مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان
Summary
تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.
Abstract
تنتمي فوسفاتاز الجلوكان إلى عائلة أكبر من الفوسفاتاز ثنائية الخصوصية (DSP) التي تزيل الفسفور ركائز الجلوكان ، مثل الجليكوجين في الحيوانات والنشا في النباتات. تكشف الهياكل البلورية لفوسفاتيز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية عن واجهات ربط جلوكان مميزة مصنوعة من DSP ومجالات ربط الكربوهيدرات. ومع ذلك ، فإن القياسات الكمية لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان – الجلوكان مع الركائز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أساسية للفهم البيولوجي لعائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان وتنظيم استقلاب الطاقة. تشير هذه المخطوطة إلى اختبار ترسيب في المختبر قائم على Concanavalin A (ConA) مصمم للكشف عن تقارب ربط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان ضد ركائز الجلوكان المختلفة. كدليل على المفهوم ، تم تحديد ثابت التفكك (KD) لفوسفاتيز الجلوكان أرابيدوبسيس ثاليانا النشا الزائد 4 (SEX4) والأميلوبكتين. يوضح توصيف طفرات SEX4 والأعضاء الآخرين في عائلة إنزيمات الفوسفاتيز الجلوكان فائدة هذا الفحص لتقييم الارتباط التفاضلي للتفاعلات بين البروتين والكربوهيدرات. توضح هذه البيانات مدى ملاءمة هذا الفحص لتوصيف مجموعة واسعة من البروتينات المتفاعلة مع النشا والجليكوجين.
Introduction
فوسفاتاز الجلوكان هي أعضاء في فصيلة فرعية متنوعة وظيفيا من الفوسفاتاز ثنائي الخصوصية (DSPs) داخل عائلة بروتين التيروزين الفوسفاتيز (PTP)1. تم العثور عليها في معظم أشكال الحياة ، بما في ذلك الكائنات الحية الضوئية المتباينة على نطاق واسع ، والبشر ، والفقاريات ، وبعض اللافقاريات والطلائعيات2،3،4. تحتوي النباتات على ثلاثة فوسفاتاز جلوكان معروفة: النشا الزائد 4 (SEX4) ، مثل الجنس four1 (LSF1) ، ومثل الجنس four2 (LSF2) 5،6،7. تظهر النباتات التي تفتقر إلى فوسفاتاز الجلوكان معدلات منخفضة من تدهور النشا المؤقت وتراكم النشا في الأوراق 8,9. لافورين هو العضو المؤسس لعائلة الفوسفاتيز الجلوكان التي تزيل الفسفوريلات الجليكوجين في الفقاريات والبشر 3,10. تؤدي طفرات اللافورين إلى مرض لافورا التنكسي العصبي ، وهو شكل صبغي جسدي متنحي قاتل من الصرع11. فوسفاتاز الجلوكان ضرورية لعملية التمثيل الغذائي للجليكوجين والنشا وقد ظهرت كإنزيمات مهمة لتعديل محتوى النشا في النباتات وعلاج مرض لافورا التنكسي العصبي12,13. ألقت دراسات علم البلورات بالأشعة السينية الحديثة على فوسفاتاز الجلوكان مع ركائز الجلوكان النموذجية الضوء على ارتباط الركيزة والآلية التحفيزية لإزالة فسفرة الجلوكان14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لكيفية ارتباط فوسفاتاز الجلوكان بركائزها الفسيولوجية غير مكتمل.
