Оценка антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей in vitro
Summary
Мы представляем четыре метода оценки антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей с использованием методов in vitro . Эти методы могут быть адаптированы для изучения взаимодействия различных наночастиц и наноструктурированных поверхностей с широким спектром микробных видов.
Abstract
Антимикробная активность наночастиц и наноструктурированных поверхностей, таких как серебро, оксид цинка, диоксид титана и оксид магния, ранее изучалась в клинических и экологических условиях, а также в потребляемых пищевых продуктах. Однако отсутствие согласованности в используемых экспериментальных методах и материалах привело к противоречивым результатам, даже среди исследований одних и тех же типов наноструктур и видов бактерий. Для исследователей, которые хотят использовать наноструктуры в качестве добавки или покрытия в дизайне продукта, эти противоречивые данные ограничивают их использование в клинических условиях.
Чтобы противостоять этой дилемме, в этой статье мы представляем четыре различных метода определения антимикробной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей и обсуждаем их применимость в различных сценариях. Ожидается, что адаптация последовательных методов приведет к воспроизводимым данным, которые можно будет сравнивать в разных исследованиях и внедрять для различных типов наноструктур и видов микробов. Мы представляем два метода определения антимикробной активности наночастиц и два метода антимикробной активности наноструктурированных поверхностей.
Для наночастиц метод прямого совместного культивирования может быть использован для определения минимальных ингибирующих и минимальных бактерицидных концентраций наночастиц, а метод культивирования прямого воздействия может быть использован для оценки бактериостатической и бактерицидной активности в реальном времени, возникающей в результате воздействия наночастиц. Для наноструктурированных поверхностей метод прямого культивирования используется для определения жизнеспособности бактерий, косвенно и непосредственно контактирующих с наноструктурированными поверхностями, а метод воздействия с фокусированным контактом используется для изучения антимикробной активности на определенном участке наноструктурированной поверхности. Мы обсуждаем ключевые экспериментальные переменные, которые следует учитывать при дизайне исследования in vitro при определении антимикробных свойств наночастиц и наноструктурированных поверхностей. Все эти методы относительно недороги, используют методы, которые относительно просты в освоении и воспроизводимы для согласованности, и применимы к широкому спектру типов наноструктур и микробных видов.
Introduction
Только в США у 1,7 миллиона человек ежегодно развивается внутрибольничная инфекция (ИСМП), причем каждая 17-я из этих инфекций приводит к смерти1. Кроме того, по оценкам, затраты на лечение ИСМП варьируются от 28 до 45 миллиардов долларов в год 1,2. В этих ИСМП преобладают метициллин-резистентные золотистые стафилококки (MRSA)3,4 и Pseudomonas aeruginosa4, которые обычно выделяются из хронических раневых инфекций и обычно требуют обширного лечения и времени для получения благоприятного исхода для пациента.
За последние несколько десятилетий было разработано несколько классов антибиотиков для лечения инфекций, связанных с этими и другими патогенными бактериями. Например, аналоги рифамицина использовались для лечения MRSA, других грамположительных и грамотрицательных инфекций и инфекций Mycobacterium spp.5. В 1990-х годах для эффективного лечения растущего числа инфекций, вызванных M. tuberculosis, дополнительные препараты были объединены с аналогами рифамицина для повышения их эффективности. Тем не менее, примерно 5% случаев M. tuberculosis остаются устойчивыми крифампицину5,6, и растет обеспокоенность в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью7. В настоящее время использование одних только антибиотиков может быть недостаточным для лечения ИСМП, и это спровоцировало постоянный поиск альтернативных антимикробных методов лечения1.
