Visualisation des sites d’infection précoce de la maladie du souffle du riz (Magnaporthe oryzae) sur l’orge (Hordeum vulgare) à l’aide d’un microscope de base et d’un smartphone

Summary

Il s’agit d’un protocole simple d’essai de gaine de feuilles d’orge utilisant un minimum de réactifs et un équipement de laboratoire commun (y compris un smartphone de base). L’objectif est de visualiser le processus d’infection précoce de la maladie blastique dans des laboratoires sans accès à un équipement de microscopie avancé.

Abstract

Comprendre comment les plantes et les agents pathogènes interagissent, et si cette interaction aboutit à la défense ou à la maladie, est nécessaire pour développer des stratégies plus solides et plus durables pour la santé des plantes. Les progrès des méthodes qui permettent d’imager plus efficacement les échantillons d’agents phytopathogènes pendant l’infection et la colonisation ont donné lieu à des outils tels que le test de la gaine de feuille de riz, qui a été utile pour surveiller l’infection et les événements de colonisation précoce entre le riz et l’agent pathogène fongique, Magnaporthe oryzae. Cet agent pathogène hémi-biotrophe provoque de graves pertes de maladies dans le riz et les monocotylédones apparentées, y compris le mil, le seigle, l’orge et, plus récemment, le blé. Le test de la gaine foliaire, lorsqu’il est effectué correctement, donne une section de plante optiquement claire, plusieurs couches d’épaisseur, ce qui permet aux chercheurs d’effectuer une imagerie de cellules vivantes lors d’une attaque pathogène ou de générer des échantillons fixes colorés pour des caractéristiques spécifiques. Les études cellulaires détaillées sur l’interaction orge-M. oryzae ont pris du retard par rapport à celles de l’hôte du riz, malgré l’importance croissante de cette céréale comme source de nourriture pour les animaux et les humains et comme boissons fermentées. Il est rapporté ici le développement d’un test de gaine de feuilles d’orge pour des études complexes des interactions de M. oryzae au cours des 48 premières heures suivant l’inoculation. Le dosage de la gaine foliaire, quelle que soit l’espèce étudiée, est délicat; Un protocole qui couvre tout, des conditions de croissance de l’orge à l’obtention d’une gaine foliaire, en passant par l’inoculation, l’incubation et l’imagerie de l’agent pathogène sur les feuilles des plantes. Ce protocole peut être optimisé pour le dépistage à haut débit en utilisant quelque chose d’aussi simple qu’un smartphone à des fins d’imagerie.

Introduction

Magnaporthe oryzae, le champignon de l’explosion du riz, infecte un assortiment de cultures céréalières, y compris l’orge, le blé et le riz¹. Cet agent pathogène provoque des maladies dévastatrices et constitue une menace mondiale pour ces cultures précieuses, causant une perte complète de récoltes si elle n’est pas contrôlée. De nombreux laboratoires à travers le monde se concentrent sur la maladie du riz en raison de sa menace mondiale et de ses attributs en tant qu’excellent modèle pour les interactions plantes-champignons². Il a été entièrement séquencé et la génétique de son cycle infectieux, en particulier les premiers événements, a été établie ^3,4. Le cycle de vie commence par la germination d’une spore sur la surface d’une feuille, formant la structure de pénétration spécialisée appelée appressorium. L’appressorium pénètre dans le tissu foliaire et l’infection se poursuit avec le développement de lésions qui déclenchent le processus de sporulation et propagent la maladie⁴. La prévention de l’un de ces événements précoces inhiberait considérablement cette maladie dévastatrice. Par conséquent, la plupart des recherches actuelles sur la maladie blastique se sont concentrées sur les étapes précoces de l’infection, des conidies germées formant un appressorium au développement des hyphes invasifs et du complexe interfacial biotrophique (BIC)⁵.

