Summary
여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.
Abstract
선충류 Caenorhabditis elegans 는 간단하고 저렴한 배양 기술, 빠른 번식 주기(~3일), 짧은 수명(~3주), 유전자 조작 및 분자 분석을 위한 수많은 도구로 인해 노화 연구에 사용되는 가장 일반적인 모델 시스템 중 하나입니다. 생존 분석을 포함하여 예쁜꼬마선충에서 노화 연구를 수행하는 가장 일반적인 접근 방식은 페트리 플레이트의 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 수십에서 수백 마리의 동물 개체군을 함께 배양하는 것입니다. 이 접근 방식은 동물 개체군에 대한 데이터를 수집하지만 대부분의 프로토콜은 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적하지 않습니다. 여기에 제시된 것은 WorMotels라고 하는 미세 가공 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치에서 개별 동물을 장기간 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 각 장치는 NGM이 포함된 작은 우물에서 최대 240마리의 동물을 배양할 수 있으며, 각 우물은 동물이 도망치는 것을 방지하는 황산구리 함유 해자로 격리됩니다. 원래 WorMotel 설명을 기반으로 하는 이 백서는 일반적인 기술적 복잡성에 대한 설명과 문제 해결을 위한 조언과 함께 각 장치의 성형, 준비 및 채우기에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 소량 NGM의 일관된 로딩을 위한 기술, NGM과 박테리아 식품의 일관된 건조, 약리학적 개입을 제공하기 위한 옵션, PDMS 장치 재사용에 대한 지침 및 실질적인 제한, 습도가 낮은 환경에서도 건조를 최소화하기 위한 팁이 있습니다. 이 기술을 사용하면 페트리 플레이트의 고체 배지에서 그룹 배양을 위한 표준 기술과 유사한 환경에서 자극된 활동, 자극되지 않은 활동, 신체 크기, 움직임 기하학, 건강 범위 및 생존을 포함한 다양한 생리학적 매개변수의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 자동화된 현미경 및 분석 소프트웨어와 함께 사용할 때 고처리량 데이터 수집과 호환됩니다. 마지막으로, 이 기술의 한계에 대해 논의하고 이 접근 방식을 마이크로트레이를 사용하여 고체 배지에서 분리된 선충을 배양하는 최근에 개발된 방법과 비교합니다.
Introduction
예쁜꼬마선충은 짧은 생성 시간(약 3일), 짧은 수명(약 3주), 실험실에서의 재배 용이성, 포유류와의 분자 과정 및 경로의 높은 수준의 진화적 보존, 유전자 조작 기술의 광범위한 가용성으로 인해 노화 연구에 일반적으로 사용됩니다. 노화 연구의 맥락에서 C. elegans 는 살아있는 동물의 노년기 표현형 분석을 위해 수명 데이터와 노인 인구의 빠른 생성을 허용합니다. 웜 노화 연구를 수행하기 위한 일반적인 접근 방식은 6cm 페트리 플레이트의 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 20-70마리의 동물 그룹으로 유지되는 웜 개체군의 수명을 수동으로 측정하는 것입니다1. 연령 동기화 개체군을 사용하면 개체군 전체에 걸쳐 개별 동물의 수명 또는 단면 표현형을 측정할 수 있지만 이 방법은 시간 경과에 따른 개별 동물의 특성을 모니터링하는 것을 배제합니다. 이 접근 방식은 또한 노동 집약적이므로 테스트할 수 있는 모집단의 크기를 제한합니다.
일생 동안 개별 예쁜꼬마선충의 종단적 모니터링을 허용하는 배양 방법은 제한되어 있으며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. WormFarm2, NemaLife3 및 "행동" 칩4(5,6,7)을 포함한 미세 유체 장치를 사용하면 시간 경과에 따른 개별 동물을 모니터링할 수 있습니다. 다중 웰 플레이트를 사용하여 액체 배양에서 벌레를 배양하는 것은 시간이 지남에 따라 개별 동물 또는 작은 개체군의 모니터링을 가능하게 합니다 8,9. 액체 환경은 지방 함량 및 스트레스 반응 유전자10,11의 발현을 포함하여 노화와 관련된 동물 생리학의 측면을 변경할 수 있는 페트리 플레이트의 고체 배지에 대한 일반적인 배양 환경과 구별되는 환경적 맥락을 나타냅니다. 이러한 연구를 노화 예쁜꼬마선충에 대해 수집된 대부분의 데이터와 직접 비교할 수 있는 능력은 잠재적으로 중요한 환경 변수의 차이로 인해 제한됩니다. Worm Corral12는 전형적인 고체 미디어 문화를보다 밀접하게 복제하는 환경에 개별 동물을 수용하기 위해 개발 된 한 가지 접근 방식입니다. Worm Corral에는 하이드로겔을 사용하는 현미경 슬라이드에 각 동물을 위한 밀폐된 챔버가 포함되어 있어 분리된 동물의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 표준 명시야 이미징을 사용하여 신체 크기 및 활동과 같은 형태학적 데이터를 기록합니다. 그러나 동물은 배아로 하이드로겔 환경에 배치되어 평생 동안 방해받지 않습니다. 이를 위해서는 조건부 무균 돌연변이 또는 형질전환 유전자 배경의 사용이 필요하며, 이는 각각의 새로운 돌연변이 또는 이식 유전자가 조건부 불임의 배경으로 교차되어야 하기 때문에 유전자 스크리닝 능력과 치료가 배아로서 동물에게 한 번만 적용될 수 있기 때문에 약물 스크리닝 능력을 모두 제한합니다.
Fang-Yen 연구실에서 개발한 대체 방법은 WorMotel13,14라고 하는 미세 가공된 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치의 개별 웰에 있는 고체 배지에서 벌레를 배양할 수 있습니다. 각 장치는 단일 웰 트레이(즉, 96웰 플레이트와 동일한 치수)에 배치되고 웜이 웰 사이를 이동하는 것을 방지하기 위해 혐오 용액으로 채워진 해자로 분리된 240개의 웰이 있습니다. 각 우물은 수명 동안 단일 웜을 수용 할 수 있습니다. 이 장치는 수분 흡수 폴리아크릴아미드 겔 펠릿("물 결정"이라고 함)으로 둘러싸여 있으며 트레이는 습도를 유지하고 매체의 건조를 최소화하기 위해 Parafilm 실험실 필름으로 밀봉되어 있습니다. 이 시스템을 사용하면 개별 동물에 대한 건강 수명 및 수명 데이터를 수집할 수 있으며, 고체 매체를 사용하면 출판된 대부분의 예쁜꼬마선충 수명 연구에서 동물이 경험한 환경을 더 잘 요약하여 보다 직접적인 비교가 가능합니다. 최근에, PDMS 장치(16) 대신에 원래 미세세포독성 분석(15)에 사용되었던 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 유사한 기술이 개발되었다. 마이크로트레이 방법은 고체 배지 상에서 배양된 웜에 대한 개별화된 데이터의 수집을 허용하고, 전형적으로 도피를 유발하는 조건(예를 들어, 스트레스 요인 또는 식이 제한) 하에서 웜을 함유하는 능력을 향상시켰으며, 각 마이크로트레이는 96마리의 동물만 포함할 수 있는 반면(16), 여기서 활용되는 멀티웰 장치는 최대 240마리의 동물을 포함할 수 있다.
여기에 제시된 것은 플레이트 간 일관성 및 여러 장치의 병렬적 준비에 최적화된 멀티웰 장치를 준비하기 위한 자세한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 Fang-Yen 실험실13의 원래 프로토콜에서 채택되었습니다. 특히, 오염을 최소화하고, 고체 배지와 박테리아 식품 공급원 모두의 일관된 건조를 최적화하고, RNAi 및 약물을 전달하는 기술에 대한 설명이 있습니다. 이 시스템은 개인의 건강 수명, 수명 및 신체 크기 및 모양과 같은 기타 표현형을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 멀티웰 장치는 기존의 고처리량 시스템과 호환되어 수명을 측정할 수 있으며, 이를 통해 기존 수명 실험과 관련된 많은 수작업을 제거하고 대규모로 개별 예쁜꼬마선충의 자동화된 직접 수명 측정 및 건강 추적 기회를 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 원액 및 배지 준비
알림: 멀티웰 장치 준비를 시작하기 전에 다음 스톡 용액과 매체를 준비하십시오.
- 선충 성장 배지(NGM) 및 저융점 NGM(lmNGM)을 위한 스톡 솔루션:
- 1 M K 2 HPO4 준비: 1 L 병에 174.18 g의 K2HPO4를 첨가하고, 멸균 탈이온수로 1 L까지 채운다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 실온(RT)에서 보관합니다.
- 1 M KPi, pH 6.0 준비: 1 L 병에 136.09 g의KH2HPO4를 첨가하고, 이를 멸균 탈이온수로 1 L까지 채운다. pH 6.0까지 1 M K2HPO4 로 적정한다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 RT에서 보관합니다.