النشا عبارة عن بوليمر غير قابل للذوبان من الجلوكوز مصنوع من 80٪ -90٪ أميلوبكتين و 10٪ -20٪ أميلوز18. ركائز فوسفاتاز الجلوكان النباتية هي جزيئات الكربوهيدرات المفسفرة ، مثل حبيبات الجليكوجين والنشا. توجد بقايا الجلوكوزيل المفسفرة عند نسبة 1: 600 فوسفات: بقايا الجلوكوزيل. ومن المثير للاهتمام أن الفوسفات موجود فقط على جزيئات الأميلوبكتين19. يعمل النبات الرئيسي جلوكان فوسفاتيز SEX4 على حبيبات النشا لإزالة الفسفرة من جزيئات الأميلوبكتين. أظهرت البنية البلورية للأشعة السينية ل SEX4 جنبا إلى جنب مع دراسات الطفرات الموجهة بالهيكل خصائص الركيزة الفريدة ل SEX4 لمواقع مختلفة داخل بنية جلوكان15. لقد أظهرنا مؤخرا أنه لا يمكن ملاحظة النشاط ذي الصلة بيولوجيا ل SEX4 إلا عند العمل على ركائز الأميلوبكتين القابلة للذوبان20. ومع ذلك ، فقد ثبت أن فهم تفاعلات glucan-SEX4 أمر صعب بسبب التعقيد الهيكلي للركيزة ، وخصائص الربط الأوسع ، والصلات المنخفضة بين البروتين وركائزه. وقد أعاقت هذه القضايا القدرة على استخدام الأساليب المستخدمة بشكل شائع في تفاعلات البروتين والليجند، مثل قياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC)، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والمقايسات القائمة على مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
ومن المثير للاهتمام أن الكثير من فهمنا للتفاعلات بين الكربوهيدرات والبروتين قد جاء من دراسة المحاضرات. Concanavalin A (ConA) هي عائلة ليكتين من البقوليات من البروتينات المستخرجة أصلا من حبة جاك. يربط ConA الكربوهيدرات بخصوصية عالية ، وهو أمر مفيد لاستخدامه في تطبيقات استهداف الأدوية وتسليمها. تمت دراسة ارتباط ConA بمجموعة متنوعة من الركائز التي تحتوي على α-D-mannosyl غير المختزل و α-D-glucosyl على نطاق واسع19,20. تستخدم حبات السيفاروز المرتبطة ب ConA المتاحة تجاريا بشكل شائع لتنقية البروتينات السكرية والجليكوليبيدات21. يرتبط ConA بهذه الجلوكان عبر مجموعات هيدروكسيل C3 و C4 و C6 من بقايا الجلوكوز. كما تم استخدام حبات ConA-Sepharose بنجاح لقياس ارتباط تفاعلات بروتين الجليكوجين والنشاوالبروتين 22,23. في هذه الدراسة ، استخدمنا حبات ConA-Sepharose لتطوير مقايسة ملزمة لقياس خصائص الارتباط لتفاعلات الجلوكان فوسفاتيز والأميلوبكتين.
في السابق ، تم استخدام مقايسة الترسيب القائمة على ConA لتقييم قدرة ربط ركيزة الفوسفاتيزالجلوكان 14،20،24. في هذه الدراسة ، تم استخدام نفس الاستراتيجية لتطوير طريقة جديدة لتحديد تقارب الارتباط بين الفوسفاتيز الجلوكان وتفاعلات الكربوهيدرات. هذه الطريقة لها أيضا ميزة للتحقيق في مختلف تفاعلات الكربوهيدرات والبروتين القابلة للذوبان.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الدراسة التطور الناجح لمقايسة ترسيب جديدة في المختبر تسمح بتحديد تقارب الارتباط لتفاعلات الفوسفاتيز الجلوكان والجلوكان. يستفيد تصميم الفحص من الارتباط المحدد لليكتين كونا بالجلوكان عبر بقايا هيدروكسيل الجلوكوز لالتقاط ركائز الكربوهيدرات القابلة للذوبان بشكل غير مب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم MCB-2012074. يشكر المؤلفون الدكتور كريج دبليو فاندر كوي من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على المناقشات والدعم القيمين. كما يشكر المؤلفون الدكتور ماثيو س. جينتري من قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فلوريدا على دعمه. نود أن نشكر الدكتورة سارة لاجالوار ، رئيسة برنامج علم الأعصاب في كلية سكيدمور ، على السماح لنا باستخدام ماسح اللطخة LICOR C-digit لتصوير البقع الغربية.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. 생화학. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. 생화학. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
