Summary
Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.
Abstract
Osteoclasten (OC's) zijn botresorberende cellen die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van het skelet en de remodellering van volwassen botten. Verschillende botaandoeningen worden veroorzaakt door verhoogde differentiatie en activering van OC's, dus de remming van deze pathobiologie is een belangrijk therapeutisch principe. Twee belangrijke factoren stimuleren de differentiatie van OC's van myeloïde voorlopers: macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor kappa-B ligand (RANKL). Van menselijke circulerende CD14+ monocyten is al lang bekend dat ze in vitro differentiëren in OC's. De belichtingstijd en de concentratie van RANKL beïnvloeden echter de differentiatie-efficiëntie. Inderdaad, protocollen voor het genereren van menselijke OC's in vitro zijn beschreven, maar ze resulteren vaak in een slecht en langdurig differentiatieproces. Hierin wordt een robuust en gestandaardiseerd protocol gegeven voor het tijdig genereren van functioneel actieve volwassen menselijke OC's. CD14+ monocyten worden verrijkt uit menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) en geprimed met M-CSF om RANK te upreguleren. Daaropvolgende blootstelling aan RANKL genereert OC's op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. OC's worden geïdentificeerd en gekwantificeerd door kleuring met tartraatzuurresistente fosfatase (TRAP) en lichtmicroscopieanalyse. Immunofluorescentiekleuring van kernen en F-actine wordt gebruikt om functioneel actieve OC's te identificeren. Daarnaast worden OSCAR+CD14− volwassen OC's verder verrijkt via flowcytometriecelsortering en oc-functionaliteit gekwantificeerd door minerale (of dentine/bot) resorptietesten en actineringvorming. Ten slotte wordt een bekende OC-remmer, rotenon, gebruikt op volwassen OC's, wat aantoont dat de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) essentieel is voor de integriteit van actineringen en de OC-functie. Kortom, in dit werk wordt een robuuste test voor het differentiëren van hoge aantallen OC's vastgesteld, die in combinatie met actineringkleuring en een ATP-test een nuttig in vitro model biedt om de OC-functie te evalueren en te screenen op nieuwe therapeutische verbindingen die het differentiatieproces kunnen moduleren.
Introduction
Osteoclasten (OC's) zijn multinucleaire reuzencellen van hematopoietische afstamming met een uniek vermogen om bot te resorberen. Zij zijn verantwoordelijk voor de ontwikkeling en continue verbouwing van het skelet 1,2. In de skeletfasen van ontwikkeling worden OC's en weefselresidente macrofagen afgeleid van erytro-myeloïde voorlopers en koloniseren ze de botniche en orgaanweefsels. In fysiologische omstandigheden zijn erytro-myeloïde voorlopers nodig voor normale botontwikkeling en tanduitbarsting, terwijl de instroom van circulerende bloedmonocyten in de botniche zorgt voor postnataal onderhoud van de OC's, botmassa en beenmergholte3. Onder pathologische omstandigheden worden monocyten gerekruteerd op plaatsen van actieve ontsteking en kunnen ze bijdragen aan pathologische botvernietiging 4,5.
Patiënten met verschillende vormen van artritis ervaren gewrichtsontsteking, wat leidt tot progressieve gewrichtsvernietiging veroorzaakt door OC's6. Bij reumatoïde artritis (RA) zijn bijvoorbeeld overactieve OC's verantwoordelijk voor pathologische boterosie en gewrichtsvernietiging 7,8, en de huidige behandelingen verbeteren of stoppen de botschade vaak niet9,10,11. Veranderingen in circulerende monocyten, zowel in termen van populatieverdeling als transcriptomische en epigenetische handtekeningen, zijn gemeld bij RA-patiënten12,13,14. Bovendien is gemeld dat veranderde monocytenreacties op ontstekingsstimulatie de osteoclastogenese beïnvloeden bij RA-patiënten met actieve ziekte15,16,17.
De differentiatie van OC's is een complex meerstappenproces dat bestaat uit de inzet van myeloïde voorlopercellen om te differentieren in OC-voorlopers. Tijdens osteoclastogenese worden OC's gigantisch en meerkernig door celcelfusie, onvolledige cytokinese en een nucleair recyclingproces beschreven als splijting en fusie18,19,20. Het vermogen om OC's in vitro te onderscheiden heeft aanzienlijke vooruitgang mogelijk gemaakt in het begrip van botbiologie21. OC's onderscheiden zich van voorlopers bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor kappa-B-ligand (RANKL). Dit laatste is essentieel voor de normale ontwikkeling en functie van OC's in vitro en in vivo, zelfs onder inflammatoire omstandigheden 6,22,23. RANKL wordt gepresenteerd door osteoblasten en osteocyten, evenals door geactiveerde T-cellen en fibroblasten in het ontstoken RA-synovium 2,24,25. Tijdens het OC-differentiatieproces upreguleren monocyten blootgesteld aan M-CSF receptoractivator van nucleaire factor kappa-B (RANK) expressie op hun celmembraan en, onder daaropvolgende stimulatie met RANKL, differentiëren in tartraatresistente zure fosfatase (TRAP)-positieve mononucleaire pre-OC's en vervolgens in multinucleaire OC's15,26. OC's produceren verschillende enzymen, de belangrijkste daarvan is TRAP, dat de afbraak van fosfoproteïnen in bot27 mogelijk maakt. Een regulator en marker van OC-differentiatie is de OC-geassocieerde receptor (OSCAR). Het wordt vroeg geupreguleerd in voorlopercellen die zich committeren aan de OC-afstamming28. Volwassen gigantische multinucleaire OC's kunnen de skeletmatrix afbreken (resorberen) door een grote afdichtingszone te genereren, die is gemaakt van een actinering rond een gegolfde rand21,29,30. Het botresorptievermogen van OC's vereist cytoskeletreorganisatie en de daaruit voortvloeiende polarisatie en vorming van een ingewikkeld membraan, de zogenaamde gegolfde grens. De gegolfde rand is omgeven door een grote cirkelvormige band van een F-actinerijke structuur, die de actinering of afdichtingszone is. Actineringintegriteit is essentieel voor OC's om bot zowel in vitro als in vivo te resorberen, en defecte gegolfde grensvorming is geassocieerd met lagere vacuolaire adenosinetrifosfatase (V-ATPase) expressie31,32,33. Bovendien zijn OC's mitochondriënrijke cellen en adenosinetrifosfaat (ATP) associeert met mitochondriale structuren in OC's gelokaliseerd op de gegolfde grens31,32,33. Rotenon werkt als een sterke remmer van het mitochondriale complex I en beïnvloedt de ATP-productie. Van rotenon is ook aangetoond dat het oc-differentiatie en -functie remt34.
