анализ морфологических изменений сфероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается анализа МТТ, в этой оценке следует использовать только среду для культивирования клеток, а не «3D-питательную среду» (добавление матрицы базальной мембраны не является необходимым и потенциально может помешать анализу).
- После подсчета сфероидов разбавьте суспензию в среде для культивирования клеток (питательная среда RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, 1:100 пенициллина-стрептомицина, 1% заменимых аминокислот и 1% L-глютамина) примерно до 1-2 сфероидов на 20 мкл.
- Поместите 80 мкл среды для культивирования клеток в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой, а затем добавьте в лунки 20 мкл сфероидной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом, лунки будут содержать 1-2 сфероида объемом 100 мкл. - Внимательно проверьте лунки под микроскопом и отметьте лунки, которые содержат один сфероид, так как они будут использоваться для этого анализа.
- Приготовьте исследуемый препарат в концентрации, в два раза превышающей интересующую концентрацию. Добавьте 100 мкл раствора препарата в соответствующие лунки (тогда общая концентрация в лунке будет равна 1x).
- Сделайте снимок каждой лунки в день 0 (перед добавлением исследуемого препарата) и используйте инструмент «масштабирования» в программном обеспечении для визуализации (см. Таблицу материалов) для определения диаметров сфероидов.
- Инкубируйте планшет при 37 ° C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2, исследуйте морфологию и измеряйте диаметр сфероидов (с помощью инструмента «масштаб») ежедневно в течение 3-7 дней, в зависимости от того, когда наблюдается эффект препарата (например, диссеминация клеток, инвазивные стручки, разрушение структуры и т. д.).
- В конце эксперимента постройте график изменения диаметров сфероидов (относительно Дня 0) с течением времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение (в процентах) = (диаметр сфероида в определенный день / диаметр этого сфероида в день 0) × 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом протоколе представлены процедуры получения гомогенной культуры сфероидов из первичных опухолевых клеток, количественной оценки эффективности препарата на культуре сфероидов (анализ МТТ) и определения влияния исследуемых препаратов на морфологию сфероидов. Представлены данные репрезентативных экспериментов на сфероидах, полученных из культур клеток рака толстой кишки и молочной железы. Аналогичные эксперименты были проведены с использованием других типов опухолей, включая холангиокарциному, рак желудка, легких и поджелудочной железы (данные не показаны). Все эксперименты, представленные в настоящем документе, были выполнены в трех экземплярах.
На рисунке 2 показаны сфероиды, которые были получены из первичной культуры клеток рака толстой кишки. Как видно на рисунке 2, количество генерируемых сфероидов зависит от количества клеток, первоначально засеянных в каждую лунку. Рост сфероидов до диаметра более 100 мкм занял 10-14 дней. Происхождение опухолевых клеток (например, разные пациенты и разного происхождения) определяло скорость роста. Засев лунок большим количеством ячеек не сокращало время, необходимое для генерации сфероидов, а скорее увеличивало количество образующихся сфероидов. Примечательно, что при длительном культивировании сфероидов рака толстой кишки они начали прикрепляться друг к другу и образовывали скопления сфероидов в виноградоподобных структурах (рис. 3), что препятствовало однородной культуре и, таким образом, запрещало использование сфероидов в анализах МТТ.
На рисунке 4 представлено влияние трех методов лечения (10 мкМ палбоциклиб, 10 мкМ сунитиниб и их комбинация по 10 мкМ каждая) на жизнеспособность сфероидов, полученных из двух первичных видов рака. В этом случае сначала была создана модель PDX, а опухолевые клетки, используемые для анализа сфероидов, были получены из моделиPDX 9. Первая модель PDX была создана с использованием образца рака толстой кишки от 50-летнего пациента мужского пола, а вторая - с использованием образца рака молочной железы от 62-летней женщины. Как показано на рисунке 4A,B, после 3 дней лечения комбинация палбоциклиба и сунитиниба привела к значительному снижению жизнеспособности, измеренному с помощью анализа МТТ. Как показано на рисунке 4C, D, морфологические изменения, происходящие при лечении, были очень четкими. На 0-й день все сфероиды были целы. Напротив, на 3-й день сфероиды, обработанные контролем (ДМСО), были все еще неповрежденными, тогда как сфероиды, обработанные комбинацией, были разобраны, и их морфология была «открытой», с клетками, отделяющимися от твердой структуры, что предполагает разрушение сфероидной структуры.