- 1M CaCl 2 준비: 500mL 병에 CaCl2 73.5g을 넣고 멸균 탈이온수로 최대 500mL를 채웁니다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 RT에서 보관합니다.
- 1M MgSO 4 준비: 123.25g의 MgSO4를 500mL 병에 넣고 멸균 탈이온수로 최대 500mL를 채웁니다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 RT에서 보관합니다.
- 콜레스테롤 5mg/mL 준비: 콜레스테롤 2.5g, 100% 에탄올 275mL, 멸균 탈이온수 25mL를 호박색 병 500mL에 넣습니다. RT에 보관하십시오.
- 50mM 플록수리딘 준비: 0.1231g의 플록수리딘과 10mL의 멸균 탈이온수를 15mL 원추형 튜브에 넣습니다. 10mL 주사기를 사용하여 0.22μm 필터로 필터 멸균합니다. 10개의 미세원심분리기 튜브에 각각 1mL씩 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 50mg/mL 카베니실린 준비: 15mL 원뿔형 튜브에 500mg의 카베니실린과 10mL의 멸균 탈이온수를 섞습니다. 10mL 주사기를 사용하여 0.22μm 필터로 필터 멸균합니다. 10개의 미세원심분리기 튜브에 각각 1mL씩 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 1mM 이소프로필 ß-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 준비: 15mL 원뿔형 튜브에서 2.38g의 IPTG와 10mL의 멸균 탈이온수를 결합합니다. 10mL 주사기를 사용하여 0.22μm 필터로 필터 멸균합니다. 10개의 미세원심분리기 튜브에 각각 1mL씩 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 100mg/mL 암피실린 준비: 15mL 원추형 튜브에 암피실린 1g과 멸균 탈이온수 10mL를 섞습니다. 10mL 주사기를 사용하여 0.22μm 필터로 필터 멸균합니다. 10개의 미세원심분리기 튜브에 각각 1mL씩 분취하여 -20°C에서 보관한다.
- 일반적인 예쁜꼬마선충 유지를 위한 선충 성장 배지(NGM) 준비
- 50개의 플레이트를 만들기 위해 1L 플라스크에 박토 한천 10g, NaCl 1.5g, 박토 펩톤 1.25g, 초순수 486mL를 섞습니다. 액체 사이클(121°C, 15psig)에서 최소 30분 동안 오토클레이브하여 멸균합니다.
- 오토클레이브 후, 배지가 55°C로 냉각된 후 1M KPi 12.5mL, 1M MgSO4 500μL, 1M CaCl2 500μL, 콜레스테롤 500μL를 추가합니다.
- 멸균 기술을 사용하여 각 60mm 플레이트(총 50개)에 10mL의 배지를 붓습니다. 배지가 고형화된 후(붓기 후 최소 30분), 플레이트 중앙에 밤새 성장한 박테리아 배양(4단계 및 10단계에 따라 준비됨) 300μL를 피펫으로 만듭니다. 플레이트를 벤치에 두어 박테리아 배양 물이 건조되고 두껍게 자랄 수 있도록합니다 (1-2 일). 플레이트를 4°C에서 보관하십시오.
- 저융점 선충 성장 배지(lmNGM) 사전 혼합물을 준비합니다.
- 500mL 플라스크에 저융점 아가로스 4g, 박토 펩톤 0.5g, 초순수 195mL를 섞습니다. 액체 사이클(121°C, 15psig)에서 최소 30분 동안 오토클레이브하여 멸균합니다.
- 배지가 아직 녹는 동안 10mL 분취액을 멸균 유리 시험관에 분배합니다. 각 시험관을 Parafilm으로 밀봉한 다음 시험관 캡으로 밀봉하여 lmNGM 사전 혼합물을 보존하고 건조를 방지합니다. 매체는 응고되어 사용하기 전에 RT에서 ~2주 동안 보관할 수 있습니다.
- 142.8mM NaCl 준비: 250mL 병에 0.8345g의 NaCl과 100mL의 멸균 탈이온수를 섞습니다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 RT에서 보관합니다.
- 세제 용액 준비: 15mL 원뿔형 튜브에 트윈 20 3mL와 멸균 탈이온수 7mL를 섞습니다. 철저히 혼합하고 10mL 주사기를 사용하여 0.22μm 필터로 필터 멸균한 후 RT에 보관합니다.
- 황산구리 용액 준비: 멸균된 50mL 병에 멸균 탈이온수 20mL, CuSO4 0.5g, 세제 용액 100μL(1.5단계에서 준비)를 섞습니다. CuSO4 가 용해 될 때까지 혼합하십시오. RT에 보관하십시오.
- 수분 흡수 폴리아크릴아미드 결정 준비: 오토클레이브 안전 스퀴즈 병에 탈이온수 150mL와 S형 고흡수성 폴리머 1g을 섞습니다. 병을 여러 번 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 액체 사이클(121°C, 15psig)에서 최소 20분 동안 오토클레이브하고 RT에서 보관합니다.
- 용원성 액체(LB) 준비: 1L 이상의 비커에 LB 분말 20g과 탈이온수 1L를 섞습니다. 두 개의 500mL 비커에 분취합니다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 RT에서 보관
- lysogeny broth (LB) 한천 플레이트를 준비하십시오 :
- 1L 플라스크에 LB 분말 10g, Bacto Agar 7.5g 및 탈이온수 500mL를 섞습니다. 액체 사이클(121°C, 15psig)에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
- 원하는 경우 선택적 항생제(오토클레이브 후, 배지를 55°C로 냉각한 후)를 추가합니다: 100mg/mL 암피실린 500μL. 멸균 기술을 사용하여 각 100mm 플레이트(총 25개)에 20mL의 배지를 붓고 4°C에서 보관합니다.
2. 3D 멀티웰 장치 금형 인쇄
참고: 각 장치는 맞춤형 3D 프린팅 금형을 사용하여 PDMS에서 성형됩니다. 단일 금형은 필요한만큼의 장치를 생산할 수 있습니다. 그러나 여러 장치를 동시에 준비하려는 경우 각 장치를 병렬로 만들기 위해 하나의 3D 프린팅 금형이 필요합니다.
- STL 파일을 다운로드합니다( 보충 파일 1 참조).
- 고해상도 3D 프린터로 금형을 인쇄합니다.
알림: 프린터의 해상도는 일관된 우물과 해자 볼륨을 허용할 만큼 충분히 높아야 합니다. 권장 프린터 해상도는 ~40μm의 최소 XY 해상도와 28μm의 레이어 해상도입니다. 3D 프린터에서 사용하는 재료도 마찬가지로 중요한데, 많은 재료 유형이 PDMS의 경화를 방해하기 때문입니다. 경험에 비추어 볼 때 Vero Black 인쇄 재료를 사용하여 고해상도 PolyJet 프린터(해상도: X축 = 600dpi, Y축 = 600dpi, Z축 = 1,600dpi)로 생산된 금형은 일관되게 작동합니다. 이 연구에 사용된 금형의 3D 프린팅은 아웃소싱되었습니다(프린팅 세부 정보는 재료 표에서 찾을 수 있음).
3. 멀티웰 장치의 제조
참고: 이 절에서는 3D 프린팅 몰드를 사용하여 PDMS 멀티웰 장치를 만드는 방법에 대해 설명합니다.
- 예열이 가능하도록 경화 오븐을 55°C로 설정합니다.
- 한 배치로 준비할 장치 수를 결정합니다. 각 장치에 대해 일회용 주걱을 사용하여 대형 일회용 계량 보트(또는 유사한 일회용 용기)에 PDMS 베이스 60g과 경화제 6g을 혼합합니다.
- PDMS 혼합물을 -0.08 MPa의 진공 챔버에 30분 동안 두어 기포를 제거합니다.
- PDMS 혼합물을 각 3D 프린팅 몰드에 붓습니다. PDMS 혼합물이 금형 상단보다 약간 위로 확장되도록 금형을 완전히 채웁니다. 엎질러진 경우 금형을 다시 채우기 위해 과도한 PDMS 혼합물을 보관하십시오.
- 채워진 몰드와 여분의 PDMS 혼합물을 -0.08MPa에서 25분 동안 진공 챔버에 넣어 주입 과정에서 생성된 기포를 제거합니다.
- 진공 챔버에서 채워진 몰드를 제거하고 일회용 주걱으로 남아 있는 기포를 터뜨립니다. 주걱을 사용하여 눈에 보이는 파편이나 남아 있는 기포를 우물에서 떨어진 금형 가장자리까지 털어냅니다. 남아 있는 파편이나 기포는 이후 단계에서 이미징을 방해할 수 있습니다.