Dit protocol beschrijft een efficiënte en geoptimaliseerde methode van in vitro osteoclastogenese uit menselijke perifere bloedmonsters. In menselijk perifeer bloed zijn CD14+ monocyten de belangrijkste bron van OC's15,35,36. In dit protocol zijn de kinetiek van de blootstelling en de concentraties van M-CSF en RANKL aangepast voor een optimale osteoclastogenese. Mononucleaire cellen worden eerst gescheiden van de erytrocyten en granulocyten die aanwezig zijn in volbloed door dichtheidsgradiënt; ze worden vervolgens verrijkt voor CD14+ monocyten met behulp van positieve selectie door magnetische kralen. De geïsoleerde CD14+ monocyten worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met M-CSF. Dit priemt de monocyten om de expressie van RANK15,26 te upreguleren. De daaropvolgende toevoeging van RANKL induceert osteoclastogenese en multinucleatie op een tijdsafhankelijke manier. Actief-resorberende OC's tonen de karakteristieke verdeling van F-actineringen aan de rand van het celmembraan30,32 en kleuring voor TRAP. Volwassen OC's worden geanalyseerd door TRAP + meerkernige (meer dan drie kernen) cellen te kwantificeren. De functionele capaciteit van volwassen OC's kan worden beoordeeld aan de hand van hun resorptie, actineringintegriteit en ATP-productie. Bovendien kunnen gedifferentieerde CD14− OSCAR+ OC's worden verrijkt en gebruikt om de effecten van bepaalde verbindingen op oc-functionaliteit te beoordelen via minerale (of dentine) resorptie en F-actine-organisatie. Bovendien wordt in dit werk een bekende OC-remmer, rotenon, gebruikt als een voorbeeld van een verbinding die de functionaliteit van OC's beïnvloedt. Verminderde OC-resorptieactiviteit onder rotenon is geassocieerd met verminderde ATP-productie en actineringfragmentatie. Kortom, dit protocol stelt een robuuste test vast die kan worden gebruikt als referentiemethode om verschillende biologische aspecten van oc-differentiatie en -functie in vitro te bestuderen.
Deze methodologie kan worden gebruikt om (1) het potentieel van circulerende monocyten om te differentiëren in OC's in gezondheid en ziekten te beoordelen, evenals (2) de impact van therapeutische kandidaten op oc-differentiatie en -functie. Dit robuuste osteoclastogeneseprotocol maakt het mogelijk om de werkzaamheid en mechanismen van botgerichte therapieën te bepalen op zowel OC-differentiatie van voorlopercellen als de functie van volwassen OC's.
Protocol
Buffy-jassen verkregen van de Scottish National Blood Transfusion Service (Edinburgh) en leukocytenkegels verkregen van NHS Blood and Transplant (Newcastle) worden verstrekt aan onderzoekers van de Universiteit van Glasgow in een volledig geanonimiseerde (niet-identificeerbare) vorm van volledig instemmende NHS-bloeddonoren. De buffy coat en leukocyt kegel bloedcomponenten worden geproduceerd uit een NHS standaard bloeddonatie gegeven in een NHS bloeddonorcentrum in Schotland of Engeland. De bloeddonor geeft geïnformeerde toestemming op het moment van de bloeddonatie voor overtollig bloed dat niet wordt gebruikt in de standaard nhs-klinische praktijk om te worden gebruikt voor goedgekeurde medische onderzoeksstudies. De ethische goedkeuring van de NHS Research Ethics Committee en de ondertekende toestemmingsformulieren van de donor om deze bloeddonaties te gebruiken, worden bewaard door de NHS-bloeddonatiedienst. Goedkeuring voor toegang tot en gebruik van deze goedgekeurde bloeddonaties in goedgekeurde medische onderzoeksstudies werd gevraagd en verkregen met behulp van het standaard interne aanvraag- en beoordelingsproces van de National Blood Transfusion Service (Schotland) en NHS Blood and Transport (Engeland). Er was geen verdere NHS REC-goedkeuring of interne goedkeuring van de ethische commissie van de Universiteit van Glasgow vereist om de bloedbestanddelen te gebruiken voor de goedgekeurde medische onderzoeksstudies.
1. Algemene opmerkingen voor aanvang
- Ga voorzichtig te werk met al het bloed. Overweeg de potentiële gevaren van verschillende infectieuze agentia die in de monsters aanwezig kunnen zijn.
- Voer al het werk voorzichtig uit in het bioveiligheidslaboratorium onder steriele omstandigheden terwijl u handschoenen en laboratoriumjassen draagt.
- Voer bioveiligheidsverwijdering uit volgens de lokale richtlijnen.
- Verkrijg de juiste toestemming en ethische goedkeuringen voorafgaand aan het verzamelen van monsters volgens de voorschriften van de lokale autoriteiten.
- Over het algemeen levert 1 ml vers bloed 1 miljoen PBMC's op en CD14+ monocyten zijn goed voor ongeveer 10% -30% van de PBMC's. Ter vergelijking: 10 ml van een leukocytenkegel kan 5 x 10 8-15 x 108 PBMC's bevatten. Voor meer informatie over PBMC-isolatie raadpleegt u een eerder protocol37.
2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) uit volbloed
- Verzamel het vereiste volume vers bloed van gezonde donoren in lithium-heparine-verzamelbuizen.
OPMERKING: Andere opvangbuizen met geschikte anticoagulantia kunnen ook worden gebruikt (bijv. natriumheparinebuizen). Voor hogere celtellingen kunnen leukocytenkegels of buffy coats worden gebruikt. - Om de PBMC's te isoleren, brengt u het bloed over in een nieuwe buis van 50 ml en verdunt u het met steriele 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1: 1 of 1: 3 voor respectievelijk vers bloed of leukocytenkegels / buffy-jassen.
- Meng de cellen voorzichtig meerdere keren door inversie.
- Bereid buizen van 15 ml met 3 ml dichtheidsgradiëntmedium. Leg langzaam 8-10 ml verdund bloed op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium en centrifugeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 400 x g zonder rem.
OPMERKING: Breng het bloed voorzichtig aan op het dichtheidsgradiëntmedium om vermenging te voorkomen. Mengen kan leiden tot het verlies van PBMC's. - Gooi de bovenste laag (die het plasma bevat) voorzichtig weg met een Pasteur-pipet, verzamel de onderliggende interfaselaag met de PBMC's (witte, ringachtige structuur) en breng deze laag over in een nieuwe buis van 50 ml.
- Suspensie de cellen met steriele 1x PBS tot 50 ml en spoel het restdichtheidsgradiëntmedium af door gedurende 10 minuten bij RT met volle rem op 300 x g te centrifugeren.
- Om resterende bloedplaatjes te verwijderen, herhaalt u het proces met een extra langzamere spin bij 200 x g gedurende 10 minuten bij RT zonder rem.
- Optioneel: Om de overdracht van rode bloedcellen te verwijderen, verdunt u de rode bloedcellysisbuffer (10x, materiaaltabel) 1:10 in gedestilleerd water en brengt u 3 ml van de verdunde buffer aan op de pellet. Meng en incubeer gedurende 3 minuten. Was de pellet in maximaal 50 ml 1x PBS en centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij RT met volle rem.