Тяжелые металлы, такие как серебро (Ag)8,9,10 и золото (Au)11, а также керамика, такая как диоксид титана (TiO2)12 и оксид цинка (ZnO)13, в форме наночастиц (NP) (AgNP, AuNP, TiO2 NP и ZnONP соответственно)были исследованы на предмет их антимикробной активности и были идентифицированы как потенциальные альтернативы антибиотикам. Кроме того, биорезорбируемые материалы, такие как магниевые сплавы (сплавы Mg)14,15,16, наночастицы оксида магния 17,18,19,20,21 и наночастицы гидроксида магния [nMgO и nMg(OH)2, соответственно]22,23,24, также были изучены. Однако в предыдущих антимикробных исследованиях наночастиц использовались противоречивые материалы и методы исследования, в результате чего данные, которые трудно или невозможно сопоставить, а иногда и противоречивы по своей природе18,19. Например, минимальная ингибирующая концентрация (MIC) и минимальная бактерицидная концентрация (MBC) наночастиц серебра значительно варьировались в разных исследованиях. Ipe et al.25 оценили антибактериальную активность AgNP со средним размером частиц ~ 26 нм для определения МИК против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Идентифицированные MIC для P. aeruginosa, E. coli, S. aureus и MRSA составляли 2 мкг / мл, 5 мкг / мл, 10 мкг / мл и 10 мкг / мл соответственно. Напротив, Parvekar et al.26 оценили AgNP со средним размером частиц 5 нм. В этом случае было обнаружено, что AgNP MIC и MBC 0,625 мг / мл эффективны против S. aureus. Кроме того, Loo et al.27 оценили AgNP размером 4,06 нм. Когда E. coli подвергалась воздействию этих наночастиц, сообщалось, что MIC и MBC составляют 7,8 мкг / мл. Наконец, Ali et al.28 исследовали антибактериальные свойства сферических AgNP со средним размером 18 нм. Когда P. aeruginosa, E. coli и MRSA подвергались воздействию этих наночастиц, MIC был идентифицирован при 27 мкг / мл, 36 мкг / мл, 27 мкг / мл и 36 мкг / мл соответственно, а MBC был идентифицирован при 36 мкг / мл, 42 мкг / мл и 30 мкг / мл соответственно.
Несмотря на то, что антибактериальная активность наночастиц широко изучалась и освещалась в течение последних десятилетий, не существует стандарта для используемых материалов и методов исследования, позволяющих проводить прямые сравнения между исследованиями. По этой причине мы представляем два метода: метод прямого совместного культивирования (метод А) и метод прямого воздействия (метод Б), чтобы охарактеризовать и сравнить антимикробную активность наночастиц при сохранении согласованности материалов и методов.
В дополнение к наночастицам, наноструктурированные поверхности также были исследованы на антибактериальную активность. К ним относятся материалы на основе углерода, такие как графеновые нанолисты, углеродные нанотрубки и графит29, а также чистые сплавы Mg и Mg. Каждый из этих материалов проявляет по крайней мере один антибактериальный механизм, включая физическое повреждение, налагаемое на клеточные мембраны материалами на основе углерода, и повреждение метаболических процессов или ДНК посредством высвобождения активных форм кислорода (АФК) при разложении Mg. Кроме того, при объединении цинка (Zn) и кальция (Ca) при образовании сплавов Mg улучшается уточнение размера зерна матрицы Mg, что приводит к снижению адгезии бактерий к поверхностям подложки по сравнению с образцами14, содержащими только Mg. Чтобы продемонстрировать антибактериальную активность, мы представляем метод прямого культивирования (метод C), который определяет адгезию бактерий к наноструктурированным материалам и вокруг них с течением времени путем количественного определения бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ) с прямым и косвенным поверхностным контактом.
Геометрия наноструктур на поверхностях, включая размер, форму и ориентацию, может влиять на бактерицидную активность материалов. Например, Lin et al.16 изготовили различные наноструктурированные слои MgO на поверхностях подложек Mg путем анодирования и электрофоретического осаждения (EPD). После периода воздействия на наноструктурированную поверхность in vitro рост S. aureus был существенно снижен по сравнению с необработанным Mg. Это указывает на большую эффективность наноструктурированной поверхности против бактериальной адгезии по сравнению с необработанной металлической поверхностью Mg. Для выявления различных механизмов антибактериальных свойств различных наноструктурированных поверхностей в данной статье обсуждается метод сфокусированного контактного воздействия (метод D), определяющий взаимодействия клетки с поверхностью в пределах исследуемой области.
