הערכת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים במבחנה
Summary
אנו מציגים ארבע שיטות להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים באמצעות טכניקות in vitro . שיטות אלה יכולות להיות מותאמות לחקר האינטראקציות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים שונים עם מגוון רחב של מיני מיקרובים.
Abstract
הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים, כגון כסף, תחמוצת אבץ, טיטניום דו-חמצני ותחמוצת מגנזיום, נחקרה בעבר בסביבות קליניות וסביבתיות ובמוצרי מזון מתכלים. עם זאת, חוסר עקביות בשיטות הניסוי ובחומרים שבהם נעשה שימוש הביא לתוצאות סותרות, אפילו בקרב מחקרים על אותם סוגי ננו-מבנים ומיני חיידקים. עבור חוקרים המעוניינים להשתמש בננו-מבנים כתוסף או ציפוי בעיצוב מוצר, נתונים סותרים אלה מגבילים את השימוש בהם בסביבות קליניות.
כדי להתמודד עם דילמה זו, במאמר זה נציג ארבע שיטות שונות לקביעת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים, ונדון ביישומם בתרחישים שונים. התאמת שיטות עקביות צפויה להוביל לנתונים הניתנים לשחזור שניתן להשוות בין מחקרים וליישם עבור סוגי ננו-מבנים ומינים מיקרוביאליים שונים. אנו מציגים שתי שיטות לקביעת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ושתי שיטות לפעילות האנטי-מיקרוביאלית של משטחים ננו-מבניים.
עבור ננו-חלקיקים, ניתן להשתמש בשיטת התרבית המשותפת הישירה כדי לקבוע את הריכוזים המעכבים המינימליים והמינימליים של קוטלי חיידקים של ננו-חלקיקים, וניתן להשתמש בשיטת תרבית החשיפה הישירה כדי להעריך פעילות בקטריוסטטית בזמן אמת לעומת פעילות חיידקית כתוצאה מחשיפה לננו-חלקיקים. עבור משטחים ננו-מבניים, שיטת התרבית הישירה משמשת לקביעת הכדאיות של חיידקים במגע עקיף וישיר עם משטחים ננו-מבניים, ושיטת החשיפה במגע ממוקד משמשת לבחינת פעילות מיקרוביאלית על אזור מסוים של משטח ננו-מבני. אנו דנים במשתני ניסוי מרכזיים שיש לקחת בחשבון עבור תכנון מחקר חוץ גופי בעת קביעת התכונות האנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים. כל השיטות הללו הן בעלות נמוכה יחסית, משתמשות בטכניקות שקל יחסית לשלוט בהן ולחזור עליהן לצורך עקביות, והן ישימות למגוון רחב של סוגי ננו-מבנים ומינים מיקרוביאליים.
Introduction
בארה”ב לבדה, 1.7 מיליון אנשים מפתחים זיהום נרכש בבית חולים (HAI) מדי שנה, כאשר אחד מכל 17 זיהומים אלה מסתיים במוות1. בנוסף, ההערכה היא כי עלויות הטיפול עבור HAIs נע בין 28 מיליארד $ ל 45 מיליארד $ בשנה 1,2. HAIs אלה נשלטים על ידי Staphylococcus aureus עמיד למתיצילין (MRSA)3,4 ו– Pseudomonas aeruginosa4, אשר מבודדים בדרך כלל מזיהומים כרוניים בפצע ובדרך כלל דורשים טיפול נרחב וזמן כדי לייצר תוצאה חיובית של המטופל.
במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר סוגי אנטיביוטיקה לטיפול בזיהומים הקשורים לחיידקים פתוגניים אלה ואחרים. לדוגמה, אנלוגים rifamycin שימשו לטיפול MRSA, זיהומים אחרים גרם חיובי גרם שלילי, ו Mycobacterium spp. זיהומים5. בשנות התשעים, כדי לטפל ביעילות במספר גדל והולך של זיהומים שחפת, תרופות נוספות שולבו עם אנלוגים rifamycin כדי להגדיל את יעילותם. עם זאת, כ -5% ממקרי שחפת נשארים עמידיםלריפמפיצין5,6, ויש חשש גובר לגבי חיידקים עמידים לתרופות7. נכון לעכשיו, השימוש באנטיביוטיקה לבדה עשוי שלא להספיק בטיפול ב- HAIs, וזה עורר חיפוש מתמשך אחר טיפולים אנטי מיקרוביאליים חלופיים1.