- Resuspendeer de geïsoleerde en gezuiverde PBMC's in 20 ml 1x PBS en tel ze met behulp van een hemacytometer of volgens andere standaardmethoden.
OPMERKING: De methoden voor celverdunning en celtelling moeten dienovereenkomstig worden aangepast op basis van de gebruikte celdichtheid en telinrichting.
3. Verrijking van CD14+ monocyten uit PBMC's
- Isoleer CD14+ monocyten uit de PBMC's met een menselijke CD14+ selectiekit volgens het protocol van de fabrikant (Materiaaltabel).
OPMERKING: Klassieke CD14+CD16− monocyten zijn de belangrijkste bron van OC-voorlopers35; alternatieve zuiveringsmethoden kunnen worden overwogen. - Breng 1 x 107 PBMC's over in een geschikte polystyreen buis met ronde bodem (d.w.z. die past op de magneet van de selectiekit) en pellet de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g .
- Gooi het supernatant weg, resuspendien de celpellet in de celscheidingsbuffer (PBS, 2% foetaal runderserum [FBS], 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]) tot een eindconcentratie van 1 x 108 cellen/ml en incubeer gedurende 10 minuten met 10 μl antilichaamcocktail per 100 μl.
OPMERKING: De cellen worden geresuspendeerd bij 1 x 108 cellen / ml; Pas de volumes dienovereenkomstig aan. - Voeg na incubatie 10 μL van de magnetische nanodeeltjesparels per 100 μL toe en incubeer gedurende 3 minuten met het deksel erop.
OPMERKING: Pas de volumes van de antilichaamcocktail en magnetische kralen aan om een concentratie van 10 μL/ml te verkrijgen. - Vul het volume aan tot 2,5 ml met de celscheidingsbuffer, plaats de buis in een magneet (zonder deksel) en incubeer gedurende 3 minuten. Gooi de negatieve celpopulatie weg door één continue beweging door inversie terwijl de buis nog in de magneet zit.
OPMERKING: Als u >2 x 108 PBMC's en een grotere magneet gebruikt, vult u tot 5 ml of 10 ml met celscheidingsbuffer volgens de instructies van de fabrikant. - Verwijder de buis van de magneet en was de verrijkte CD14+ monocyten die aan de magnetische kralen zijn bevestigd door ze opnieuw te suspenderen in 2,5 ml van de celscheidingsbuffer. Incubeer gedurende 3 minuten in de magneet zoals voorheen, gooi de negatieve fractie weg en herhaal dit nog een keer.
- Centrifugeer alle verzamelde cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g , gooi het supernatant weg en resuspensie van de cellen in 5 ml minimaal essentieel alfamedium (α-MEM; Materiaalopgave) aangevuld met 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine (complete α-MEM) en 10% FBS.
OPMERKING: Een controle van de zuiverheid na verrijking via flowcytometrie wordt aanbevolen en er moet een zuiverheid van ≥96% worden verwacht. Extra wasstappen (stap 3.6) kunnen de zuiverheid verhogen.
4. Oc-differentiatie in vitro
- Tel de verrijkte CD14+ monocyten met behulp van een hemacytometer.
- Pellet de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en resuspensie bij 1 x 106 cellen/ml in volledige α-MEM aangevuld met 10% FBS.
- Om de OC's te differentiëren, voegt u M-CSF in een eindconcentratie van 25 ng / ml toe aan de celsuspensie.
OPMERKING: Voeg voor 1 ml celsuspensie 0,25 μL M-CSF toe uit een stamconcentratie van 100 μg/ml. - Meng door grondig te pipetteren om de celsuspensie en plaat 100 μL/put in een vlakke bodem 96-well plaat te homogeniseren tot een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 105 cellen/put.
- Voeg 200 μL/put steriel gedestilleerd water toe aan de putten rond de vergulde cellen om mediumverdamping en randeffecten in het kweeksysteem te voorkomen.
- Incubeer de cellen 's nachts, gedurende ongeveer 18-20 uur, bij 37 °C met 5% CO2.
- Verwijder na een nacht incubatie voorzichtig de helft van het medium (50 μL / put) door aspiratie met behulp van een P200-pipet, vermijd het aanraken van de bodem van de put en vervang door verse warme complete α-MEM met 10% FBS, 25 ng / mL M-CSF en 50 ng / ml RANKL voor een eindconcentratie van 25 ng / ml
OPMERKING: Voeg voor 1 ml medium 0,25 μl M-CSF en 0,5 μl RANKL toe vanaf een stamconcentratie van 100 μg/ml. - Verander de media om de 3 dagen en differentieer de cellen in OC's gedurende 7-14 dagen (figuur 1).
OPMERKING: Houd de M-CSF- en RANKL-concentraties consistent in de hele cultuur.
Figuur 1: OC-differentiatieworkflow. Schematisch overzicht van CD14+ monocytenisolatie van PBMC's en differentiatie in volwassen OC's in aanwezigheid van M-CSF en RANKL gedurende 7-14 dagen. RT = kamertemperatuur. Afbeelding gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. TRAP kleuring voor osteoclasten
- Verwijder voorzichtig het medium, fixeer de gedifferentieerde adherente OC's met 100 μL / put van de eerder bereide fixatieve oplossing en incubeer gedurende 1 min. Raak de bodem van de putjes niet aan om krassen op de aanhangende cellen te voorkomen.
OPMERKING: De fixatieve oplossing wordt als volgt bereid: 12,5 ml citraatoplossing (inbegrepen in de TRAP-kleuringskit), 32,5 ml aceton en 5 ml 37% formaldehyde. - Was de putjes drie keer met 300 μL steriel gedestilleerd water. Tik de borden droog na het wassen.
- Bereid een kleuringsoplossing volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel); voeg 5 μL Fast Garnet en 5 μL natriumnitriet toe om de Fast Garnet-oplossing te maken; meng door inversie en incubeer gedurende 3 minuten bij RT. Bereid 1 ml kleuringsoplossing door 900 μL steriel gedestilleerd water, 10 μL naftol, 40 μL acetaatoplossing, 50 μL tartraatoplossing en 10 μL Fast Garnet-oplossing te mengen.
- Voeg 100 μL/put vers bereide kleuringsoplossing toe en incubeer de plaat in het donker gedurende 20 minuten bij 37 °C.
- Verwijder na incubatie de kleuringsoplossing door inversie en was de plaat drie keer met 300 μL / put gedestilleerd water.
- Verwijder het overtollige water door op de borden op keukenpapier te tikken. Laat de platen open en beschermd tegen het licht om een nacht aan de lucht te drogen.
OPMERKING: Droge platen kunnen maximaal 6 maanden worden bewaard. Soms kunnen restbuffers de ontwikkeling van schimmel bevorderen, die zichtbaar is onder de microscoop; Dit kan op elk moment worden verwijderd door de aangetaste putten met gedestilleerd water te wassen en ze opnieuw aan de lucht te laten drogen. - Maak foto's met 10x of 20x met behulp van een brightfield-microscoop met een tegeloptie om het hele putoppervlak vast te leggen.