На рисунке 5 представлено наблюдение за сфероидами с течением времени. Эти сфероиды, полученные из клеток рака молочной железы, полученных от 44-летней пациентки, лечили одной из двух комбинаций (трастузумаб [10 мкг / мл] плюс винорелбин [1 мкг / мл] или 5-фторурацил [200 мкМ] плюс цисплатин [300 мкМ]). Как показано на рисунке 5А, размер сфероидов, обработанных 5-фторурацилом плюс цисплатин, уменьшался к 3-му дню, а сфероиды полностью разрушались к 7-му дню. Напротив, лечение трастузумабом в сочетании с винорелбином оказало лишь незначительное влияние на морфологию сфероидов (например, некоторый уровень «открытой» структуры), но эффект не был значительным. На рисунке 5B представлено среднее изменение диаметра сфероидов по сравнению с днем 0 (в каждой группе лечения наблюдалось пять сфероидов).
Рисунок 1: Обзор протокола для создания 3D-сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценки их чувствительности к лекарствам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Образование сфероидов из первичной культуры клеток рака толстой кишки с течением времени по количеству первоначально засеянных клеток. Различное количество клеток было посеяно в «3D-питательной среде» в 96-луночную пластину со сверхнизкой насадкой и наблюдалось под микроскопом (4-кратное увеличение). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сфероиды из первичных клеток рака толстой кишки (с начальным посевом клеток 2,000 на лунку) после 12 дней в культуре. В двух примерах (A, B) показаны кластеры, созданные прикреплением сфероидов друг к другу (10-кратное увеличение). Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние палбоциклиба (10 мкМ), сунитиниба (10 мкМ) и их комбинации (по 10 мкМ каждый) на сфероиды из первичных опухолевых клеток, включая рак толстой кишки и молочной железы (PDX-производный). Анализ МТТ был проведен на сфероидах, полученных из (А) клеток толстой кишки и (В) рака молочной железы. Сигналы МТТ были нормализованы до значений клеток, обработанных ДМСО. Значения представляют собой среднее значение от четырех до восьми реплик. Полосы погрешностей представляют SEM. *p < 0,05 по сравнению с одним агентом (t-критерий). Влияние различных методов лечения на рост клеток также оценивали микроскопически на 0-й день и через 3 дня лечения сфероидов, полученных из (C) клеток рака толстой кишки и (D) рака молочной железы (10-кратное увеличение). Масштабная линейка = 100 мкм. Рисунок адаптирован из Moskovits et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние трастузумаба (10 мкг/мл) плюс винорелбин (1 мкг/мл) и 5-фторурацила (200 мкМ) плюс цисплатин (300 мкМ) на сфероиды, полученные при раке молочной железы с течением времени. (A) Каждая лунка включала один сфероид и контролировалась в течение долгого времени под микроскопом (10-кратное увеличение). Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Изменение диаметра сфероидов (относительно 0-го дня) на продолжительность обработки. * p = 0,05 для 5-фторурацила плюс цисплатин по сравнению с контрольной группой (t-критерий). Каждая группа лечения включала от четырех до шести лунок, по одному сфероиду в каждой лунке. Представлено среднее изменение. Полосы ошибок представляют собой SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает простой способ получения 3D-первичных клеточных культур (сфероидов), полученных из образцов опухолей человека. Эти сфероиды могут быть использованы для различных анализов, включая оценку потенциальных кандидатов на лекарства и комбинации лекарств, идентификацию потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также исследование механизмов ответа и резистентности. В протоколе используются либо первичные опухолевые клетки, полученные непосредственно из образцов пациентов, либо опухолевые клетки из моделей PDX, которые могут быть установлены с использованием образцов пациентов. Последний подход позволяет проводить эксперименты in vitro и in vivo с одной и той же первичной опухолью. Ранее была показана согласованность результатов экспериментов по лекарственной чувствительности между моделями PDX и 3D-культурами, полученными из этих моделей9, что подтверждает актуальность этого подхода in vitro/in vivo .