מתכות כבדות, כגון כסף (Ag)8,9,10 וזהב (Au)11, וקרמיקה, כגון טיטניום דו-חמצני (TiO 2)12 ותחמוצת אבץ (ZnO)13, בצורת ננו-חלקיקים (NP) (AgNP, AuNP, TiO 2 NP ו-ZnONP, בהתאמה) נבדקו עבור פעילותן האנטי-מיקרוביאלית וזוהו כחלופות אנטיביוטיות פוטנציאליות. בנוסף, חומרים הניתנים לספיגה ביולוגית, כגון סגסוגות מגנזיום (סגסוגות MG)14,15,16, ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום 17,18,19,20,21, וננו-חלקיקי מגנזיום הידרוקסיד [nMgO ו-nMg(OH)2, בהתאמה]22,23,24נבדקו גם., עם זאת, המחקרים האנטי-מיקרוביאליים הקודמים של ננו-חלקיקים השתמשו בחומרים ובשיטות מחקר לא עקביות, וכתוצאה מכך נתונים שקשה או בלתי אפשרי להשוות ולעתים סותרים באופיים18,19. לדוגמה, הריכוז המעכב המינימלי (MIC) והריכוז המינימלי של קוטלי חיידקים (MBC) של ננו-חלקיקי כסף השתנו באופן משמעותי במחקרים שונים. Ipe et al.25 העריכו את הפעילות האנטיבקטריאלית של AgNPs עם גודל חלקיקים ממוצע של ~ 26 ננומטר כדי לקבוע את MICs נגד חיידקים חיוביים גראם וחיידקים שליליים. ה-MICs שזוהו עבור P. aeruginosa, E. coli, S. aureus ו-MRSA היו 2 מיקרוגרם/מ”ל, 5 מיקרוגרם/מ”ל, 10 מיקרוגרם/מ”ל ו-10 מיקרוגרם/מ”ל, בהתאמה. לעומת זאת, Parvekar et al.26 העריכו AgNPs עם גודל חלקיקים ממוצע של 5 ננומטר. במקרה זה, מיקרופון AgNP ו- MBC של 0.625 מ”ג / מ”ל נמצאו יעילים נגד S. aureus. בנוסף, Loo et al.27 העריכו AgNPs בגודל של 4.06 ננומטר. כאשר E. coli נחשף לננו-חלקיקים אלה, ה-MIC וה-MBC דווחו ב-7.8 מיקרוגרם/מ”ל. לבסוף, Ali et al.28 חקרו את התכונות האנטיבקטריאליות של AgNPs כדוריים בגודל ממוצע של 18 ננומטר. כאשר P. aeruginosa, E. coli ו-MRSA נחשפו לננו-חלקיקים אלה, המיקרופון זוהה ב-27 מיקרוגרם/מ”ל, 36 מיקרוגרם/מ”ל, 27 מיקרוגרם/מ”ל ו-36 מיקרוגרם/מ”ל, בהתאמה, וה-MBC זוהה ב-36 מק”ג/מ”ל, 42 מיקרוגרם/מ”ל ו-30 מק”ג/מ”ל, בהתאמה.
למרות שהפעילות האנטי-בקטריאלית של ננו-חלקיקים נחקרה ודווחה בהרחבה במהלך העשורים האחרונים, אין תקן לחומרים ולשיטות המחקר המשמשים כדי לאפשר השוואה ישירה בין מחקרים. מסיבה זו אנו מציגים שתי שיטות, שיטת התרבית המשותפת הישירה (שיטה א’) ושיטת החשיפה הישירה (שיטה ב’), לאפיון והשוואה של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים תוך שמירה על עקביות החומרים והשיטות.
בנוסף לננו-חלקיקים, נבדקו גם משטחים ננו-מבניים לפעילות אנטיבקטריאלית. אלה כוללים חומרים מבוססי פחמן, כגון ננו-יריעות גרפן, ננו-צינוריות פחמן וגרפיט29, כמו גם סגסוגות Mg ו-Mg טהורות. כל אחד מהחומרים הללו הציג לפחות מנגנון אנטיבקטריאלי אחד, כולל נזק פיזי המוטל על קרום התא על ידי חומרים מבוססי פחמן ונזק לתהליכים מטבוליים או דנ”א באמצעות שחרור מיני חמצן תגובתי (ROS) כאשר Mg מתכלה. בנוסף, כאשר אבץ (Zn) וסידן (Ca) משולבים בהיווצרות סגסוגות MG, העידון של גודל גרגרי מטריצת Mg משופר, מה שמוביל לירידה בהידבקות חיידקים למשטחי המצע בהשוואה לדגימות Mg בלבד14. כדי להדגים פעילות אנטיבקטריאלית, אנו מציגים את שיטת התרבית הישירה (שיטה C), הקובעת הידבקות חיידקים על וסביב חומרים ננו-מבניים לאורך זמן באמצעות כימות יחידות יוצרות מושבות חיידקים (CFUs) עם מגע ישיר ועקיף עם פני השטח.