- Tel handmatig de OC's die zijn geïdentificeerd als TRAP + paars gekleurde cellen met meer dan drie kernen met behulp van een beeldanalysesoftware met een celtellerplug-in.
OPMERKING: Het aantal TRAP + OC's per put is donorafhankelijk en kan variëren van ~ 200-1.600 OC's / put, met een gemiddelde van ongeveer 1.000 OC's / put. Bovendien, om de gegevens te analyseren, moeten de OC-nummers worden bepaald in drie verschillende putten (technische replicaties) en moet het gemiddelde worden berekend voor elke aandoening en voor elke biologische replicatie.
6. Botresorptietest
- Plaats de vers verrijkte CD14+ monocyten op 96-well osteo-assay platen bedekt met calciumfosfaat op 1 x 105 cellen/put, en differentieer de OC's gedurende 7-14 dagen, zoals aangegeven in stap 4.1-4.8, en verander het medium om de 3 dagen.
OPMERKING: Dentine/ivoor of rundercorticale botplakken kunnen worden gebruikt in plaats van osteo-assayplaten. Als dat zo is, moet de totale tijd van de cultuur worden verlengd tot 14-21 dagen vanwege het complexere substraat dat moet worden geresorbeerd. - Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium, vermijd het aanraken van de bodem van de put en lyseer de cellen met 10% natriumhypochlorietoplossing. Was de putjes drie keer met gedestilleerd water.
- Scan de droge platen met een brightfieldmicroscoop en analyseer/kwantificeer de verkregen beelden van de resorptieputten met behulp van beeldanalysesoftware.
7. Actine ring fluorescerende kleuring
- Plaat 100 μL/put van de geïsoleerde CD14+ monocyten in een 18-well kamer schuif bij een celdichtheid van 1 x 105 cellen/put. Onderscheid de OC's in aanwezigheid van M-CSF en RANKL zoals eerder beschreven (stappen 4.1-4.8), inclusief het om de 3 dagen vervangen van het medium.
- Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium en was elke put twee keer met 200 μL / put voorverwarmde PBS, pH 7,4. Laat de putten niet drogen tussen een van de stappen.
- Bevestig het monster met 100 μL/put van 4% formaldehyde-oplossing in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden.
OPMERKING: Methanol kan actine verstoren tijdens het fixatieproces. Daarom is het het beste om methanolhoudende fixeermiddelen te vermijden. Het voorkeursfixatief is methanolvrij formaldehyde. De orbitale schudder die in deze stap van het protocol werd gebruikt, was ingesteld op een vermogensinstelling van 3 uit 10. - Was tweemaal met 200 μL/put PBS, permeabiliseer de cellen met 100 μL/well van 0,1% Triton X-100 oplossing verdund in PBS, en incubeer gedurende 10 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden.
- Was tweemaal met 200 μL/put PBS. Om niet-specifieke binding te blokkeren en het signaal te verhogen, voegt u 100 μL/put blokkeeroplossing gemaakt met 2% runderserumalbumine (BSA)/PBS-oplossing toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden.
- Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 100 μL/put fluorescerend geconjugeerde falloïdine-oplossing verdund in 2% BSA/PBS-oplossing toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT op een orbitale shaker met zacht schudden en beschermd tegen licht.
OPMERKING: Pas de concentratie van de falloïdinekleurstof aan volgens de aanbevelingen van de fabrikant. - Was tweemaal met 200 μL/put PBS, kleurt de kernen met 100 μL/put van een oplossing van PBS die 300 nM DAPI bevat en incubeer gedurende 10-15 minuten bij RT op een orbitale schudder met zacht schudden en beschermd tegen licht.
OPMERKING: DAPI wordt verdund in gedestilleerd water om een DAPI-stamoplossing van 14,3 mM (5 mg/ml) te maken. De stamoplossing wordt verder verdund tot de uiteindelijke concentratie van 300 μM. Ten slotte wordt de DAPI-oplossing van 300 μM nog een keer verdund in PBS tot een eindconcentratie van 300 nM. - Verwijder na 10-15 minuten de DAPI-oplossing en vervang deze door 100 μL/well PBS.
OPMERKING: Afhankelijk van de gekozen kamerdia's, kunt u deze opslaan met een geschikt volume PBS (100 μL/put voor 18-puts kamerdia's), of de dia monteren met afdekplaten en een geschikt montagemedium. De kamerglaasjes kunnen tot 1 week in de koelkast bewaard worden. Gebruik voor kamerglaasjes met 18 putten een kleuringsvolume van 50-100 μL en 200-300 μL voor het wassen. Schaal dienovereenkomstig op voor de andere schuifformaten van de kamer. Om verdamping te voorkomen, bewaart u de afdekstroken in een afgedekte container tijdens de incubatietijden. Het gebruik van een orbitale shaker wordt aanbevolen, maar is niet essentieel. - Visualiseer de kleuring met behulp van geschikte immunofluorescentie of confocale microscopen en vergrotingen tussen 4x en 40x.
8. Verrijking van volwassen OC's en OC-precursoren via flowcytometriesortering
- Resuspendeer de vers verrijkte CD14+ monocyten bij 1 x 106 cellen/ml en differentieer ze in volwassen OC's in aanwezigheid van M-CSF en RANKL op dezelfde manier als hierboven beschreven (stappen 4.1-4.8).
OPMERKING: Bij het opschalen van een plaat met 96 putten naar een grotere plaatgrootte, volgt u tabel 1; deze volumes worden berekend uitgaande van een 1 x 106 cellen/ml oplossing en bieden een optimale dichtheid voor cel-celfusie. - Was op dag 7 de putjes eenmaal met warme PBS en voeg 50 μL toe aan 1 ml (volume bepaald door de gebruikte plaatgrootte) accutase. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 20 min.
- Controleer na de incubatie de platen onder een lichtmicroscoop om te zien of de cellen zijn losgekomen. Maak verder de cellen los door de platen aan alle kanten aan te tikken en ze op en neer te pipetteren.
- Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 ml. Was de putjes met warme PBS (geen Ca 2+, geen Mg2+) en combineer ze met de celsuspensie. Herhaal stap 8.2-8.3 een of twee keer totdat de meeste cellen zijn losgemaakt.
OPMERKING: Accutase, de aanbevolen methode voorafgaand aan oppervlaktekleuring voor flowcytometrische analyse, maakt geen zeer grote OC's los. Het herstelpercentage is ~50%-70%. - Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten, resuspensie van de celpellet in 1 ml PBS en tel de cellen met trypanblauwe uitsluiting.
- Resuspendeer de cellen bij 1 x 106 cellen/ml, verwijder 100 μL overeenkomend met 1 x 105 cellen en breng die cellen over in een nieuwe polypropyleen reageerbuis. Voeg 200 μL van de celsorteerbuffer toe en zet dit opzij op ijs als de ongekleurde controle.