De nombreuses recherches sur la maladie des blastes ont été menées sur le riz, même si M. oryzae est un agent pathogène important pour diverses cultures, et que de nouvelles souches émergent comme une menace mondiale pour le blé⁶. Alors que le riz est l’une des trois principales cultures de base utilisées pour nourrir la population, avec le blé et le maïs, l’orge est la quatrième céréale en termes d’alimentation du bétail et de production de bière⁷. À mesure que l’industrie de la bière artisanale se développe, la valeur économique de l’orge augmente également. Il y a des avantages distincts à utiliser M. oryzae et l’orge comme pathosystème pour étudier la maladie blastique. Tout d’abord, il existe des souches de M. oryzae qui n’infectent que l’orge, ainsi que des souches qui peuvent infecter plusieurs espèces de graminées. Par exemple, 4091-5-8 n’infecte principalement que l’orge, tandis que Guy11 et 70-15 peuvent infecter à la fois l’orge et le riz⁸. Ces souches sont génétiquement similaires et le processus d’infection est comparable⁹. Deuxièmement, dans des conditions standard de laboratoire et de serre, l’orge est plus facile à cultiver, car elle n’a pas les exigences compliquées du riz (contrôle concis de la température, humidité élevée, spectres lumineux spécifiques). Il y a aussi des problèmes d’imagerie avec le riz en raison de l’hydrophobicité de la surface des feuilles, dont l’orge ne présente pas¹⁰.

Ce protocole présente une méthode simple pour isoler et utiliser efficacement les gaines de feuilles d’orge pour l’analyse microscopique de plusieurs stades d’infection, en utilisant des fournitures de laboratoire courantes et un smartphone pour la collecte de données. Cette méthode pour le dosage de la gaine des feuilles d’orge est adaptable aux laboratoires du monde entier car elle nécessite un minimum de fournitures, tout en fournissant une image claire de l’interaction microscopique entre l’agent pathogène et les premières cellules qu’il infecte. Alors que les tests de pathogénicité, tels que l’inoculation par pulvérisation ou par gouttelettes, peuvent fournir une vue macro de la capacité de l’agent pathogène à former des lésions, ce test permet au chercheur de visualiser des étapes spécifiques de l’infection précoce, des événements de prépénétration à la colonisation des cellules épidermiques. En outre, les chercheurs peuvent facilement comparer l’infection par le champignon de type sauvage à l’infection par un mutant réduit en virulence.

Protocol

1. Préparation du matériel expérimental Préparer la gélose à l’avoine (OMA) en mélangeant la farine d’avoine jusqu’à ce qu’elle soit une poudre fine. Ajouter 25 g de poudre d’avoine et 15 g de gélose à 500 mL deddH2O, et autoclaver sur le cycle du média (ou porter à ébullition pendant 20 min). Versez le média dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm.REMARQUE: D’autres types de supports qui induisent la sporulation, tels que la gélose V8, sont accept…

Representative Results

Une représentation du flux de travail initial pour cette technique est illustrée à la figure 1. Les gaines ont été récoltées sur des plants d’orge sensibles de 14 jours (H. vulgare). Les conidies ont été récoltées sur des plaques d’OMA sporulantes de M. oryzae âgées de 10 jours, avec une suspension conidiale préparée à l’aide de ddH2O stérile pour une concentration finale de 5 x 104 spores par mL. La suspension d’inoculum a ét…

Discussion

Il existe de nombreux tests couramment utilisés pour tester les souches de M. oryzae qui fournissent un visuel macroscopique d’une réponse à une infection compatible ou incompatible, tels que les inoculations par pulvérisation ou gouttelettes, et l’utilisation de systèmes d’évaluation pour quantifier les tailles de lésion^13,14. Un autre test courant pour M. oryzae consiste à tester la capacité de l’agent pathogène à former sa …

Materials

Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
Cell phone	Google	Pixel 4A	Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.
Cell phone Microscope adapter	Vankey	B01788LT3S	https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microscope	AmScope	FM690TC	40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats	Quaker	N/A	https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1
ProMix BX	ProMix	1038500RG
Rectangular coverglass	Corning	CLS2975245
Slides, microscope	Sigma-Aldrich	S8902
Stage micrometer	OMAX	A36CALM7	0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T6146