- 금형이 PDMS 혼합물로 완전히 채워졌는지 확인하십시오. 혼합물의 작은 부분이 진공 챔버에 있는 동안 또는 이송 중에 유출되는 것이 일반적입니다. 단계 3.5에서 탈기된 여분의 PDMS 혼합물을 사용하여 리필한다. 이렇게 하면 기포가 생기지 않아야 하지만 거품이 생기면 주걱으로 곰팡이 옆으로 부드럽게 닦을 수 있습니다.
- 먼저 한쪽 가장자리를 놓고 아크릴이 금형 위에 평평하게 놓일 때까지 다른 쪽 가장자리를 천천히 내리고 가장자리 위로 뻗어 있는 PDMS 혼합물을 대체하여 평평한 아크릴 시트를 PDMS로 채워진 금형 위에 놓습니다. 아크릴 시트를 놓을 때 기포가 생기면 아크릴을 천천히 제거하고 필요한 경우 PDMS 혼합물로 몰드를 다시 채우고 아크릴 배치를 다시 시작하십시오. 아크릴 시트는 성형 장치의 평평한 바닥을 형성하고 모든 우물이 바닥에 대해 동일한 높이에 있는지 확인합니다.
- 아크릴 위에 2.5lb 추를 놓습니다. 각각 별도의 아크릴 시트가 있는 여러 금형을 쌓을 수 있습니다. 가중 몰드를 오븐에 넣고 55°C에서 하룻밤 동안 경화시킵니다.
- 다음날 오븐에서 추와 틀을 꺼냅니다.
- 아크릴과 경화 PDMS 사이에 면도날을 조심스럽게 넣어 밀봉을 뜯습니다. 금형 상단에서 아크릴을 조심스럽게 제거합니다. PDMS는 이 시점에 의해 설정될 것이며, 아크릴을 제거하는 데는 약간의 힘이 필요할 수 있다.
- 면도기 또는 금속 주걱을 사용하여 경화된 PDMS의 측면을 금형에서 조심스럽게 풉니다. 이 단계에서 PDMS를 찢는 것은 쉽습니다. 가장자리 주위를 천천히 부드럽게 작업하여 PDMS 장치를 온전하게 제거합니다.
참고: 갓 인쇄된 몰드는 처음 세 번 사용할 때 특히 끈적거리며 PDMS는 장치를 제거하려고 할 때 종종 찢어집니다. 더 많이 사용할수록 경화된 PDMS를 금형에서 제거하는 것이 더 쉬워집니다. - 장치를 알루미늄 호일로 싸서 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다. 멸균을 위해 121°C, 15psig에서 최소 15분 동안 건조 주기로 오토클레이브합니다. 오토클레이빙 후 포장된 장치를 벤치에 보관하고 필요에 따라 사용하십시오.
4. 박테리아 줄무늬
알림: 벌레가 다중 웰 장치에 있는 동안 벌레의 먹이원으로 사용할 박테리아를 준비하기 시작합니다. 가장 흔한 박테리아는 대장균 균 주 OP50(또는 RNAi 실험을 위한 균주 HT115)입니다. 장치에 웜을 추가하기 최소 2일 전에 이 단계를 완료하십시오.
- 박테리아를 신선한 LB 플레이트에 줄무늬로 만듭니다. 균주 특이적 선택적 첨가제(예: 박테리아에 암피실린 내성을 부여하는 플라스미드를 선택하기 위한 암피실린)가 LB 플레이트에 포함되어 있는지 확인합니다.
- 콜로니가 자랄 수 있도록 플레이트를 37°C에서 하룻밤(~18시간) 배양합니다.
5. 미디어 로딩을 위한 멀티웰 장치의 제조
알림: 장치를 구성하는 실리콘 PDMS 재료의 표면은 소수성이므로 소량의 우물과 혐오 해자가 각각 NGM과 황산구리로 채워지는 것을 방지합니다. 이 문제를 피하기 위해 산소 플라즈마를 사용하여 장치의 표면 특성을 일시적으로 친수성으로 수정하여 제한된 시간 (최대 ~ 2 시간) 내에 우물과 해자를 채울 수 있습니다. 이 섹션에서는 플라즈마 세척 프로세스를 완료하기 위한 단계를 설명합니다. 플라즈마 청소의 잔류 효과가 얼룩을 방해할 수 있으므로 장치 웰에 박테리아가 있는 것을 발견하기 최소 1일 전에 이 단계를 완료하십시오. 섹션 5-7의 타이밍을 감안할 때 기술자당 이러한 단계에 대한 실제 제한은 병렬로 연결된 세 개의 장치입니다.
- 섹션 6을 준비하기 위해 건조 비드 배스 인큐베이터를 90°C로 예열합니다.
- 멀티웰 장치의 웰을 채우는 데 필요한 총 배지 부피가 페트리 플레이트에 비해 작기 때문에 대량의 NGM을 준비하고 이를 시험관에 분취합니다(1.3단계 참조).
알림: 미디어 튜브를 ~2주 동안 벤치에 보관할 수 있으므로 미리 수행할 수 있습니다. 배지가 준비되고 튜브에 분주된 경우 5.3단계로 진행합니다. - 장갑을 끼고 있는 동안 오토클레이브 멀티웰 장치의 포장을 풉니다. 우물을 만지지 마십시오. 장치의 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 홈을 잘라 사용/재사용 횟수를 나타냅니다(각 장치 청소 및 재사용에 대한 지침 및 권장 사항은 아래 섹션 15 참조).
- 웰이 위를 향하도록 하여 최대 3개의 포장을 뜯지 않은 장치를 플라즈마 클리너에 넣습니다. 플라즈마 클리너를 작동하십시오.
참고 : 다음은 플라즈마 에칭 PE-50 플라즈마 클리너에 대한 자세한 지침입니다. 특정 단계와 설정을 조정하고 다른 플라즈마 클리너에 맞게 다시 최적화해야 합니다.- 플라즈마 청소기 전력 레벨이 75%로 설정되어 있는지 확인하십시오.
- 환기 밸브와 차단 밸브가 모두 OFF 위치에 있는지 확인하십시오.
- 산소 탱크의 메인 밸브를 엽니다. 레귤레이터 압력이 15psig에서 20psig 사이로 떨어질 때까지 기다린 다음 차단 밸브를 ON 위치로 돌립니다.
- 진공 펌프와 플라즈마 청소기를 켭니다.
- 플라즈마 클리너(처음 사용)에 다음 설정을 입력하거나 이전에 프로그래밍한 설정이 올바른지 확인하십시오.
플라스마 시간: 3:00 분
진공 설정값: 149.5 mTorr
대기 배출: 45초
퍼지 벤트: 5초
가스 안정화: 15초
진공 경보: 3:00 분
자동 사이클 오프: 켜짐 - Enter 키를 눌러 명령 메뉴로 이동합니다. 오른쪽 화살표 키를 사용하여 Setup Menu(설정 메뉴)를 선택한 다음 Enter 키를 누릅니다. Enter 키를 눌러 각 현재 설정을 확인한 다음 오른쪽 화살표를 눌러 다음 설정으로 이동하여 모든 설정을 스크롤합니다.
- 위쪽 화살표를 누른 다음 왼쪽 화살표를 눌러 명령 메뉴로 돌아갑니다.
- 명령 메뉴 화면에서 Enter 키를 누릅니다. Enter 키를 눌러 PLASMA 명령을 선택합니다. 시스템은 다음 단계를 순환합니다.
플라즈마 펌프다운
가스 안정화: 이 단계에서 유량계가 1cc/min이 될 때까지 플라즈마 청소기의 Gas 10 손잡이를 조정합니다.
플라즈마 시간
퍼지 펌프다운
플라즈마 사이클 완료
챔버 벤트
참고: 이 프로세스를 완료하는 데 약 5-10분 정도 걸립니다. 모든 단계가 완료되면 명령 메뉴 가 화면에 다시 표시됩니다. 플라즈마 펌프다운 단계에서 압력이 충분히 낮아지지 않으면 플라즈마 청소기가 다음 단계로 진행되지 않고 화면에 오류 메시지가 표시됩니다. 이 경우 진공 펌프 오일을 확인하십시오. 오일 레벨이 낮거나 오일이 흐리거나 더러워진 경우 오일을 교환하면 진공 압력이 필요한 수준에 도달할 수 있습니다. - 산소 탱크의 메인 밸브를 끕니다.
- 아주 천천히 벤트 밸브를 ON 위치로 돌리고 산소 탱크의 레귤레이터 압력이 0으로 돌아갈 때까지 기다립니다.
- 차단 밸브를 OFF 위치로 돌립니다.
- 진공 펌프와 플라즈마 청소기를 끕니다.
알림: 플라즈마 클리너에 의한 멀티웰 장치의 친수성 표면 개질은 일시적이며 시간이 지남에 따라(최대 약 2시간) 점차 효과가 떨어집니다. 섹션 6과 섹션 7을 가능한 한 빨리 진행하십시오.
6. lmNGM으로 우물 채우기
알림: 건식 비드 배스 인큐베이터를 켜고 5.1단계부터 예열해야 합니다. 수조가 90°C에 도달했는지 확인하십시오.