- Kleuring de rest van de cellen met levende/dode kleurstof verdund op 1:750 gedurende 10 minuten bij RT en beschermd tegen licht.
OPMERKING: Live/dead kleuring moet worden uitgevoerd in afwezigheid van FBS om hoge achtergrondkleuring te voorkomen. - Vul de opvangbuis van 15 ml met de levende/dode gekleurde celsuspensie aan met warme celsorteerbuffer (1x PBS, geen Ca 2+, geen Mg2+, 1% FBS en 5 mM EDTA) en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen te pelleteren.
OPMERKING: Een hoge concentratie EDTA en een lage concentratie FBS worden aanbevolen in de sorteerbuffer om celklonten te voorkomen. - Verwijder een volume dat overeenkomt met 1 x 105 cellen en breng ze over in een nieuwe polypropyleen reageerbuis voor de OSCAR-isotyperegeling. Breng alle resterende cellen over in een andere polypropyleen reageerbuis voor kleuring en celsortering.
OPMERKING: Polypropyleen reageerbuizen worden gebruikt voor het sorteren omdat de cellen minder snel aan deze buizen hechten dan aan polystyreenbuizen. - Draai de buizen op 400 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren en gooi het overtollige supernatant weg door inversie.
- Resuspendie van de celkorrel in een antilichaammastermixoplossing bereid volgens tabel 2. Bevlek de OSCAR-isotypecontrolebuis met CD14-antilichaam en OSCAR-isotypecontrole in plaats van het OSCAR-antilichaam.
- Incubeer de cellen bij 4 °C beschermd tegen het licht gedurende 30 minuten.
- Was de cellen na 30 minuten door vijf volumes van de celsorteerbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 400 x g bij 4 °C.
- Resuspendeer de cellen in 300-1.000 μL koude celsorteerbuffer en verkrijg de cellen met behulp van een flowcytometriesorteermachine uitgerust met een 100μM mondstuk.
OPMERKING: OC's zijn zeer kleverige cellen, dus het is belangrijk om ze door een steriel membraan van 70 μm te filteren voordat ze worden gesorteerd. - Gate de OC's en pre-OC's als CD14−OSCAR+. Stel de OSCAR+ poort in op basis van de OSCAR isotype besturingsbuis.
- Verzamel de gesorteerde cellen in polypropyleen reageerbuizen met volledige α-MEM aangevuld met 20% FBS bij 8 °C.
- Na het sorteren, pellet de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij RT, tel de cellen en resuspensie voor downstream-toepassingen.
OPMERKING: Meestal, om ~ 1 x 105 gesorteerde pre-OC's / OC's te krijgen, begint u met ~ 10 x 106 cellen verguld op dag 0. De lage herstelsnelheid wordt beïnvloed door celverlies tijdens het losmaken met accutase en door de verwerking voor kleuring en sortering. Het wordt aanbevolen om de hele procedure uit te voeren met steriele buffers en reagentia en onder steriele omstandigheden te werken.
9. ATP-test voor mitochondriale activiteit
- Incubeer de verrijkte CD14+ monocyten in aanwezigheid van M-CSF en RANKL in een 96-well plaat op dezelfde manier als eerder beschreven (stappen 4.1-4.8). Plaat vier extra voorwaarden in drievoud te gebruiken als controles.
- Voer de ATP-test uit met de luminescentie ATP-detectietestkit volgens de handleiding van de fabrikant. Kortom, om de ATP-oplossing te bereiden, voegt u 10 ml van de substraatbufferoplossing toe aan het gelyofiliseerde substraat en laat u het gedurende 30 minuten bij RT incuberen.
OPMERKING: Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om de intracellulaire ATP-productie te meten. Hierin hebben we de detectie van ATP-productie door luminescentie gebruikt. - Bereid tijdens de incubatie de controles als volgt voor en voeg deze rechtstreeks toe aan de controleputten: 2-Deoxy-D-glucose (2DG) bij 10 mM en 100 mM, oligomycine bij 1 μM en 100 mM 2DG in combinatie met 1 μM oligomycine. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: De 2DG blokkeert glycolyse, terwijl oligomycine een remmer is van oxidatieve fosforylering. Het combineren van deze twee remmers resulteert in het volledige verlies van ATP-productie via glycolyse en oxidatieve fosforylering, wat betekent dat ze dienen als een interne controle voor de ATP-test. Voeg voor 10 mM en 100 mM 2DG-regelaars respectievelijk 0,5 μL en 5 μL 2M 2DG-stamoplossing per 100 μL-cultuurput toe. Verdun voor 1 μM oligomycine de 5 mM stamoplossing 1:100 in medium en voeg 2 μL/put toe aan de speciale controleputten. Voeg voor de laatste controle 5 μL 2DG en 2 μL verdunde oligomycine-oplossing per put toe. - Voeg 50 μL van de ATP-oplossing toe aan elke put om de reactie te stoppen en incubeer bij RT op een shaker bij 700 tpm gedurende 5-10 minuten beschermd tegen licht.
- Breng 100 μL van het supernatant over op een 96-well white-bottom plaat specifiek voor de ATP-test en lees de plaat af met behulp van een luminescentielezer.
Representative Results
OC-generatie uit CD14+ monocyten
Deze methode was gericht op het gemakkelijk onderscheiden van een groot aantal OC's van humaan perifeer bloed CD14 + monocyten in vitro, meestal in 1 week. Ten eerste werden CD14+ monocyten verrijkt met PBMC's en 's nachts geprimed met M-CSF om RANK te upreguleren, zoals eerder gemeld15. Na monocytenpriming, om de optimale concentratie van RANKL voor OC-differentiatie en rijping te bepalen, werden RANKL-concentraties van 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml, samen met 25ng / mL M-CSF, gebruikt. De toevoeging van RANKL produceerde steeds meer grote TRAP-positieve multinucleaire OC's op een dosisafhankelijke manier, en dit werd beoordeeld met behulp van TRAP-kleuring. Volwassen OC's worden gedefinieerd als TRAP-positieve cellen met meerdere kernen (meestal meer dan drie; Figuur 2A,B en aanvullende figuur 1). Bovendien werd de kinetiek van OC-differentiatie van monocyten onderzocht met behulp van TRAP-kleuring en lichtmicroscopie gedurende een kweekperiode van 2-14 dagen. In dit geval werd oc-differentiatie met behulp van een tussenliggende concentratie van 50 ng / ml RANKL gekozen om te beoordelen hoe snel OC's differentieerden in cultuur. In deze kweekomstandigheden waren meerkernige OC's zichtbaar vanaf dag 5 en werd optimale differentiatie bereikt op dag 7 (figuur 2C). De langdurige incubatie van culturen langer dan 10 dagen op kunststoffen resulteerde in abnormaal gigantische gesmolten cellen. In dit protocol worden dagen 6-8 meestal gebruikt als het optimale eindpunt van OC-generatie. De OC's kunnen worden gekwantificeerd of gebruikt voor downstream-assays.