הגיאומטריה של ננו-מבנים על משטחים, כולל גודל, צורה והתמצאות, יכולה להשפיע על הפעילות החיידקית של חומרים. לדוגמה, Lin et al.16 יצרו שכבות MgO ננו-מובנות שונות על פני השטח של מצעי Mg באמצעות אנודיזציה ותצהיר אלקטרופורטי (EPD). לאחר תקופה של חשיפה למשטח הננו-מבני במבחנה, הצמיחה של S. aureus הופחתה באופן משמעותי בהשוואה ל- Mg שלא טופל. זה הצביע על עוצמה גדולה יותר של המשטח הננו-מבני כנגד הידבקות חיידקים לעומת משטח Mg מתכתי שאינו מטופל. כדי לחשוף את המנגנונים השונים של התכונות האנטיבקטריאליות של משטחים ננו-מבניים שונים, נדון במאמר זה שיטת חשיפה במגע ממוקד (שיטה D) הקובעת את אינטראקציות התא-פני השטח בתחום העניין.
מטרת מאמר זה היא להציג ארבע שיטות במבחנה הישימות לננו-חלקיקים שונים, משטחים ננו-מבניים ומינים מיקרוביאליים. אנו דנים בשיקולים מרכזיים עבור כל שיטה כדי להפיק נתונים עקביים הניתנים לשחזור לצורך השוואה. באופן ספציפי, שיטת התרבית המשותפת הישירה17 ושיטת החשיפה הישירה משמשות לבחינת התכונות האנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים. באמצעות שיטת התרבית המשותפת הישירה, ניתן לקבוע את ריכוזי החיידקים המעכבים והמינימליים (MIC ו- MBC90-99.99, בהתאמה) עבור מינים בודדים, וניתן לקבוע את הריכוז החזק ביותר (MPC) עבור מינים מרובים. באמצעות שיטת החשיפה הישירה, ניתן לאפיין את ההשפעות הבקטריוסטטיות או קוטלי החיידקים של ננו-חלקיקים בריכוזים מעכבים מינימליים על ידי קריאות צפיפות אופטית בזמן אמת לאורך זמן. שיטת תרבית ישירה14 מתאימה לבחינת חיידקים הבאים במגע ישיר ועקיף עם משטחים ננו-מבניים. לבסוף, מוצגת שיטת חשיפה ממוקדתמגע 16 לבחינת הפעילות האנטיבקטריאלית של אזור מסוים על משטח ננו-מבני באמצעות יישום ישיר של חיידקים ואפיון גדילת חיידקים בממשק תא-ננו-מבנה. שיטה זו שונה מהתקן התעשייתי היפני JIS Z 2801:200016, והיא מיועדת להתמקד באינטראקציות בין מיקרואורגניזמים לפני השטח ולא לכלול את ההשפעות של פירוק דגימות בתפזורת בתרבית מיקרוביאלית על פעילויות מיקרוביאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצגנו ארבע שיטות במבחנה (A-D) לאפיון הפעילות האנטיבקטריאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים. בעוד שכל אחת מהשיטות הללו מכמתת את גדילת החיידקים ואת יכולת הקיום שלהם לאורך זמן בתגובה לננו-חומרים, קיימת שונות מסוימת בשיטות המשמשות למדידת צפיפות הזריעה הראשונית של חיידקים, גדילה וכדאיו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדע של ארה”ב (פרס NSF CBET 1512764 ו- NSF PIRE 1545852), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH NIDCR 1R03DE028631), מלגת פיתוח הפקולטה של אוניברסיטת קליפורניה (UC) ריג’נטס, הוועדה למענק זרעי מחקר (Huinan Liu), ומענק תוכנית חונכות המחקר לתארים מתקדמים של UC-Riverside שהוענק לפטרישיה הולט-טורס. המחברים מעריכים את הסיוע שניתן על ידי המתקן המרכזי למיקרוסקופיה ומיקרואנליזה מתקדמת (CFAMM) באוניברסיטת UC-Riverside לשימוש ב- SEM/EDS וד”ר פרי צ’אונג לשימוש ב- XRD. המחברים רוצים גם להודות למורגן אליזבת נטור וסמהיטה טומקור על עזרתם בניסויים ובניתוח הנתונים. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את הדעות של הקרן הלאומית למדע או המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
References
- Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections – An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
- O’Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
- Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
- Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
- Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
- Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
- Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
- Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
- Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
- Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
- Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
- Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
- Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
- Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
- Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
- Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
- Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
- Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
- He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
- Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
- Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
- Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
- Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
- Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
- Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
- Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
- Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
- Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
- Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
- MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18″x16″x18″, 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) – BPG-7082. , (2022).
- CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
- . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
- Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
- Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
- Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions – Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
- Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
- Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
- Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
- Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).