- 트레이 내부에 70% 에탄올을 뿌리고 작업 물티슈로 닦아서 장치당 하나의 단일 웰 폴리스티렌 트레이를 소독합니다.
- 장갑을 낀 손으로 플라즈마 클리너에서 각 장치를 제거하고 깨끗한 트레이에 넣습니다.
- 25 mL 일회용 피펫 대야를 90°C로 가열한 후 비드 배스 인큐베이터에 넣는다.
- 채울 장치당 응고된 lmNGM 예비 혼합물 튜브 하나를 수집합니다(1.3단계 참조).
- lmNGM 예비 혼합 테스트 튜브를 200mL 유리 비커에 넣고 캡과 파라필름을 제거합니다. 미디어가 부을 수 있을 만큼 충분히 녹을 때까지 ~20초 동안 전자레인지에 돌립니다(이 단계에서는 일부 고체 미디어가 있어도 괜찮습니다).
- 여러 테스트 튜브에서 용융된 lmNGM 사전 혼합물을 다른 멸균 200mL 비커에 결합합니다. 추가로 20초 동안 전자레인지를 계속 돌려 총 40초가 됩니다. lmNGM 예비 혼합물이 끓기 시작하면 전자레인지를 멈추고 계속하기 전에 lmNGM 예비 혼합물이 침전되도록 합니다.
- 용융된 lmNGM 예비 혼합물을 전자레인지에서 제거하고 ~60°C로 냉각시킵니다.
알림: 이 단계에서 미디어는 ~5분 후에 냉각되고 다시 응고됩니다. 즉시 6.8 단계와 6.9 단계로 진행하십시오. - 각 10mL의 lmNGM 예비 혼합물에 대해 다음을 추가합니다(순서대로): 1M KPi 250μL, 1M MgSO4 10μL, 1M CaCl2 10μL, 5mg/mL 콜레스테롤 10μL.
- 장치에서 성인을 모니터링할 때 알이 부화하는 것을 방지하려면 10μL의 50mM 플록수리딘을 추가합니다.
- RNAi 플라스미드를 선택하고 RNA의 발현을 유도하려면 50mg/mL 카베니실린 5μL와 1mM IPTG 12μL를 추가합니다.
참고: 항생제 또는 기타 첨가제는 실험 설계에 따라 변경될 수 있습니다. 이 단계에서 테스트 화합물/약물도 배지에 추가할 수 있습니다.
- 용융된 lmNGM을 비드 배스의 25mL 분지에 붓습니다.
- 200μL 멀티채널 리피터 파이펫을 사용하여 lmNGM으로 장치 웰을 채웁니다.
- 14 μL의 분취량을 분주하도록 리피터를 설정합니다(200 μL 피펫 팁을 사용하는 경우 14 μL는 최대 14회까지 분주할 수 있음).
- 5개의 피펫 팁을 장착합니다. 장치의 웰은 384웰 플레이트와 동일한 간격을 가지고 있습니다. 표준 멀티채널 파이펫은 사용자가 행/컬럼의 다른 모든 웰에 피펫팅할 수 있도록 간격이 있습니다.
- 용융된 lmNGM으로 팁을 로드합니다. 처음 14μL를 lmNGM 함유 수조에 다시 분주합니다.
- 빠르지만 조심스럽게 움직여 그림 1B에서 "x"로 표시된 것부터 시작하여 플레이트를 가로질러 오른쪽으로 이동한 다음 아래로 이동하여 총 12회( 60웰) 분주하는 내부 웰( 그림 1B 의 흰색)에 14μL를 분주합니다.
- 최종 분취량은 일반적으로 14μL 미만이므로 나머지 lmNGM을 다시 분주합니다.
- 모든 내부 웰이 채워질 때까지 6.10.3-6.10.5단계를 반복합니다.
- 다음으로, 15 μL의 분취량을 분배하도록 리피터를 설정합니다. 6.10.3-6.10.5 단계를 반복하되 내부 웰 대신 그림 1B에서 "+"로 표시된 웰부터 시작하여 플레이트의 바깥쪽 가장자리를 따라 이동하는 가장 바깥쪽 링( 그림 1B 의 회색)을 채웁니다.
알림: 미디어가 피펫 팁에서 굳지 않도록 빠르게 작업하십시오. lmNGM을 해자에 흘리지 마십시오. 바깥 쪽 우물은 더 빨리 건조되는 경향이 있습니다. 추가 1μL의 lmNGM을 사용하면 최종 건조 웰이 내부 웰과 동일한 건조 시간에 평평한 표면을 가질 수 있습니다.
- 품질 관리 단계로, 각 웰을 검사하여 언더필(lmNGM 표면이 웰 가장자리 아래로 가라앉음), 과충전(lmNGM 표면에 돔형 상단이 있음) 및 기포 또는 파편이 포함된 웰을 포함하여 이미징을 방해할 수 있는 결함이 있는 웰을 식별합니다.
- 짧은 백금 와이어 픽 또는 진공 흡인기로 불만족스러운 웰에서 응고된 lmNGM을 제거합니다. 빈 우물을 새로 용융된 lmNGM으로 다시 채웁니다. 또한 짧은 백금 와이어 픽이나 진공 흡인기로 해자로 넘친 매체를 제거하십시오.
7. 해자에 황산구리 첨가
알림: 이 장치의 우물은 연속적인 해자로 둘러싸여 있습니다. 여기에서 해자는 황산구리로 채워져 방충제 역할을 하고 벌레가 우물에서 도망치는 것을 방지합니다.
- 200μL 피펫을 사용하여 200μL의 황산구리 용액(1.6단계 참조)을 각 모서리의 장치 해자에 2회씩 분주합니다. 이것은 황산구리가 전체 해자를 통해 흐를 수 있을 만큼 충분히 큰 부피여야 합니다. 어떤 지점에서도 해자를 과도하게 채우지 않도록 주의하십시오. 황산구리는 우물의 윗면에 닿지 않아야합니다.
- 황산구리가 전체 해자를 통해 쉽게 흐르지 않으면 짧은 백금 와이어 픽을 사용하여 장력을 끊고 해자를 통해 황산구리를 끌 수 있습니다.
- 황산구리가 해자 전체를 통과한 후 200μL 피펫 또는 진공 흡입을 사용하여 해자에서 가능한 한 많은 황산구리를 제거합니다. 남겨진 잔류 물은 벌레가 우물을 떠나는 것을 막기에 충분합니다. 해자를 황산구리 용액으로 가득 채우면 황산구리가 우물로 쏟아져 벌레가 달아날 위험이 있습니다.
8. 오토클레이브 물 결정 추가
알림: 플레이트 내부의 습도를 유지하고 lmNGM의 건조를 방지하기 위해 각 장치는 포화 수분 흡수 폴리아크릴아미드 결정으로 둘러싸여 있습니다.
- 물 결정을 준비합니다(1.7단계 참조).
- 스퀴즈 병을 사용하여 장치와 트레이 벽 사이의 공간에 물 결정을 추가합니다. 트레이 뚜껑을 닫고 4면을 모두 파라필름으로 감쌉니다. 플레이트를 완전히 밀봉하기 위해 두 개의 파라필름 조각을 추가합니다.
알림: 물 결정은 비커에서 준비하고 멸균된 주걱으로 트레이에 퍼낼 수 있습니다. 그러나 이렇게 하면 절차에 시간이 추가되고 각 트레이가 열려 잠재적인 오염 물질에 노출되는 시간이 늘어납니다. - 박테리아가 발견될 준비가 된 다음 날까지 밀봉된 장치를 벤치에 두십시오. lmNGM을 추가한 후 웰이 위를 향하도록 장치를 보관해야 합니다.
9. 연령 동기화 된 웜 개체군의 준비
참고: 다음 단계는 네 번째 애벌레 단계(L4)에서 멀티웰 장치에 추가할 준비가 된 동기화된 웜 개체군을 생성합니다. 그러나 개발의 다른 단계에있는 웜도 추가 할 수 있습니다. 이 단계는 L4가 필요한 경우 장치에 웜을 추가하기 2일 전에 완료해야 합니다. 원하는 수명 단계에 대한 동기화 타이밍을 조정합니다.
- 일관된 노화 연구를 위해 표준 NGM 플레이트에 예쁜꼬마선충 을 유지하십시오(잘 공급된 조건에서 20°C에서 1.2단계 참조).
- 표준 방법(예: 표백17 또는 시간 제한 알을 낳는 방법)을 통해 스톡 플레이트에서 동기화된 동물 개체군을 얻습니다.
- 박테리아가 발견된 NGM 플레이트에 분리된 알을 추가합니다. 알은 이 판에서 부화할 것이고, 벌레는 야생형 동물의 경우 2일 안에 L4 애벌레 단계에 도달할 것입니다.