Целью данной статьи является представление четырех методов in vitro, применимых к различным наночастицам, наноструктурированным поверхностям и микробным видам. Мы обсудим ключевые соображения для каждого метода для получения согласованных, воспроизводимых данных для сопоставимости. В частности, метод прямого совместного культивирования17 и метод прямого воздействия используются для изучения антимикробных свойств наночастиц. С помощью метода прямого совместного культивирования минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации (MIC и MBC90-99,99 соответственно) могут быть определены для отдельных видов, а наиболее мощная концентрация (MPC) может быть определена для нескольких видов. С помощью метода прямого воздействия бактериостатические или бактерицидные эффекты наночастиц при минимальных ингибирующих концентрациях могут быть охарактеризованы показаниями оптической плотности в реальном времени с течением времени. Метод прямого культивирования14 пригоден для исследования бактерий, непосредственно и косвенно контактирующих с наноструктурированными поверхностями. Наконец, представлен метод16 фокусированного контактного воздействия для изучения антибактериальной активности конкретной области на наноструктурированной поверхности посредством прямого применения бактерий и характеристики роста бактерий на границе раздела клетка-наноструктура. Этот метод является модифицированным по сравнению с японским промышленным стандартом JIS Z 2801:200016 и предназначен для сосредоточения внимания на взаимодействии микробов с поверхностью и исключения влияния разложения объемного образца в микробной культуре на антимикробную активность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили четыре метода in vitro (A-D) для характеристики антибактериальной активности наночастиц и наноструктурированных поверхностей. В то время как каждый из этих методов количественно оценивает рост и жизнеспособность бактерий с течением времени в ответ на наноматериалы, су?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы высоко ценят финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда США (награда NSF CBET 1512764 и NSF PIRE 1545852), Национальных институтов здравоохранения (NIH NIDCR 1R03DE028631), стипендии Калифорнийского университета (UC) Regents Faculty Development Fellowship, гранта Комитета по исследованиям (Huinan Liu) и гранта программы наставничества для выпускников UC-Riverside, присужденного Патрисии Холт-Торрес. Авторы высоко ценят помощь, оказанную Центральным центром расширенной микроскопии и микроанализа (CFAMM) в Калифорнийском университете в Риверсайде в использовании SEM / EDS и доктором Перри Чунгом в использовании XRD. Авторы также хотели бы поблагодарить Морган Элизабет Натор и Самхиту Тумкур за их помощь в экспериментах и анализе данных. Любые мнения, выводы, заключения или рекомендации, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда или Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Milipore Sigma | Z336777 | |
| 80 L NTRL Certified Convection Drying Oven | MTI Corporation | BPG-7082 | https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx |
| (hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer | Sigma-Aldrich | 42457 | |
| AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE | Fisher Scientific | 50-850-291 | |
| Electron-multiplying charge-coupled device digital camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Gluteraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Hemocytometer | Brightline, Hausser Scientific | 1492 | |
| Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES) | PerkinElmer | 8000 | |
| Inverse microscope | Nikon | Eclipse Ti-S | |
| Luria Bertani Broth | Sigma Life Science | L3022 | |
| Luria Bertani Broth + agar | Sigma Life Science | L2897 | |
| MacroTube 5.0 | Benchmark Scientific | C1005-T5-ST | |
| Magnesium oxide nanoparticles | US Research Nanomaterials, Inc | Stock #: US3310 M | MgO, 99+%, 20 nm |
| MS Semi-Micro Balance | Mettler Toledo | MS105D | |
| Nitrocellulose paper | Fisherbrand | 09-801A | |
| Non-tissue treated 12-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351143 | |
| Non-tissue treated 48-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351178 | |
| Non-tissue treated 96-well polystyrene plate | Falcon Corning Brand | 351172 | |
| Petri dish 100 mm | VWR | 470210-568 | |
| Petri dish, 15 mm | Fisherbrand | FB0875713A | |
| pH meter | VWR | SP70P | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | TESCAN | Vega3 SBH | |
| Sonicator | VWR | 97043-936 | |
| Table top centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5430 | |
| Tryptic Soy Agar | MP | 1010617 | |
| Tryptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092-500G | |
| UV-Vis spectrophotometer | Tecan | Infinite 200 PRO | https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro |
| VWR Benchmark Incu-shaker 10L | VWR | N/A | |
| X-ray power defraction | Panalytical | N/A | PANalytical Empyrean Series 2 |
References
- Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections – An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
- O’Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
- Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
- Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
- Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
- Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
- Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
- Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
- Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
- Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
- Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
- Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
- Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
- Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
- Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
- Lin, J., Nguyen, N. -. Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
- Nguyen, N. -. Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
- Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
- He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
- Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
- Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
- Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
- Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
- Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
- Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
- Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
- Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
- Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
- Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
- MTI Corporation. . 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18″x16″x18″, 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) – BPG-7082. , (2022).
- CHEBI. . Tris (CHEBI:9754). , (2023).
- . Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
- Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
- Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
- Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions – Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
- Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
- Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
- Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
- Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).