Functionele beoordeling van gedifferentieerde OC's
Om de functionele activiteit van de gegenereerde OC's te bepalen, onderzochten we hun resorptieve activiteit door de OC's op een gemineraliseerd oppervlak te differentiëren. Omdat grote OC's pas na een kweekperiode van 7 dagen worden gegenereerd en om voldoende tijd te hebben om het minerale substraat te resorberen, werden de culturen tot dag 10 gehandhaafd. De vorming van ronde gaten, of resorptieputten, werd alleen waargenomen op de gemineraliseerde oppervlakken van putten met cellen die waren behandeld met zowel M-CSF als RANKL (figuur 3). Het percentage opgelost gemineraliseerd oppervlak (resorptieputten) maakt het dus mogelijk om de OC-resorptieve capaciteit te bepalen. Bovendien vertoonden de OC's die tot dag 7 volgens dit protocol werden gedifferentieerd, zowel op plastic als op glazen kamerglaasjes, een goed georganiseerde actineringstructuur die kon worden gevisualiseerd door immunofluorescente kleuring (aanvullende figuur 2).
Effect van een remmer op volwassen OC-functie
De bovengenoemde kweekomstandigheden werden gebruikt om het functionele vermogen van de in vitro gegenereerde OC's te bepalen in aanwezigheid van de bekende OC-remmer, rotenon34. De OC's werden gedurende 6-8 dagen gedifferentieerd en CD14−OSCAR+ OC's en OC-precursoren werden verrijkt via flowcytometrie (figuur 4). De verrijkte cellen werden vervolgens geplateerd op 50.000 cellen / per put op een mineraalgecoate 96-well plaat in pro-osteoclastogeen medium (25 ng / mL M-CSF en RANKL) gedurende 3 dagen. Behandeling met rotenon (figuur 5A,B) dosisafhankelijk remde de resorptie van het gemineraliseerde oppervlak in vergelijking met de onbehandelde controleput, in overeenstemming met eerdere studies34. Daarnaast werd de OC-functionaliteit beoordeeld via ATP-productie en actineringvorming. De rotenonafhankelijke remming van OC-resorptie was geassocieerd met de remming van ATP-productie (figuur 5C). Resorberende OC's zijn sterk gepolariseerde cellen die hun resorptieve capaciteit reguleren door cytoskeletale organisatie te bevorderen. Alexa fluor 647 geconjugeerd falloidine werd gebruikt om het F-actine cytoskelet van de volwassen OC's gekweekt in de aan- of afwezigheid van rotenon te labelen. Rotenon veroorzaakte de fragmentatie van de RANKL-afgeleide actinering van de volwassen OC's (figuur 5D).
Figuur 2: OC's die efficiënt onderscheid maken van CD14+ monocytenprecursoren. CD14+ monocyten werden magnetisch verrijkt, geplateerd op 1 x 105 cellen/put in 96-well platen, en 's nachts geïncubeerd met 25 ng/mL M-CSF. (A) M-CSF-geprimeerde monocyten werden gestimuleerd met toenemende concentraties RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml), gefixeerd en gekleurd voor TRAP op dag 7. Beelden werden verkregen en de TRAP + multinucleated cellen (MNC's) werden geteld. Representatieve beelden van TRAP-kleuring zijn weergegeven in aanvullende figuur 1. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 3). De gegevens werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA en Holm-Sidak's meervoudige vergelijkingstest voor gepaarde gegevens; * P ≤ 0,05 en ** P ≤ 0,005. (B) Representatieve afbeelding van een met TRAP bevlekte put van een plaat met 96 putten die de typische hoeveelheid verwachte OC's/put en hun morfologie onder 25 ng/ml RANK-L toont in vergelijking met van M-CSF afgeleide macrofagen op dag 7. Schaalstaven: 1000 μm. (C) Representatieve beelden van OC-formatie onder 50 ng / ml RANKL beoordeeld via TRAP-kleuring van dag 2 tot dag 14. OC's zijn zichtbaar vanaf dag 5. Gigantische abnormaal gesmolten OC's zijn na 10 dagen aanwezig. Schaalstaven: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Resorptieve OC's onderscheiden van CD14+ monocyten. CD14+ cellen geïsoleerd uit PBMC's werden gedurende 10 dagen gedifferentieerd in OC's in aanwezigheid van 25 ng/mL M-CSF (M) en RANKL (R) op minerale assay oppervlak (osteo-assay) platen. (A) Beelden van representatieve gereconstrueerde putten genomen met 10x vergroting om de resorptie op dag 10 te analyseren (mineraal substraat in grijs; resorptieputten in wit). Schaalstaven: 1000 μm. (B) Kwantificering van het percentage geresorbeerd oppervlak. De resorptiegegevens werden geanalyseerd met een Wilcoxon gepaarde analyse. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Flowcytometrieverrijking van CD14−OSCAR+ OC's. CD14+ monocyten werden verrijkt met PBMC's en de OC's werden gedifferentieerd zoals eerder beschreven. Aanhangende OC-culturen werden losgemaakt met accutase en gekleurd voor flowcytometrie. (A-C) OC's op dag 8 werden gesorteerd op basis van CD14 en OSCAR-expressie. (A) Representatieve sorteerstrategie. De cellen werden afgesloten als singlets, negatief voor dode kleuring, en de CD14+ OSCAR+ (rood) en CD14− OSCAR+ (blauw) subsets werden gesorteerd. (B) Representatieve plots met de overlappende OSCAR-kleuring van van RANKL afgeleide OC's (cyaan) en van controle M-CSF afgeleide macrofagen (oranje). In rood staat de OSCAR isotype-gekleurde controle van RANKL-afgeleide OC's. (C) De gesorteerde populaties werden op plastic geplateerd en gedurende 2 uur in pro-OC-medium (25 ng / mL M-CSF en 50 ng / ml RANKL) geplakt, gevolgd door TRAP-kleuring en visualisatie. De representatieve afbeeldingen tonen een gebrek aan TRAP+ cellen in de CD14+ subset (rood) en mono- en multinucleated TRAP+ pre-OC's en OC's in de CD14− subset (blauw). Schaalstaven: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Assays om de functie van volwassen OC's te beoordelen. Om de functie van volwassen OC's te evalueren, werden CD14+ cellen geïsoleerd uit PBMC's gekweekt met M-CSF (M) alleen of gecombineerd met RANKL (R) gedurende 7 dagen, de OC's werden verrijkt via flowcytometrie en de OC's werden vervolgens behandeld met de remmer rotenon gedurende 24 uur. (A) Volwassen OC's werden gesorteerd via flowcytometrie (CD14−OSCAR+) en werden gekweekt op een mineraal testoppervlak in de aan- of afwezigheid van rotenon gedurende 3 dagen, waarna de cellen werden gebleekt en 10x in beeld werden gebracht om het geresorbeerde gebied te onthullen (resorptieputten in wit). (A) Representatieve gereconstrueerde beelden van putten. Schaalstaven: 1000 μm. (B) De kwantificering van het percentage geresorbeerd oppervlak. De gegevens in (B) werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA met Dunn's meervoudige vergelijkingstest (n = 7); * P ≤ 0,05 en** P ≤ 0,01. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD. (C) Totaal intracellulair ATP-gehalte van ongedifferentieerde en dag 7 gedifferentieerde volwassen OC's gedifferentieerd met RANKL en behandeld met vehikel of rotenon (10 nM en 30 nM). Hier werden 2DG en oligomycine gebruikt als positieve controles voor de test en werden 30 minuten voorafgaand aan cellyse en ATP-kwantificering toegevoegd. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 4). De gegevens werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA en dunnett's meervoudige vergelijkingstest voor gepaarde gegevens. ** P ≤ 0,01. (D) Een representatief 20x beeld van volwassen OC's gekleurd voor actineringvorming (rood) en kernen (blauw), met het verlies van de actineringing met de remmer. Schaalstaven: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Plaatformaat | 96 putplaat | 48 putplaat | 24 putplaat | 12 putplaat | 6 put-plaat |
| volume | 100 μL | 225–250 μL | 450–500 μL | 0,8-1 ml | 1,8-2 ml |
Tabel 1: Volume van de celsuspensie voor verschillende plaatformaten. De volumes worden berekend op basis van een oplossing van 1 x 106 cellen /ml en bieden een optimale dichtheid voor cel-celfusie.