10. 세균 배양액 접종
참고: 박테리아는 예쁜꼬마선충, 가장 일반적으로 대장균 균주 OP50 또는 HT115의 주요 식품 공급원으로 사용됩니다. 박테리아는 10 배 농축되어 있으며, 이는 준비된 배양 물의 양에서 설명되어야한다. 장치를 발견하기 전날 박테리아 배양을 준비하십시오.
- 단계 4에서 제조된 LB 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 점착할 장치당 멸균 LB 12mL를 접종합니다. 사용 중인 박테리아 균주에 필요한 경우 선택적 제제를 포함합니다.
- 박테리아 배양액을 ~250rpm으로 진탕하면서 37°C 인큐베이터에서 하룻밤(~18시간) 성장시킵니다.
11. 농축된 박테리아가 있는 우물 발견하기
알림: 소량의 농축 박테리아가 각 웰에 추가되어 장치에서 전체 수명 동안 벌레에게 먹이를 주기에 충분합니다. 벌레를 우물에 추가하기 전에 박테리아 배양을 건조시켜야 합니다. 각 웰의 배지 부피는 추가된 박테리아 부피(5μL)에 비해 작기 때문에(14-15μL) 박테리아 배지의 화학적 함량은 웰의 화학적 환경에 영향을 줄 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 박테리아는 저삼투압 스트레스를 피하면서 고갈된 LB를 제거하기 위해 농축되고 바닷물에 재현탁됩니다. 이 단계에서 추가되는 lmNGM 레시피(1.3-1.4단계 참조)에는 소금이 추가되지 않습니다.
- 섹션 10에 기재된 바와 같이 박테리아를 밤새 성장시킨 후, 박테리아 배양액을 10x 농축한다. ~3,400 x g 에서 20분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화하고, 상층액을 폐기하고, 펠릿을 원래 배양 부피 142.8mM NaCl의 1/10에 재현탁합니다(1.4단계 참조). 예를 들어, 하나의 240웰 장치를 발견하려면 12mL의 배양물을 스핀다운하고 1.2mL의 142.8mM NaCl에 재현탁합니다.
참고: 테스트 화합물/약물은 스포팅 전에 재현탁된 세균 배양에 추가할 수 있습니다. - 반복 피펫을 사용하여 농축된 박테리아 5μL로 각 웰을 스팟합니다. 피펫 팁이 lmNGM을 뚫고 웜이 웰 표면 아래로 파고들 수 있으므로 lmNGM 표면과의 직접적인 접촉을 피하십시오. 벌레가 해자에 끌려 해자로 도망칠 수 있으므로 박테리아가 해자로 쏟아지지 않도록 주의하십시오.
- 트레이 뚜껑을 제거한 상태에서 얼룩진 박테리아를 말리십시오. 이 단계는 유정 환경의 장기적인 무결성에 중요하며 점박이 장치를 건조시키는 다양한 방법이 있습니다. 어떤 방법을 사용하든 박테리아가 건조되는 동안 덮개를 덮지 않은 상태로 두어야 하므로 장치를 멸균 환경에 두십시오. 공기 흐름이 증가하면 건조 시간이 크게 단축됩니다. 건조는 아래 단계에 설명된 대로 수행할 수 있습니다.
- 10% 표백제와 70% 에탄올로 세척한 플라스틱 통과 같은 깨끗하고 밀봉된 용기에 장치를 덮지 않은 상태로 두십시오. 이 건조 방법은 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
- 덮개를 덮지 않은 장치를 멸균 층류 후드에 넣습니다(아래에서 선호하는 방법과 유사).
- 컴퓨터 케이스 팬과 HEPA 필터를 사용하여 최소한의 비용으로 구성할 수 있는 맞춤형 "건조 상자"(이 연구에서 따랐던 최적화된 방법)를 사용하여 장치를 건조시킵니다( 보충 파일 1 참조).
알림: 사용된 방법에 관계없이 건조 단계는 현지 환경에 맞게 최적화되어야 합니다. 일반적인 건조 시간이 확인될 때까지 웰이 얼마나 빨리 건조되는지 자주 모니터링합니다. 습도가 낮은 환경에서 건조 상자를 사용하면 건조 시간이 ~30-40분이 됩니다. 우물의 매체가 줄어들고 가라 앉을 수 있으므로 판이 너무 건조하지 않도록하십시오. 몇 개의 우물이 아직 젖어 있는 동안 장치를 건조에서 제거하는 것이 더 오래 건조시키고 잠재적으로 많은 수의 우물을 과도하게 건조시키는 것보다 낫습니다.
- 물 결정을 확인하십시오. 트레이에 있는 대부분의 물 결정이 건조 과정에서 건조되어 부피가 손실된 경우 트레이에 더 추가하십시오.
- 박테리아가 마르면 즉시 벌레를 추가하거나(섹션 12) 나중에 사용할 수 있도록 트레이를 밀봉하십시오. 밀봉하려면 트레이 뚜껑을 닫고 4면을 모두 파라필름 한 조각으로 감쌉니다. 총 3개의 파라필름 레이어에 대해 두 번 반복합니다. 트레이를 완전히 감싼 후 장치를 실온에서 최대 4일 동안 벤치에 두었다가 웜을 추가할 수 있습니다(섹션 12).
12. 멀티웰 장치에 웜 추가
- 플래티넘 픽을 사용하여 각 웰에 웰당 하나의 웜을 수동으로 추가하여 섹션 9에서 준비한 웜 플레이트에서 동물을 옮깁니다. 원하는 생애 단계와 나이에 맞는 벌레 만 선택하십시오.
알림: 장치에 웜을 추가하는 데 1시간 이상 걸리면 lmNGM이 건조될 수 있으므로 가능한 한 빨리 웜을 추가해야 합니다. 장치 웰에 추가하기 전에 한 번에 여러 개의 웜(20+)을 선택하면 속도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.
13. 장기간 사용을위한 장치 준비 완료
알림: 이 단계는 실험 기간 동안 장치 웰이 수화 상태를 유지하도록 합니다.
- 물 결정을 검사하십시오. 물 결정이 장치 상단과 수평을 이루지만 넘치지 않는지 확인하십시오. 필요한 경우 트레이에 물 결정을 추가합니다.
- 준비된 세제 용액 한 방울(1.5단계 참조)을 트레이 뚜껑 안쪽에 떨어뜨리고 세제 용액이 마를 때까지 작업용 물티슈로 문지릅니다. 이렇게 하면 장치를 트레이 내부에 밀봉한 후 뚜껑에 김서림이 방지되어 웜이 명확하게 보입니다.
- Parafilm 씰의 장기적인 무결성을 촉진하는 특정 기술을 사용하여 세 조각의 Parafilm으로 트레이를 감쌉니다.
- 트레이의 양면만 덮도록 Parafilm 조각을 약간 늘립니다. 다른 두 면을 덮기 위해 두 번째 Parafilm 조각으로 이것을 반복합니다.
- 파라필름의 첫 번째 레이어 위에 겹쳐서 파라필름의 마지막 조각을 가져다가 완전히 펴고 네 면을 모두 감쌉니다. 제대로 밀봉된 경우 장치 웰은 ~2개월 동안 수분을 유지해야 합니다.
참고: 파라필름 무결성은 1-2주마다 모니터링해야 하며, 파라필름이 파손된 경우 교체해야 합니다.
- 70% 에탄올로 적신 작업 물티슈를 사용하여 트레이 상단에서 지문을 제거합니다.
14. 데이터 수집
참고: 이 연구의 목적은 문화 방법론을 설명하는 것입니다. 일단 채워지면, 멀티웰 장치는 다양한 표현형의 종단 모니터링과 호환됩니다. 여기에서는 가장 일반적인 몇 가지 매개 변수를 측정하기 위한 기본 지침을 제공합니다.
- 수명: 접시를 두드리거나 1-3일마다 웜을 밝은 청색광에 노출시켜 수명을 모니터링합니다. 움직임이 관찰되지 않으면 죽은 것으로 점수가 매겨집니다. 이러한 멀티웰 장치는 또한 수명을 추정하기 위한 자동화된 이미징 및 분석 파이프라인과 호환된다(13,18).
- 활동: 장치 우물에 있는 동물의 정적 이미지 또는 비디오를 촬영하고 이동 거리, 속도 또는 기타 이동 지표를 평가하여 평생 동안 개별 동물의 활동을 모니터링합니다. 이 장치는 또한 활동을 추정하기 위한 자동화된 이미징 및 분석 파이프라인과 호환됩니다(13,18).
- 신체 크기 및 모양: 장치 웰에서 동물의 정적 이미지를 촬영하고 표준 이미징 기술을 사용하여 시각적 매개변수를 정량화하여 신체 크기 및 모양의 변화를 모니터링합니다. 원칙적으로, 이 배양 방법은 벌레 체형의 보다 정교한 평가를 위해 기존 소프트웨어와 호환되어야 한다 19,20,21.
