Evaluación de las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas in vitro

Summary

Presentamos cuatro métodos para evaluar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas utilizando técnicas in vitro . Estos métodos se pueden adaptar para estudiar las interacciones de diferentes nanopartículas y superficies nanoestructuradas con una amplia gama de especies microbianas.

Abstract

Las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas, como plata, óxido de zinc, dióxido de titanio y óxido de magnesio, se han explorado previamente en entornos clínicos y ambientales y en productos alimenticios consumibles. Sin embargo, la falta de consistencia en los métodos experimentales y materiales utilizados ha culminado en resultados contradictorios, incluso entre estudios de los mismos tipos de nanoestructuras y especies bacterianas. Para los investigadores que desean emplear nanoestructuras como aditivo o recubrimiento en el diseño de un producto, estos datos contradictorios limitan su utilización en entornos clínicos.

Para enfrentar este dilema, en este artículo, presentamos cuatro métodos diferentes para determinar las actividades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas, y discutimos su aplicabilidad en diferentes escenarios. Se espera que la adaptación de métodos consistentes conduzca a datos reproducibles que puedan compararse entre estudios e implementarse para diferentes tipos de nanoestructuras y especies microbianas. Introducimos dos métodos para determinar las actividades antimicrobianas de las nanopartículas y dos métodos para las actividades antimicrobianas de las superficies nanoestructuradas.

Para las nanopartículas, el método de cocultivo directo se puede utilizar para determinar las concentraciones bactericidas mínimas inhibitorias y mínimas de nanopartículas, y el método de cultivo de exposición directa se puede utilizar para evaluar la actividad bacteriostática en tiempo real frente a la actividad bactericida resultante de la exposición a nanopartículas. Para superficies nanoestructuradas, el método de cultivo directo se utiliza para determinar la viabilidad de las bacterias indirectamente y directamente en contacto con superficies nanoestructuradas, y el método de exposición de contacto enfocado se utiliza para examinar la actividad antimicrobiana en un área específica de una superficie nanoestructurada. Discutimos las variables experimentales clave a considerar para el diseño del estudio in vitro al determinar las propiedades antimicrobianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas. Todos estos métodos son relativamente de bajo costo, emplean técnicas que son relativamente fáciles de dominar y repetibles para la consistencia, y son aplicables a una amplia gama de tipos de nanoestructuras y especies microbianas.

Introduction

Solo en los Estados Unidos, 1.7 millones de personas desarrollan una infección adquirida en el hospital (HAI) anualmente, y una de cada 17 de estas infecciones resulta en la muerte¹. Además, se estima que los costos de tratamiento de las IRAS oscilan entre $ 28 mil millones y $ 45 mil millones anuales ^1,2. Estas IRAS están predominadas por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM)^3,4 y Pseudomonas aeruginosa^4, que comúnmente se aíslan de infecciones crónicas de heridas y generalmente requieren un tratamiento extenso y tiempo para producir un resultado favorable para el paciente.

En las últimas décadas, se han desarrollado múltiples clases de antibióticos para tratar infecciones relacionadas con estas y otras bacterias patógenas. Por ejemplo, los análogos de la rifamicina se han utilizado para tratar MRSA, otras infecciones grampositivas y gramnegativas, y Mycobacterium spp.^{infecciones 5}. En la década de 1990, para tratar eficazmente un número creciente de infecciones por M. tuberculosis, se combinaron medicamentos adicionales con análogos de rifamicina para aumentar su efectividad. Sin embargo, aproximadamente el 5% de los casos de M. tuberculosis siguen siendo resistentes a larifampicina^5,6, y existe una creciente preocupación con respecto a las bacterias resistentes a múltiples fármacos⁷. Actualmente, el uso de antibióticos solos puede no ser suficiente en el tratamiento de las IRAS, y esto ha provocado una búsqueda continua de terapias antimicrobianas alternativas¹.