| Fluorofoor, kloon | Volume (μL) per 106 cellen | |
| CD14 | PE/Cyaan7, HCD14 | 5 μL |
| OSCAR | FITC, REA494 | 10 μL |
| Celsorteerbuffer | 80 μL |
Tabel 2 : Antilichaam master mix oplossing.
Aanvullende figuur 1: TRAP-kleuring van de RANKL-dosisrespons. CD14+ monocyten werden magnetisch verrijkt, geplateerd op 1 x 105 cellen/put in 96-well platen, en 's nachts geïncubeerd met 25 ng/mL M-CSF, zoals in figuur 2. Representatieve afbeeldingen van TRAP-kleuring tonen MCSF-geprimeerde monocyten gestimuleerd met toenemende concentraties RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml), gefixeerd en gekleurd voor TRAP op dag 7. Schaalstaven: 400 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Werkende ringkleuring in volledig gedifferentieerde OC's. (A) Een 10x vergroting van OC's gedifferentieerd op TC plastic en gekleurd met AF647 falloidine (in rood). Schaalbalk: 400 μm. (B) Een 40x vergroting van OC's gedifferentieerd op glazen kamerglaasjes en gekleurd met AF488 falloidine (in geel). Schaalbalk: 100 μm.De kernen zijn gekleurd met DAPI, weergegeven in blauw in (A) en in cyaan in (B). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Effect van verschillende FBS-batches op oc-differentiatie-efficiëntie. OC's werden onderscheiden van CD14+ monocyten in aanwezigheid van 25 ng/mL M-CSF en 50 ng/mL RANKL (MR) gedurende 7 dagen. De controleputten hadden alleen M-CSF (M). (A) Representatieve 10x vergrotingen (schaalbalken: 400 μm) en (B) kwantificering van TRAP-gekleurde OC's gedifferentieerd van één donor in twee verschillende batches FBS. De foutbalken tonen de gemiddelde ± SD van drie technische replicaties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De eenvoudige kweek en isolatie van grote aantallen functionele OC's in vitro zijn belangrijk voor het bevorderen van het begrip van botbiologie en OC-gemedieerde ziekten. Klassiek werden OC's gegenereerd in co-culturen met osteoblasten of stromale cellen en hematopoëtische cellen uit de milt of het beenmerg38,39. Een belangrijke doorbraak in het begrip van osteoclastogenese was de identificatie van RANKL als de belangrijkste regulator van OC-vorming, differentiatie en overleving40. Vroege protocollen van RANKL-afhankelijke cultuursystemen gebruikten PBMC's voor OC-generatie21,41,42. Deze gemengde culturen zijn echter langdurig en vertonen veel verstorende factoren die het vermogen beperken om de directe effecten op oc-differentiatie en -functie te testen. Dit protocol beschrijft een efficiënt en betrouwbaar in vitro model van osteoclastogenese uit humane perifere CD14+ monocyten waarbij binnen 7 dagen optimale osteoclastogenese kan worden verkregen (figuur 1 en figuur 2), wat aanzienlijk sneller is in vergelijking met sommige andere protocollen43,44,45,46. De belangrijkste onderscheidende kenmerken van dit protocol zijn (1) het gebruik van gezuiverde CD14+ monocyten, (2) het primen van de monocyten met M-CSF voorafgaand aan blootstelling aan RANKL, (3) de lengte van de cultuur (<7 dagen), en (4) de betrouwbare detectie van de remming van OC-vorming (TRAP-kleuring) en functie (resorptie, ATP-productie, actineringreorganisatie) met remmers.
Tijdens de optimalisatie van de methodologie werden verschillende kritische punten geïdentificeerd. Er is waargenomen dat de in vitro differentiatie van OC's grotendeels afhankelijk is van de zaaidichtheid van de CD14+ monocyten. In dit protocol worden de cellen dus gezaaid met een hoge dichtheid (1 x 105 cellen / put van een 96-well-plaat, in 100 μL medium), omdat het essentieel is voor de cellen om met elkaar te kunnen interageren en in de buurt te zijn om te fuseren en volwassen OC's te worden. Evenzo beperkt het zaaien van cellen met een te hoge dichtheid hun differentiatie en groei als gevolg van gemiddelde beperkingen en een gebrek aan de vereiste ruimte. Om maximaal succes te behalen met dit protocol, is het bovendien belangrijk om de dichtheidsgradiëntscheiding zorgvuldig uit te voeren en ervoor te zorgen dat de verrijkte populatie van CD14+ cellen zo zuiver mogelijk is. Ontoereikende wasstappen resulteren bijvoorbeeld in een gebrek aan verwijdering van bloedplaatjes, wat bijgevolg OC-differentiatie remt47,48. Evenzo kan de aanwezigheid van kleine T-celbesmetting in geïsoleerde CD14+ preparaten gestimuleerd met alleen M-CSF resulteren in OC-differentiatie, mogelijk via RANKL-secretie door T-cellen49. Daarom is het belangrijk om voor elk experiment een M-CSF-controle op te nemen. Een routinematige zuiverheidscontrole, vooral bij gebruik van een nieuwe isolatiekit, wordt ook aanbevolen om de zuiverheid van het monster te garanderen.