15. 장치 재사용
알림: 실험이 완료된 후 멀티웰 장치를 최대 3번까지 세척하고 재사용할 수 있습니다. 추가적인 재사용은 웜 표현형에 영향을 미치기 시작하는데, 이는 PDMS 재료의 벽에 축적된 배지 또는 박테리아의 화학 물질로 인해 발생할 수 있습니다.
- Parafilm을 버리고 트레이에서 장치를 제거합니다. 장치의 오른쪽 상단 모서리에 있는 노치를 확인하여 사용한 횟수를 나타냅니다. 세 번 사용한 경우 장치를 폐기하십시오. 3회 미만 사용한 경우 청소하여 재사용하십시오.
알림: 트레이는 폴리스티렌으로 만들어졌으며 lmNGM, 박테리아 또는 매체 첨가제와 직접 접촉하지 않습니다. 시각적으로 선명하게 유지되는 한 여러 번 재사용할 수 있습니다. - 트레이에 남아 있는 물 결정을 헹굽니다. 트레이 내부에 10% 표백제 용액을 뿌리고 10분 동안 그대로 둡니다. 탈이온수로 헹구고 물 얼룩을 피하기 위해 즉시 건조시키십시오.
- 흐르는 물에 장치를 잡고 우물에서 매체를 청소하기 시작합니다. 우물에서 매체를 느슨하게 하기 위해 물 아래에서 장치를 부드럽게 구부리고 비틀되 장치가 찢어질 정도로 구부리지 마십시오. 200μL 피펫 팁으로 웰에 남아 있는 배지를 골라냅니다.
- 2L 비커에 젓가락 ~3/4을 탈이온수로 채우고 뜨거운 접시에서 끓입니다.
- 끓는 물에 하나 또는 두 개의 다중 우물 장치와 교반 막대를 추가합니다. 마그네틱 교반을 저속(~200rpm)으로 켜서 물 속의 장치를 부드럽게 교반합니다. 장치를 10분 동안 끓입니다.
- 금속 핀셋으로 물에서 장치를 제거하고 종이 타월에 잘 뒤집어 물기를 뺍니다. 장치를 최소한 밤새 건조시키십시오.
- 장치가 완전히 건조되면 호일로 싸서 오토클레이브 테이프로 밀봉합니다. 오토클레이브 테이프에 장치가 사용된 횟수를 기록하십시오. 멸균을 위해 121°C에서 15분 동안 건조 주기로 오토클레이브합니다. 이제 장치를 다시 사용할 준비가 되었습니다.
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Representative Results
WorMotel 배양 시스템은 수명, 건강 수명 및 활동과 관련된 다양한 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 발표된 연구에서는 다중 웰 장치를 사용하여 수명과 건강 기간 13,14, 정지 및 수면 22,23,24, 행동 25를 연구했습니다. 수명은 수동으로 또는 이미지 수집 및 다운스트림 이미징 분석을 통해 점수를 매길 수 있습니다. 전자의 접근법에서, 벌레는 1-3일마다 자극(예: 플레이트 두드리기 또는 청색광에 노출)에 따라 수동으로 관찰할 수 있으며, 페트리 플레이트1의 표준 방법과 유사하게 움직임이 관찰되지 않으면 죽은 것으로 점수를 매길 수 있습니다. 후자의 접근 방식은 자극이 적용된 후 촬영된 이미지 간의 프레임 간 차이를 비교하여 웜 이동을 결정할 수 있다는 점을 제외하고는 유사합니다. 이것은 운동이 그 시점에서 개별 동물의 활동 수준에 대한 정보를 제공하고 수명(예: 운동 중단)과 건강 수명(여러 정의가 제안됨)을 결정할 수 있는 메트릭을 제공한다는 점에서 추가적인 이점을 제공합니다. 이미지는 신체 크기, 신체 모양 및 신체 자세와 같은 추가 생리학적 매개변수를 추출하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.
시스템의 용량을 입증하기 위해 우리는 개별 동물의 수명, 건강 수명 및 일상 활동의 맥락에서 유전자 daf-2에 의해 암호화된 인슐린 수용체와 daf-16에 의해 암호화된 다운스트림 FOXO 계열 전사 인자 사이의 고전적인 epistatic 관계를 조사했습니다. 야생형(균주 N2) 및 daf-16(mu68) 기능 상실(균주 CF1038) 중 하나를 발현하는 대장균(균주 HT115)을 먹인 예쁜꼬마선충(빈 벡터; EV) 또는 daf-2 RNAi 섭식 구축물을 멀티웰 장치에서 배양하고, 각각의 동물을 수명 (도 2A), 건강 기간 (도 2B) 및 일일 활동 (도 2C)에 대해 모니터링하였다. 활동을 자극하기 위해 벌레를 1분에 5초 동안 밝은 청색광에 노출시켜 2분 동안 5초마다 일련의 정지 이미지를 촬영하여 활동을 매일 모니터링했습니다(Churgin et al.13에 따름). 각 동물의 일일 활동은 우물과 이미지에서 배경을 정규화하고, 각 이미지에서 벌레 영역을 식별하고, 인접한 이미지 사이의 영역 변화를 계산하여 추정되었습니다. 수명은 각 벌레에 대해 활동이 마지막으로 관찰된 나이로 정의되었고, 건강 수명은 벌레가 더 이상 전신 길이를 움직일 수 없는 나이로 정의되었습니다. 수많은 이전 연구(예: Kenyon et al.26, Murphy et al.27)에서 예상한 바와 같이 daf-16(mu86) 돌연변이는 수명을 단축하고 daf-2의 RNAi 녹다운으로 인한 수명 연장을 방지했습니다(그림 2A). healthspan에 대해서도 유사한 패턴이 관찰되었습니다(그림 2B). 다중 웰 장치 배양 시스템을 사용하는 이점으로, 평생 동안 개별 동물을 추적할 수 있는 능력을 통해 개체군 전체에 걸쳐 측정된 각 표현형의 개별 변이를 자세히 분석할 수 있습니다. 예를 들어, 개별 동물의 수명과 건강 수명의 차이는 절대적인 용어(그림 2D) 또는 전체 수명의 일부(그림 2E)로 비교할 수 있습니다. 초기 생애 표현형은 개체군 전체의 개별 동물에서 수명을 포함한 후기 생애 표현형과 추가로 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 수명 전반에 걸쳐 각 개별 동물의 누적 활동(즉, 개별 활동에 대한 곡선 아래 면적[AUC])은 측정된 모든 조건에서 수명 5일까지의 누적 수명(그림 2G)보다 수명(그림 2F)과 더 나은 상관관계가 있습니다. 우리는 이 작업의 목적이 장치를 사용하여 특정 표현형을 측정하기 위한 것이 아니라 시간 경과에 따라 개별 동물을 추적하기 위한 다중 웰 환경을 구축하기 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것임을 강조합니다. 그림 2에 제시된 대표적인 결과는 이 시스템에서 측정할 수 있는 표현형의 한 가지 예에 불과합니다. 일단 구축되면 멀티웰 환경은 고체 매체에서 자유 크롤링 웜의 표현형을 측정하기 위한 광범위한 기술과 호환됩니다.