Los metales pesados, como la plata (Ag)8,9,10 y el oro (Au)¹¹, y la cerámica, como el dióxido de titanio (_TiO2)¹² y el óxido de zinc (ZnO)¹³, en forma de nanopartículas (NP) (AgNP, AuNP, TiO₂NP y ZnONP^, respectivamente) han sido examinados por sus actividades antimicrobianas y han sido identificados como posibles alternativas antibióticas. Además, los materiales biorreabsorbibles, como las aleaciones de magnesio (aleaciones de Mg)14,15,16, las nanopartículas de óxido de magnesio 17,18,19,20,21 y las nanopartículas de hidróxido de magnesio [nMgO y nMg(OH)₂, respectivamente]^22,23,24, también se han examinado. Sin embargo, los estudios antimicrobianos previos de nanopartículas utilizaron materiales y métodos de investigación inconsistentes, lo que resultó en datos que son difíciles o imposibles de comparar y a veces son de naturaleza contradictoria^18,19. Por ejemplo, la concentración inhibitoria mínima (CMI) y la concentración bactericida mínima (CMM) de las nanopartículas de plata variaron significativamente en diferentes estudios. Ipe et ^al.25 evaluaron las actividades antibacterianas de AgNPs con un tamaño de partícula promedio de ~26 nm para determinar las CMI contra bacterias grampositivas y gramnegativas. Las CMI identificadas para P. aeruginosa, E. coli, S. aureus y SARM fueron 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL y 10 μg/mL, respectivamente. En contraste, Parvekar et ^al.26 evaluaron AgNPs con un tamaño de partícula promedio de 5 nm. En este caso, se encontró que la CMI AgNP y un MBC de 0,625 mg/ml eran efectivos contra S. aureus. Además, Loo et ^al.27 evaluaron AgNPs con un tamaño de 4,06 nm. Cuando E. coli fue expuesta a estas nanopartículas, la CMI y MBC fueron reportadas a 7.8 μg/mL. Finalmente, Ali et ^al.28 investigaron las propiedades antibacterianas de AgNPs esféricas con un tamaño promedio de 18 nm. Cuando P. aeruginosa, E. coli y MRSA fueron expuestos a estas nanopartículas, la CMI se identificó en 27 μg/mL, 36 μg/mL, 27 μg/mL y 36 μg/mL, respectivamente, y la MBC se identificó en 36 μg/mL, 42 μg/mL y 30 μg/mL, respectivamente.

Aunque la actividad antibacteriana de las nanopartículas ha sido ampliamente estudiada e informada durante las últimas décadas, no existe un estándar para los materiales y métodos de investigación utilizados para permitir comparaciones directas entre estudios. Por esta razón, presentamos dos métodos, el método de cocultivo directo (método A) y el método de exposición directa (método B), para caracterizar y comparar las actividades antimicrobianas de las nanopartículas manteniendo los materiales y métodos consistentes.

Además de las nanopartículas, las superficies nanoestructuradas también se han examinado para detectar actividades antibacterianas. Estos incluyen materiales a base de carbono, como nanoláminas de grafeno, nanotubos de carbono y grafito²⁹, así como aleaciones puras de Mg y Mg. Cada uno de estos materiales ha exhibido al menos un mecanismo antibacteriano, incluido el daño físico impuesto a las membranas celulares por materiales a base de carbono y el daño a los procesos metabólicos o al ADN a través de la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS) cuando Mg se degrada. Además, cuando el zinc (Zn) y el calcio (Ca) se combinan en la formación de aleaciones de Mg, se mejora el refinamiento del tamaño de grano de la matriz de Mg, lo que conduce a una reducción de la adhesión bacteriana a las superficies del sustrato en comparación con las muestras de solo Mg¹⁴. Para demostrar la actividad antibacteriana, presentamos el método de cultivo directo (método C), que determina la adhesión bacteriana sobre y alrededor de materiales nanoestructurados a lo largo del tiempo a través de la cuantificación de unidades formadoras de colonias bacterianas (UFC) con contacto superficial directo e indirecto.

La geometría de las nanoestructuras en las superficies, incluyendo el tamaño, la forma y la orientación, podría influir en las actividades bactericidas de los materiales. Por ejemplo, Lin et ^al.16 fabricaron diferentes capas nanoestructuradas de MgO en las superficies de sustratos de Mg mediante anodización y deposición electroforética (EPD). Después de un período de exposición a la superficie nanoestructurada in vitro, el crecimiento de S. aureus se redujo sustancialmente en comparación con el Mg no tratado. Esto indicó una mayor potencia de la superficie nanoestructurada contra la adhesión bacteriana en comparación con la superficie metálica de Mg no tratada. Para revelar los diferentes mecanismos de las propiedades antibacterianas de varias superficies nanoestructuradas, en este artículo se discute un método de exposición de contacto enfocado (método D) que determina las interacciones célula-superficie dentro del área de interés.

