Saggio di sedimentazione basato sulla concanavalina A per misurare il legame del substrato delle fosfatasi glucane
Summary
Questo metodo descrive un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla lectina per quantificare l’affinità di legame della fosfatasi glucana e dell’amilopectina. Questo saggio di co-sedimentazione è affidabile per misurare il legame del substrato della glucanofosfatasi e può essere applicato a vari substrati di glucano solubilizzati.
Abstract
Le fosfatasi glucane appartengono alla più ampia famiglia delle fosfatasi a doppia specificità (DSP) che defosforilate substrati di glucano, come il glicogeno negli animali e l’amido nelle piante. Le strutture cristalline della fosfatasi glucano con substrati di glucano modello rivelano distinte interfacce di legame glucano fatte di DSP e domini di legame dei carboidrati. Tuttavia, le misurazioni quantitative delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi con substrati fisiologicamente rilevanti sono fondamentali per la comprensione biologica della famiglia di enzimi glucanofosfatasi e la regolazione del metabolismo energetico. Questo manoscritto riporta un saggio di sedimentazione in vitro basato sulla Concanavalina A (ConA) progettato per rilevare l’affinità di legame del substrato delle fosfatasi glucane contro diversi substrati glucani. Come prova del concetto, è stata determinata la costante di dissociazione (KD) della glucanofosfatasi Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) e dell’amilopectina. La caratterizzazione dei mutanti SEX4 e di altri membri della famiglia degli enzimi glucanofosfatasi dimostra ulteriormente l’utilità di questo test per valutare il legame differenziale delle interazioni proteina-carboidrati. Questi dati dimostrano l’idoneità di questo test a caratterizzare un’ampia gamma di proteine che interagiscono tra amido e glicogeno.
Introduction
Le fosfatasi glucane sono membri di una sottofamiglia funzionalmente diversificata di fosfatasi a doppia specificità (DSP) all’interno dellasuperfamiglia 1 della proteina tirosina fosfatasi (PTP). Sono stati trovati nella maggior parte delle forme di vita, inclusi organismi fotosintetici ampiamente divergenti, esseri umani, vertebrati e alcuni invertebrati e protisti 2,3,4. Le piante contengono tre fosfatasi glucane note: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) e Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Le piante che mancano di fosfatasi glucano mostrano tassi ridotti di degradazione transitoria dell’amido e accumulo di amido nelle foglie 8,9. Laforin è il membro fondatore della famiglia delle fosfatasi glucane che defosforila il glicogeno nei vertebrati e nell’uomo 3,10. Le mutazioni della laforina provocano la malattia neurodegenerativa di Lafora, una forma autosomica recessiva fatale di epilessia11. Le fosfatasi glucane sono necessarie per il metabolismo del glicogeno e dell’amido e sono emerse come enzimi importanti per modulare il contenuto di amido nelle piante e trattare la malattia neurodegenerativa di Lafora12,13. Recenti studi di cristallografia a raggi X sulle fosfatasi glucane con substrati di glucano modello hanno fatto luce sul legame del substrato e sul meccanismo catalitico della defosforilazione del glucano14,15,16,17. Tuttavia, l’attuale comprensione di come le fosfatasi glucane si leghino ai loro substrati fisiologici è incompleta.
L’amido è un polimero insolubile di glucosio composto da 80% -90% amilopectina e 10% -20% amilosio18. I substrati per le fosfatasi glucane delle piante sono molecole di carboidrati fosforilati, come glicogeno e granuli di amido. I residui glucosilici fosforilati sono presenti con un rapporto fosfato/residuo glucosilico di 1:600. È interessante notare che i fosfati sono presenti solo sulle molecole di amilopectina19. La principale glucanofosfatasi SEX4 agisce sul granulo di amido per defosforilare le molecole di amilopectina. La struttura cristallina a raggi X di SEX4 combinata con studi di mutagenesi guidati dalla struttura ha dimostrato le specificità uniche del substrato di SEX4 per diverse posizioni all’interno di una struttura glucana15. Abbiamo recentemente dimostrato che l’attività biologicamente rilevante di SEX4 può essere osservata solo quando agisce sui suoi substrati solubilizzati di amilopectina20. Tuttavia, la comprensione delle interazioni glucano-SEX4 si è dimostrata difficile a causa della complessità strutturale del substrato, delle più ampie specificità di legame e delle basse affinità di legame tra la proteina e i suoi substrati. Questi problemi hanno ostacolato la capacità di utilizzare metodi comunemente usati nelle interazioni proteina-ligando, come la calorimetria isotermica di titolazione (ITC), la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e i saggi basati su saggi basati su immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
È interessante notare che gran parte della nostra comprensione delle interazioni carboidrati-proteine proviene dallo studio delle lectine. La concanavalina A (ConA) è una famiglia di lectine leguminose originariamente estratte dal fagiolo. ConA lega i carboidrati con elevata specificità, il che è vantaggioso per il suo uso in applicazioni di targeting e somministrazione di farmaci. Il legame di ConA ad una varietà di substrati contenenti α-D-mannosil e α-D-glucosil non riducenti è stato ampiamente studiato19,20. Le perle di selosorosio legate al ConA disponibili in commercio sono comunemente usate per purificare glicoproteine e glicolipidi21. ConA si lega a questi glucani attraverso i gruppi ossidrilici C3, C4 e C6 dei residui di glucosio. Le perle di ConA-Sepharose sono state utilizzate con successo anche per misurare il legame delle interazioni glicogeno-proteina e amido-proteina22,23. In questo studio, abbiamo utilizzato perle di ConA-Sepharose per sviluppare un test di legame per misurare le specificità di legame delle interazioni glucano-fosfatasi-amilopectina.
In precedenza, è stato utilizzato un saggio di sedimentazione basato su ConA per valutare la capacità di legame del substrato di glucanofosfatasi14,20,24. In questo studio, la stessa strategia è stata utilizzata per sviluppare un nuovo metodo per determinare l’affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi e carboidrati. Questo metodo ha anche un vantaggio per studiare varie interazioni carboidrati-proteine solubilizzate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio dimostra il successo dello sviluppo di un nuovo saggio di sedimentazione in vitro che consente di determinare l’affinità di legame delle interazioni glucano-glucano-fosfatasi. Il progetto del saggio sfrutta il legame specifico della lectina ConA ai glucani attraverso i residui idrossilici del glucosio per catturare indirettamente substrati di carboidrati solubilizzati su perle di salsorosio. Ciò consente la separazione delle frazioni proteiche legate e non legate tramite centrif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal premio della National Science Foundation MCB-2012074. Gli autori ringraziano il Dr. Craig W. Vander Kooi del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Università della Florida per le preziose discussioni e supporto. Gli autori ringraziano anche il Dr. Matthew S. Gentry del Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare dell’Università della Florida per il suo supporto. Vorremmo ringraziare la dottoressa Sara Lagalwar, presidente del programma di neuroscienze dello Skidmore College, per averci permesso di utilizzare lo scanner LICOR C-digit blot per l’imaging western blot.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
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