グルカンホスファターゼの基質結合を測定するためのコンカナバリンAベースの沈降アッセイ
Summary
この方法は、グルカンホスファターゼとアミロペクチンの結合親和性を定量化するためのレクチンベースの in vitro 沈降アッセイを記載する。この共沈降アッセイは、グルカンホスファターゼ基質結合の測定に信頼性が高く、さまざまな可溶化グルカン基質に適用できます。
Abstract
グルカンホスファターゼは、動物のグリコーゲンや植物のデンプンなどのグルカン基質を脱リン酸化する二重特異性ホスファターゼ(DSP)のより大きなファミリーに属します。モデルグルカン基質を有するグルカンホスファターゼの結晶構造は、DSPと糖鎖結合ドメインからなる明確なグルカン結合界面を明らかにする。しかし、グルカン-グルカンホスファターゼと生理学的に関連する基質との相互作用の定量的測定は、グルカンホスファターゼファミリーの酵素の生物学的理解とエネルギー代謝の調節にとって基本的なものです。この原稿は、異なるグルカン基質に対するグルカンホスファターゼの基質結合親和性を検出するために設計されたConcanavalin A(ConA)ベースのin vitro沈降アッセイを報告しています。概念実証として、グルカンホスファターゼシロイヌナズナデンプン過剰4(SEX4)とアミロペクチンの解離定数(KD)を測定しました。SEX4変異体およびグルカンホスファターゼファミリーの酵素の他のメンバーの特性評価は、タンパク質-炭水化物相互作用の差次的結合を評価するためのこのアッセイの有用性をさらに実証しています。これらのデータは、広範囲のデンプンおよびグリコーゲン相互作用タンパク質の特性評価に対するこのアッセイの適合性を実証する。
Introduction
グルカンホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)スーパーファミリー1内の二重特異性ホスファターゼ(DSP)の機能的に多様なサブファミリーのメンバーです。それらは、広く異なる光合成生物、人間、脊椎動物、および一部の無脊椎動物や原生生物を含むほとんどの生命体で発見されています2,3,4。植物には、デンプン過剰4(SEX4)、ライクセックスフォー1(LSF1)、およびライクセックスフォー2(LSF2)5,6,7の3つの既知のグルカンホスファターゼが含まれています。グルカンホスファターゼを欠く植物は、一時的なデンプンの分解と葉のデンプンの蓄積の速度が低下します8,9。ラフォリンは、脊椎動物およびヒトのグリコーゲンを脱リン酸化するグルカンホスファターゼファミリーの創設メンバーです3,10。ラフォリンの変異は、てんかんの致命的な常染色体劣性形態である神経変性ラフォラ病をもたらします11。グルカンホスファターゼはグリコーゲンとデンプンの代謝に必要であり、植物のデンプン含有量を調節し、神経変性ラフォラ病を治療するための重要な酵素として浮上しています12,13。モデルグルカン基質を用いたグルカンホスファターゼに関する最近のX線結晶構造解析研究は、基質結合とグルカン脱リン酸化の触媒機構を明らかにしています14,15,16,17。しかし、グルカンホスファターゼがそれらの生理学的基質にどのように結合するかについての現在の理解は不完全である。
デンプンは、80%〜90%のアミロペクチンと10%〜20%のアミロースからなるグルコースの不溶性ポリマーです18。植物グルカンホスファターゼの基質は、グリコーゲンやデンプン顆粒などのリン酸化炭水化物分子です。リン酸化グルコシル残基は、1:600のリン酸:グルコシル残基比で存在します。興味深いことに、リン酸塩はアミロペクチン分子19上にのみ存在する。主な植物グルカンホスファターゼSEX4は、デンプン顆粒に作用してアミロペクチン分子を脱リン酸化します。構造誘導突然変異誘発研究と組み合わせたSEX4のX線結晶構造は、グルカン構造内のさまざまな位置に対するSEX4のユニークな基質特異性を実証しました15。我々は最近、SEX4の生物学的に関連する活性は、その可溶化アミロペクチン基質20に作用するときにのみ観察できることを示した。しかし、グルカン-SEX4相互作用を理解することは、基質の構造の複雑さ、より広い結合特異性、およびタンパク質とその基質間の結合親和性が低いため、困難であることが証明されています。これらの問題により、等温滴定熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)分光法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースのアッセイなど、タンパク質-リガンド相互作用で一般的に使用される方法を利用する能力が妨げられてきました。
興味深いことに、炭水化物とタンパク質の相互作用に関する私たちの理解の多くは、レクチンの研究から来ています。コンカナバリンA(ConA)は、もともとジャックビーンから抽出されたタンパク質のマメ科レクチンファミリーです。ConAは炭水化物に高い特異性で結合するため、薬物の標的化および送達用途での使用に有利です。非還元性α-D-マンノシルおよびα-D-グルコシルを含む様々な基質へのConAの結合は、広く研究されている19,20。市販のConA結合セファロースビーズは、糖タンパク質および糖脂質を精製するために一般的に使用されている21。ConAは、グルコース残基のC3、C4、およびC6ヒドロキシル基を介してこれらのグルカンに結合します。ConA-セファロースビーズは、グリコーゲン-タンパク質およびデンプン-タンパク質相互作用の結合を測定するためにも成功裏に使用されています22,23。本研究では、ConA-Sepharoseビーズを用いて、グルカンホスファターゼ-アミロペクチン相互作用の結合特異性を測定するための結合アッセイを開発しました。
以前は、グルカンホスファターゼ基質結合能を評価するためにConAベースの沈降アッセイが使用されていました14、20、24。この研究では、同じ戦略を使用して、グルカン-グルカンホスファターゼと炭水化物相互作用の結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。この方法は、様々な可溶化糖質-タンパク質相互作用を調べるための利点もある。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、グルカン-グルカンホスファターゼ相互作用の結合親和性の決定を可能にする新しい in vitro 沈降アッセイの開発に成功したことを示しています。アッセイデザインでは、グルコースのヒドロキシル残基 を介した グルカンへのレクチンConAの特異的結合を利用して、可溶化された炭水化物基質をセファロースビーズ上に間接的に捕捉します。これにより、遠心分離 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団賞MCB-2012074によってサポートされました。著者らは、貴重な議論と支援を提供してくれたフロリダ大学生化学分子生物学部のクレイグW.ヴァンダークーイ博士に感謝します。著者らはまた、フロリダ大学生化学・分子生物学部のマシュー・S・ジェントリー博士の支援に感謝している。スキッドモア大学神経科学プログラムの議長であるサラ・ラガルワー博士に、ウェスタンブロットイメージングにLICORC桁ブロットスキャナーの使用を許可してくださったことに感謝します。
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
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