Основные преимущества текущего протокола включают его широкую применимость к большинству солидных опухолей и его экономическую эффективность, которая проистекает из его совместимости с типичными возможностями/оборудованием лабораторий по исследованию рака / клеточной биологии (т.е. отсутствие необходимости в специализированном оборудовании или аутсорсинге). Кроме того, текущий протокол генерирует однородную популяцию сфероидов, что позволяет использовать высокопроизводительные количественные анализы жизнеспособности (например, MTT). Создание однородной популяции сфероидов важно для получения значимых результатов, поскольку исследования показали, что размер сфероида влияет на реакцию на лечение. Более крупные сфероиды, в отличие от меньших сфероидов, характеризуются некротическим ядром. Однако большинство клеток находятся в стадии линейного роста в меньших сфероидах. Кроме того, размер сфероида также влияет на жесткость его тканевой структуры, что может повлиять на диффузию соединений (таких как те, которые используются для анализов жизнеспособности) в сфероид14. Основное ограничение текущего протокола заключается в том, что, даже при его широкой применимости, бывают случаи, когда подход не может генерировать сфероиды. Важно отметить, что такой сбой не является специфическим для типа опухоли, а скорее специфическим для пациента. Необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить, почему образцы опухолей от некоторых пациентов не образуют сфероиды с использованием этого протокола.
Текущий протокол основан на двух ключевых принципах: (1) наличие клеточной суспензии без клеточных кластеров (т.е. одноклеточной суспензии) и (2) использование пластины со сверхнизким креплением со средой, содержащей 5% матрикса базальной мембраны (солюбилизированный внеклеточный матрикс). Начальное количество засеянных клеток влияет на количество образующихся сфероидов, но не на время, необходимое для образования сфероидов, предполагая, что каждый сфероид генерируется из одной опухолевой клетки. Примечательно, что скопление сфероидов происходит, особенно после длительной инкубации. Эта кластеризация нарушает однородную культуру и запрещает использование МТТ (из-за сложности дозирования равного количества сфероидов в каждую лунку). Этого скопления можно избежать, разбавив культуру и перенеся сфероиды в более крупные лунки. Если гомогенная культура не может быть достигнута, анализы МТТ не могут быть использованы, хотя морфологическая оценка и измерение диаметров сфероидов все еще могут быть выполнены. Следует отметить, что морфологическая оценка является более трудоемкой, поскольку требует выделения одного сфероида на лунку и мониторинга каждого сфероида под микроскопом.
Определение соответствующего количества сфероидов для анализа МТТ важно для его интерпретации. Таким образом, рекомендуется сначала построить стандартную кривую с известным количеством сфероидов (например, 50, 100, 200 и 400 на скважину в репликах), чтобы определить оптимальное количество сфероидов для анализа МТТ. Середина линейного диапазона графика должна быть использована для анализа, чтобы сфероидов было достаточно для обнаружения сигнала, но не слишком много (т. е. чтобы не была достигнута фаза плато сигнала). Кроме того, использование среднего диапазона позволяет удерживать сигнал в линейном диапазоне как в случаях ответа на лекарственное средство (т.е. пониженного сигнала), так и отсутствия ответа (т.е. продолжающегося роста сфероида и повышенного сигнала). Наконец, поскольку анализ МТТ оценивает метаболическую активность клеток, которая может отличаться между опухолями от разных пациентов, стандартная кривая должна быть создана для каждого первичного образца опухоли.
Таким образом, этот протокол для создания 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток и оценки их чувствительности к лекарственным средствам с использованием анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и морфологического исследования под микроскопом представляет собой ценный, биологически значимый инструмент, который дополняет современные 2D-подходы in vitro , а также подходы in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Никакой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
- Richter, M., et al. From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).
- Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy. Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).
- Choi, J. R., et al. In vitro human cancer models for biomedical applications. Cancers. 14 (9), 2284 (2022).
- Eglen, R. M., Randle, D. H. Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).
- Kodack, D. P., et al. Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care. Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).
- Moskovits, N., et al. Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types. Cancer Letters. 536, 215665 (2022).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery. Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).
- Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: The MTT assay. Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).
- Walzl, A., et al. The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).