El objetivo de este artículo es presentar cuatro métodos in vitro que son aplicables a diferentes nanopartículas, superficies nanoestructuradas y especies microbianas. Discutimos las consideraciones clave para cada método para producir datos consistentes y reproducibles para la comparabilidad. Específicamente, el método de cocultivo directo¹⁷ y el método de exposición directa se utilizan para examinar las propiedades antimicrobianas de las nanopartículas. A través del método de cocultivo directo, las concentraciones mínimas inhibitorias y bactericidas mínimas (CMI y MBC_90-99.99, respectivamente) se pueden determinar para especies individuales, y la concentración más potente (MPC) se puede determinar para múltiples especies_. A través del método de exposición directa, los efectos bacteriostáticos o bactericidas de las nanopartículas a concentraciones inhibitorias mínimas pueden caracterizarse mediante lecturas de densidad óptica en tiempo real a lo largo del tiempo. El método de cultivo directo¹⁴ es adecuado para examinar bacterias directa e indirectamente en contacto con superficies nanoestructuradas. Finalmente, se presenta el método de exposición de contacto focalizado¹⁶ para examinar la actividad antibacteriana de un área específica en una superficie nanoestructurada mediante la aplicación directa de bacterias y la caracterización del crecimiento bacteriano en la interfaz célula-nanoestructura. Este método se ha modificado de la norma industrial japonesa JIS Z 2801:2000¹⁶, y está destinado a centrarse en las interacciones microbio-superficie y excluir los efectos de la degradación de muestras a granel en el cultivo microbiano sobre las actividades antimicrobianas.

Protocol

Para presentar los métodos de cocultivo directo y exposición directa, utilizamos nanopartículas de óxido de magnesio (nMgO) como material modelo para demostrar las interacciones bacterianas. Para presentar el cultivo directo y los métodos de exposición de contacto focalizado, utilizamos una aleación de Mg con superficies nanoestructuradas como ejemplos. 1. Esterilización de nanomateriales NOTA: Todos los nanomateriales deben ser esterilizados …

Representative Results

La identificación de la actividad antibacteriana de nanopartículas de óxido de magnesio y superficies nanoestructuradas se ha presentado utilizando cuatro métodos in vitro que son aplicables a diferentes tipos de materiales y especies microbianas. El método A y el método B examinan las actividades bacterianas cuando se exponen a nanopartículas en una fase de retraso (método A) y fase logarítmica (método B) durante una duración de 24 h o más. El método A proporciona result…

Discussion

Hemos presentado cuatro métodos in vitro (A-D) para caracterizar las actividades antibacterianas de nanopartículas y superficies nanoestructuradas. Si bien cada uno de estos métodos cuantifica el crecimiento bacteriano y la viabilidad a lo largo del tiempo en respuesta a los nanomateriales, existe cierta variación en los métodos utilizados para medir la densidad de siembra bacteriana inicial, el crecimiento y la viabilidad a lo largo del tiempo. Tres de estos métodos, el método de cocultivo directo (A)<su…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Milipore Sigma	Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven	MTI Corporation	BPG-7082	https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer	Sigma-Aldrich	42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE	Fisher Scientific	50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera	Hamamatsu	C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
Gluteraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Hemocytometer	Brightline, Hausser Scientific	1492
Inductively coupled plasma – optical emission spectrometry (ICP-OES)	PerkinElmer	8000
Inverse microscope	Nikon	Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth	Sigma Life Science	L3022
Luria Bertani Broth + agar	Sigma Life Science	L2897
MacroTube 5.0	Benchmark Scientific	C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles	US Research Nanomaterials, Inc	Stock #: US3310   M	MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance	Mettler Toledo	MS105D
Nitrocellulose paper	Fisherbrand	09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate	Falcon Corning Brand	351172
Petri dish 100 mm	VWR	470210-568
Petri dish, 15 mm	Fisherbrand	FB0875713A
pH meter	VWR	SP70P
Scanning electron microscopy (SEM)	TESCAN	Vega3 SBH
Sonicator	VWR	97043-936
Table top centrifuge	Fisher Scientific	accuSpin Micro 17
Table top centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar	MP	1010617
Tryptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092-500G
UV-Vis spectrophotometer	Tecan	Infinite 200 PRO	https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L	VWR	N/A
X-ray power defraction	Panalytical	N/A	PANalytical Empyrean Series 2