Optimale OC-getallen (bereik: ~200-1.600 OC's/put) worden bereikt met behulp van α-MEM-medium verrijkt met nucleosiden en L-glutamine. Andere conventionele cultuurmedia, waaronder Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, beïnvloeden de OC-opbrengst. De bron van FBS kan ook de osteoclastogenese beïnvloeden. Verschillende batches FBS kunnen leiden tot verminderde RANK-L-afgeleide osteoclastogenese, evenals het verschijnen van lage aantallen TRAP + multinucleaire cellen in de M-CSF-controles (aanvullende figuur 3). Om consistente resultaten te bereiken, wordt daarom geadviseerd om nieuwe FBS-batches voor gebruik te testen en door te gaan met dezelfde batch gedurende de experimenten om variaties in het differentiatieproces te minimaliseren. Bovendien vormt de variabiliteit van donor tot donor, in termen van het totale aantal gedifferentieerde OC's verkregen op het eindtijdpunt, een beperking bij het gebruik van dit protocol om bijvoorbeeld gezonde donoren met patiënten te vergelijken. In deze gevallen is het noodzakelijk om precies dezelfde omstandigheden en dezelfde partij medium, FBS en andere reagentia te gebruiken.
Een andere noodzakelijke stap voor optimale OC-differentiatie en rijping is het primen van de monocyten met M-CSF vóór de RANKL-toevoeging. De blootstelling van de cellen aan M-CSF 18-24 h voorafgaand aan RANKL primeert de monocyten om RANK-expressie15,26 te upreguleren. De toevoeging van RANKL op dit tijdstip zorgt voor een optimale OC-differentiatie op een dosisafhankelijke manier. De mate van OC-differentiatie varieert van donor tot donor; 25 ng/ml RANKL is echter meestal voldoende om een hoog aantal OC's bij de meeste donoren te onderscheiden. Bovendien kan 25 ng / ml RANKL worden gebruikt in testen voor de eerste screening van verbindingen, omdat het de evaluatie van zowel de versterkende als remmende effecten van de testverbindingen vergemakkelijkt. Andere kweeksystemen hebben langere M-CSF pre-incubatietijden gebruikt voorafgaand aan RANKL-toevoeging, maar dit resulteert in een langere kweektijd voor osteoclastogenese50. Door de geprimeerde monocyten 's nachts te laten incuberen, kunnen ze zich bovendien aan de plaat hechten, zij het niet in een volledig hechtende toestand. Daarom, wanneer RANKL voor de eerste keer wordt geïntroduceerd, moet het medium zeer zorgvuldig half worden veranderd in plaats van volledig te worden veranderd om het loslaten en verliezen van de geprimeerde monocyten te voorkomen. Het medium moet ook om de 3-4 dagen worden ververst om gemiddelde uitputting te voorkomen en celdood te voorkomen. Bovendien is het, vanwege het lage volume dat in deze test wordt gebruikt (100 μL / put in een plaat met 96 putten), van het grootste belang om een frame van lege putten te hebben die zijn gevuld met een waterige oplossing (d.w.z. steriel gedestilleerd H2O of PBS) rond de testputten. Dit voorkomt medium verdamping en randeffecten.
Ten slotte is het voor metabole assays (bijv. ATP-assays) noodzakelijk dat de cellen levensvatbaar zijn om enorme standaarddeviatie tussen replicaten te voorkomen (figuur 5). Een hoge levensvatbaarheid van de cellen is ook belangrijk voor het sorteren van de cellen en voor het verder kweken van de gesorteerde OC's (figuur 4). Deze methode heeft echter verschillende beperkingen. Volledig volwassen OC's zijn zeer hechtend en moeilijk los te maken van de platen. De grotere OC's zijn vaak niet los te maken, wat kan leiden tot een lagere celopbrengst. Daarom moeten de cellen worden geteld na het sorteren en voorafgaand aan het plateren in de vereiste concentratie. Bovendien wordt in dit protocol een niet-enzymatische methode (accutase) gebruikt om de OC's los te koppelen om membraanveranderingen in downstream oppervlaktekleuring voor flowcytometrie te voorkomen. Het gebruik van celschrapers (zowel met zachte als harde uiteinden) werd ook getest en leidde tot hoge celdood. Enzymatische loslating met behulp van 0,05% trypsine/EDTA-oplossingen kan worden gebruikt voor een hogere opbrengst van losgemaakte OC's wanneer membraanintegriteit niet vereist is voor downstream-toepassingen. Bovendien, om te voorkomen dat de OC's samenklonteren, wordt het gebruik van een hoge concentratie EDTA in alle buffers na celloslating, evenals de juiste filtering voorafgaand aan de acquisitie van flowcytometrie, ten zeerste aanbevolen. Het is belangrijk op te merken dat OC-culturen een heterogene populatie van cellen zijn die bestaat uit volwassen OC's, OC-voorlopers en macrofagen. Macrofagen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van OC's, hoewel zowel mononucleaire pre-OC's als multinucleaire OC's OSCAR uitdrukken en niet kunnen worden onderscheiden met de huidige methode (figuur 4). Dit laatste punt vormt inderdaad de belangrijkste beperking van deze methode. Bovendien is een lage expressie van OSCAR ook aanwezig in M-CSF-culturen (figuur 4B) en kan dit wijzen op macrofagen die zijn voorbereid op OC-afstammingsverbintenis. Het is belangrijk om de poort voor OSCAR+ cellen in te stellen op basis van het FMO-kleuringssignaal, zoals weergegeven in figuur 4B.
Samenvattend beschrijft dit protocol een geoptimaliseerde en robuuste methode voor de efficiënte productie van actieve en functioneel volwassen OC's uit circulerende primaire menselijke monocyten. De kracht van dit protocol is het vermogen om OC's in een korte tijdsduur te genereren en hoge aantallen gedifferentieerde OC's op te leveren. Deze methode opent de weg voor het onderzoeken van de basismechanismen die ten grondslag liggen aan oc-differentiatie en -functie.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar de Flow Core Facility en de Glasgow Imaging Facility (GIF) binnen de School of Infection and Immunity voor hun steun en hulp bij dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
| 8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
| 96-well TC plate | Corning | 3596 | |
| 96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
| Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Acetone | VWR | 20066.330 | |
| Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher - Invitrogen | A12379 | AF488 |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher - Invitrogen | A22287 | AF647 |
| Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
| Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
| ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
| BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
| Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
| Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
| DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
| EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
| EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
| eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher - Invitrogen | 65-0865-14 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
| EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
| Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
| Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
| Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
| Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
| Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
| ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
| L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
| Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
| Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
| Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
| Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
| OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
| PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
| Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
| PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
| Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
| REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
| Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |
References
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
- Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
- Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
- Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
- Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
- Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
- Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
- Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
- Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
- Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
- Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
- Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
- McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237 (2021).
- Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
- Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
- Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282 (2020).
- Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
- Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V.
- McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
- Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
- Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
- Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
- Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
- Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780 (2021).
- Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
- Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
- Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
- Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
- Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
- Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
- Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
- Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221 (2020).
- Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776 (2021).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
- Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
- Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
- Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632 (2018).
- Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152 (2006).
- Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780 (2018).
- Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
- Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
- D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82 (2012).
- Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).