그림 1: 미세 제작된 멀티웰 장치의 개략도 . (A) 개별 예쁜꼬마 선충은 개별 웰에 박테리아 식품을 파종한 고체 저용융 선충 성장 배지(lmNGM) 아가로스 패드에서 배양됩니다. 우물 사이의 공간은 우물 내의 각 벌레를 격리하기 위해 혐오스러운 화학 물질 (황산구리)로 코팅됩니다. 각 장치는 단일 웰 트레이 내부에 고정되어 있습니다. 트레이의 둘레는 습도를 유지하기 위해 물 결정으로 채워져 있습니다. 트레이는 산소 교환이 가능하도록 Parafilm으로 밀봉되어 있습니다. BioRender.com 로 만든 이미지입니다. (B) 웰을 로딩하기 위해 제안된 순서를 나타내는 멀티웰 장치의 개요. 내부 웰(흰색)은 14μL의 lmNGM을 받습니다. 외부 웰(회색)은 15μL의 lmNGM을 받습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다중 웰 장치를 사용하여 개별 동물의 개체군에서 측정된 표현형의 상관관계. 모든 패널은 빈 벡터 EV(RNAi)의 대상이 되는 야생형(N2) 동물(N = 138), daf-2(RNAi)의 대상이 되는 야생형 동물(N = 151), EV(RNAi)의 대상이 되는 daf-16(mu86) 동물(N = 123) 및 daf-2(RNAi)의 대상이 되는 daf-16(mu86) 동물(N = 135)의 네 가지 동물 그룹을 비교하는 동일한 실험의 데이터를 제공합니다. (A) daf-2(RNAi)의 수명 연장은 daf-16(mu86) null 돌연변이에 의해 차단됩니다. 로그 순위 검정(R의 survdiff 함수)에 의해 결정된 그룹 간의 쌍별 유의성. (B) 동물이 daf-2(RNAi)에서 전신 길이 연장을 더 이상 움직일 수 없는 날로 정의된 건강 수명은 daf-16(mu86) null 돌연변이에 의해 차단됩니다. 로그 순위 검정(R의 survdiff 함수)에 의해 결정된 그룹 간의 쌍별 유의성. (C) 수명 전반에 걸친 3일 롤링 평균 활성은 daf-16(mu86) 및 daf-2(RNAi) 모두에 의해 감소합니다. 그룹 간 개별 동물의 수명 전반에 걸친 활동에 대한 곡선 아래 면적을 비교하기 위해 Mann-Whitney U 테스트로 계산한 유의성. (D) 절대값으로서의 각 모집단의 건강 수명 및 수명(평균의 평균 ± 표준 오차). (E) 각 그룹 내의 총 수명으로 정규화된 각 모집단의 건강 수명 및 수명(평균의 평균 ± 표준 오차). (F) 선형 회귀(R의 lm 함수)로 계산된 개별 동물의 수명 전반에 걸친 누적 활동(수명 전반에 걸친 곡선 아래 면적[AUC])은 (G) 수명 전반에 걸쳐 특정 날짜의 개별 동물의 활동보다 수명과 더 나은 상관 관계가 있습니다(평균 활동이 최대화되는 지점을 나타내는 8일의 활동 상관 관계가 표시됨). n.s. = 유의하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 모든 p-값은 각 패널 내에서 이루어진 비교를 위해 Bonferroni 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 조정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 3D 멀티웰 장치 금형 인쇄를 위한 STL 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
WorMotel 시스템은 시간이 지남에 따라 수백 개의 고립된 예쁜꼬마선충 에 대한 개별화된 데이터를 수집하기 위한 강력한 도구입니다. 발달 정지, 운동 행동 및 노화 응용 분야에 다중 웰 장치를 사용한 초기 연구에 이어 이 작업의 목표는 더 높은 처리량 방식으로 활동, 건강 및 수명을 장기간 모니터링하기 위한 다중 웰 장치의 준비를 최적화하는 것이었습니다. 이 작업은 원래의 프로토콜(13)로부터의 많은 단계들을 최적화하는 멀티웰 장치들을 준비하기 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 기술적 어려움을 제시할 수 있는 핵심 포인트들을 강조하며, 플레이트 및 다른 재료들을 재사용하는 것에 관한 논의를 제공한다.
현재 일반적인 주에 10개에서 20개 사이의 장치를 준비하는 랩으로서 확장을 위해 가장 중요한 고려 사항은 장치를 재사용할 수 있는지 여부와 재사용할 수 있는 경우 어느 정도까지 재사용할 수 있는지였습니다. 페트리 플레이트에서 전통 배양을 수행하는 것에 비해 PDMS 장치를 준비하는 데 드는 시간과 비용 측면에서 더 높은 비용이 들지만, 이러한 높은 비용은 PDMS 또는 시스템의 다른 구성 요소를 재사용함으로써 줄일 수 있습니다. 많은 재사용으로 인해 PDMS는 lmNGM 배지 또는 박테리아의 화합물 축적을 반영하는 노란색을 띠기 시작했습니다. 이 접시에서 배양 된 동물은 또한 더 높은 도주 율과 수명 단축을 보였다. 수십 번의 실험을 기반으로 이러한 PDMS 장치를 재사용하는 데 세 가지 용도가 최적이며, PDMS 성능 저하로 인한 측정 가능한 영향 없이 노화 관련 표현형을 평가할 수 있으며 성형해야 하는 새로운 장치의 수를 줄일 수 있습니다(따라서 비용 절감). 우리는 또한 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 사용에서 장치에서 자란 실험 일치 동물이 거의 구별할 수 없고 통계적으로 다르지 않은 생존 곡선을 생성했음을 확인했습니다(데이터는 표시되지 않음). 장치를 보관하는 데 사용되는 트레이는 폴리스티렌으로 만들어졌으며 웜 시각화를 방해할 수 있는 긁힘이나 기타 자국이 없으면 무기한 청소하고 재사용할 수 있습니다.
~2주 이상 지속되는 응용 분야를 위한 멀티웰 장치를 준비하기 위한 주요 과제는 환경 박테리아 및 곰팡이에 의한 플레이트 오염을 방지하는 것입니다. 오염을 방지하기 위해 멸균이 중요한 여러 단계가 있습니다. 여기에는 사용 전에 모든 장치를 고압증기멸균하고, 재사용용 장치를 끓이고, 습도를 유지하는 데 사용되는 흡수성 결정체를 고압증기멸균하고, 사용하기 전에 표백제와 에탄올로 장치가 들어 있는 트레이를 청소하고, 김서림을 방지하기 위해 트레이 뚜껑에 도포하고 황산구리 용액에 첨가하는 세제 용액을 필터 살균하는 것이 포함됩니다. 이러한 각 변경 사항을 구현하면 오염 사건이 현저히 감소하여 >45일 동안 모니터링해야 하는 수명이 긴 조건(예: daf-2 녹아웃)에서도 수명 전반에 걸쳐 종단 모니터링에 밀봉된 장치를 일관되게 사용할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 일관된 웰 건조를 유지하고 건조를 방지하도록 설계된 장기 적용을 위한 원래 프로토콜에 대한 두 가지 수정 사항이 포함되어 있습니다. 먼저, 장치의 전체 깊이를 2mm 증가시켜 물 결정의 용량을 증가시켰다. 특히 습도가 낮은 환경에서 오랜 실험을 통해 트레이에 물 결정이 너무 적어 lmNGM이 건조되었습니다. 더 많은 물 결정과 함께, 장치의 가장자리를 따라 우물에 첨가 된 아가로스의 양을 증가시킬 필요가있었습니다. 이 우물은 우물 로딩 (섹션 6)에 따라 먼저 건조되고 수축하는 경향이 있습니다. 내부 웰에 14 μL의 아가로스를 사용하는 것은 웰을 과충전하여 발생하는 돔형 상부를 생성하지 않고 웰을 완전히 채우기에 충분한 부피였습니다. 15 μL의 아가로스를 외부 웰에 첨가하면 웰이 마르기 시작할 때 내부 웰에 첨가된 14 μL에 필적하는 수준으로 수축할 수 있는 충분한 부피가 제공되었습니다.
원래 프로토콜에서 가장 큰 편차 중 하나는 사용자가 lmNGM(섹션 6)과 황산구리(섹션 7)를 로드하는 순서를 반대로 한 것입니다. 원래, 황산구리를 먼저 해자에 첨가 한 다음, 우물을 lmNGM13으로 채웠다. 플라즈마 세정 직후 lmNGM으로 웰을 채우는 것이 웰 벽에 대한 lmNGM의 부착을 향상시키는 것으로 관찰되었습니다. 플라즈마 세척 후 너무 오래 기다리면 기포와 돔형 상단이 있는 우물이 생겨 웜을 시각화하는 데 방해가 될 수 있습니다. 일관되고 고품질의 lmNGM 표면을 보장하기 위해 동시에 여러 장치를 준비할 때 황산구리를 첨가하는 것보다 웰을 채우는 것을 우선시하는 것이 특히 중요합니다. 웰을 먼저 채우는 것의 단점은 플라즈마 클리너에 의해 생성된 친수성 표면 개질이 사용자가 황산구리를 첨가할 때까지 눈에 띄게 마모된다는 것입니다. 황산구리는 표면이 친수성이 낮아지면 해자를 통해 쉽게 흐르지 않으므로 완전한 피복을 달성하기가 어렵습니다. 계면활성제 역할을 하는 황산구리 용액에 세제를 첨가하면 해자를 통한 용액의 흐름이 개선됩니다. 백금 와이어 픽을 사용하여 황산구리가 흐르기 어려운 지점에서 장력을 깨고 해자를 통해 황산구리를 부드럽게 안내할 수도 있습니다. 또한, 황산구리 용액이 해자에 남아 있으면 트레이를 기울일 때 우물로 쉽게 유출되어 lmNGM 표면을 오염시킬 수 있습니다. 로딩 프로세스의 특성으로 인해 구리가 우물의 하위 집합을 오염시키는 것을 방지하기 위해 장치를 전체적으로 충분히 수평으로 유지하는 것은 거의 불가능합니다. 이를 설명하기 위해 황산구리 용액을 해자에서 제거하고(7.3단계) 남은 잔류 황산구리는 대부분의 벌레가 도망치는 것을 막기에 충분합니다. 혐오성 장벽으로 황산구리를 사용하는 것에 대한 마지막 참고 사항으로, 일부 방충제는 수명을 포함한 연령 관련 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 다중 우물 장치에서 황산구리의 사용은 Churgin et al.13 에 의해 조사되었으며 수명이나 발달에 감지 가능한 영향이 없는 것으로 나타났습니다.
프로토콜에 대한 다른 사소한 업데이트는 PDMS를 준비하기 위해 취한 단계를 개선하는 데 중점을 둡니다. PDMS 베이스와 경화제를 혼합한 후 추가적인 탈기 단계를 거쳤는데, 이는 많은 기포가 발생하는 공정이기 때문이다. 혼합물을 장치 몰드에 첨가하기 전에 대부분의 기포를 제거하면 두 번째 탈기 단계 후에 남아 있는 기포를 최소화할 수 있습니다. 장치의 바닥이 완전히 평평하고 균일하도록 하기 위해 전체 플레이트 이미징에 중요한 기능인 유리 또는 아크릴 조각을 채워진 금형의 상단에 놓았습니다. 이 단계는 사용자가 각 웰에 대한 초점을 수동으로 조정할 수 있으므로 한 번에 하나의 웰만 검사하는 응용 프로그램에는 필수는 아니지만 여전히 유용합니다. 마지막으로, PDMS를 원래 프로토콜에 의해 표시된 40°C(미국 펜실베니아주 필라델피아에서 최적화됨)와 달리 이 버전의 프로토콜이 최적화된 위치(미국 애리조나주 투손)에서 더 높은 온도(55°C)에서 경화해야 했습니다. 이는 위치 간의 차이(예: 기후 또는 사용된 정확한 시약 및 장비)가 경화 온도 또는 건조 기술과 같은 프로토콜의 특정 단계에 영향을 미칠 수 있으며 각 사이트에서 최적화해야 할 수도 있음을 시사합니다. 예를 들어, 환경 습도는 얼룩 후 플레이트의 건조 시간을 결정하는 데 큰 역할을 하며, 이는 위치나 계절에 따라 크게 다를 수 있습니다.
원칙적으로, 이 멀티웰 장치 시스템은 페트리 플레이트의 표준 명시야 현미경으로 측정할 수 있는 모든 표현형(수명, 건강 기간, 자극되지 않은/자극되지 않은 움직임, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학)에 대한 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있으며, 시간 경과에 따른 개별 웜에 대한 메트릭을 추적하는 기능이 추가되었습니다. 서론에서 언급했듯이 개인의 전체 수명 데이터를 수집하는 다른 방법이 있습니다. 미세유체 장치(28) 또는 멀티웰 플레이트(29)는 개별 동물의 생활사를 추적할 수 있는 능력을 제공하지만, 액체 배지에서 벌레를 배양하는 것만으로도 가능하다. 액체 환경은 고체 매질에 비해 벌레의 전사체(transcriptome)10,11,30를 변화시킬 수 있으며, 일시적인 수영(episododic swiming)31, 에너지 소비 증가(increased energy expendence)10, 산화 스트레스 증가(higher oxipative stress)10 등 뚜렷한 생리적 및 행동적 변화를 유도할 수 있다. 건강한 노화와 관련된 수명 및 기타 지표를 액체와 고체 매체 간에 직접 비교할 수 있는 정도는 불분명합니다. 고체 배양 멀티웰 장치는 페트리 플레이트의 표준 그룹 배양과 유사한 환경에서 단일 웜 추적이 가능합니다. 장치 벽의 곡선 구조는 웰 내부의 어느 곳에서나 웜을 이미징할 수 있도록 하여 이러한 장치를 원칙적으로 Worm Tracker33과 같은 단일 웜 분석을 위한 보다 정교한 도구와 호환되도록 합니다.
멀티웰 장치에서 실험하는 동안 개별 동물을 모니터링하는 기능에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 최적화된 프로토콜을 사용하더라도 이러한 장치는 페트리 플레이트의 표준 배양보다 동물당 설정하는 데 더 많은 시간이 필요하므로 전체 샘플 크기를 희생시키면서 단일 동물 데이터를 제공합니다. 그러나 웜은 또한 개별화된 우물에 격리되어 서로 접촉하는 동안 움직이지 않는 개별 동물을 자동으로 감지하는 것과 같은 자동화된 수명 측정과 관련된 일부 합병증을 제거합니다. 자동화는 더 복잡한 설정으로 손실된 시간을 다시 포착하는 것 이상이며 더 높은 처리량의 스크리닝을 위한 기회를 제공합니다13,18. 둘째, 강한 스트레스 유발제(예: 파라콰트) 또는 식이 제한과 같이 벌레가 황산구리 해자보다 더 싫어하는 실험 조건은 벌레가 우물에서 해자로 도망가도록 유도합니다. 셋째, PDMS 장치는 명시야 및 암시야 현미경 검사를 허용하지만, PDMS 재료는 배경 형광이 높거나 고르지 않은 경향이 있으며, 후자는 성형 중에 먼지 또는 기타 미세 입자가 PDMS에 매립되어 형광 현미경에서의 적용을 제한하기 때문에 발생할 수 있습니다. 마지막으로, 여러 실험을 통해 재사용된 장치에 대해 PDMS에서 관찰된 변색과 이와 관련된 수명 감소 및 이탈 증가는 미디어 구성 요소 및 기타 추가된 화학 물질이 시간이 지남에 따라 PDMS에 거머리가 됨을 시사합니다. 이것이 노화 표현형이나 약물 치료에 영향을 미칠 수 있는 정도는 현재 연구 중입니다. 앞서 언급한 바와 같이, PDMS 멀티웰 장치와 유사하지만 대신 상업적으로 이용 가능한 마이크로트레이를 사용하여 격리된 동물(16)을 배양하는 단일 웜 배양을 위한 대체 방법이 있다. 이 마이크로트레이는 폴리스티렌으로 만들어져 배지 구성 요소를 거머리로 만드는 잠재적인 문제를 방지하고 일관된 형광 배경을 가지고 있어 플레이트에 직접 생체 내 형광 이미징이 가능합니다. 마이크로트레이 웰은 또한 여기에 설명된 프로토콜에 사용된 황산구리 대신 팔미트산으로 둘러싸여 있으며, 이는 스트레스 유발제 및 식이 제한의 경우에도 더 혐오스럽고 웰을 떠나는 벌레의 비율을 줄입니다. 이러한 이점은 PDMS 장치의 240개 웜 용량과 달리 마이크로트레이를 사용하면 단일 트레이에서 최대 96개의 웜을 배양할 수 있기 때문에 웰의 패킹 효율이 낮아지는 대가로 실현됩니다. 원하는 실험 결과의 세부 사항은 이러한 시스템 중 어떤 시스템을 활용해야 하는지에 영향을 미칩니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없다고 말합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH R35GM133588에서 GLS로, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금 및 Ellison Medical Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5 lb weight | CAP Barbell | RP-002.5 | |
| Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) | Falken Design | ACRYLIC-CL-3-8/1224 | Large sheet cut to smaller sizes |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Autoclavable squeeze bottle | Nalgene | 2405-0500 | |
| Bacto agar | BD Difco | 214030 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| Basin, 25 mL | VWR | 89094-664 | Disposable pipette basin |
| Cabinet style vacuum desiccator | SP Bel-Art | F42400-4001 | Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. |
| CaCl2 | Acros Organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | GoldBio | C-103-25 | |
| Centrifuge | Beckman | 360902 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Compressed oxygen tank | Airgas | UN1072 | |
| CuSO4 | Fisher Chemical | C493-500 | |
| Dry bead bath incubator | Fisher Scientific | 11-718-2 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Floxuridine | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hybridization oven | Techne | 731-0177 | Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice |
| Incubators | Shel Lab | 2020 | 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P286-1 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Low melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| Microwave | Sharp | R-530DK | |
| Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 | Rainin | 17013800 | The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided |
| NaCl | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray | Thermo Scientific | 264728 | Clear polystyrene trays |
| Parafilm M | Fisher Scientific | 13-374-10 | Double-wide (4 in) |
| Petri plate, 100 mM | VWR | 25384-342 | |
| Petri plate, 60 mM | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Plasma cleaner | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| PLATINUM vacuum pump | JB Industries | DV-142N | |
| PolyJet 3D printer | Stratasys | Objet500 Connex3 | PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi) |
| Shaking incubator | Lab-Line | 3526CC | |
| smartSpatula | LevGo, Inc. | 17211 | Disposable spatula |
| Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) | M2 Polymer Technologies | Type S | Referred to in main text as "water crystals" |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer base | The Dow Chemical Company | 2065622 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent | The Dow Chemical Company | 2085925 | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Nest Scientific USA Inc. | 380111 | |
| Syringe, 10 mL | Fisher Scientific | 14955453 | |
| TWEEN 20 | Thermo Scientific | J20605-AP | Detergent |
| Vacuum pump oil | VWR | 54996-082 | |
| VeroBlackPlus | Stratasys | RGD875 | Rigid 3D printing filament |
| Weigh boat | Thermo Scientific | WB30304 | Large enough for PDMS mixture volume |
References
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