Summary

Visualizando os locais de infecção precoce da doença da explosão do arroz (Magnaporthe oryzae) em cevada (Hordeum vulgare) usando um microscópio básico e um smartphone

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Este é um protocolo simples de um ensaio de bainha de folha de cevada usando reagentes mínimos e equipamentos de laboratório comuns (incluindo um smartphone básico). O objetivo é visualizar o processo de infecção precoce da doença blástica em laboratórios sem acesso a equipamentos avançados de microscopia.

Abstract

Entender como plantas e patógenos interagem, e se essa interação culmina em defesa ou doença, é necessário para desenvolver estratégias mais fortes e sustentáveis para a saúde das plantas. Avanços em métodos que capturam amostras de fitopatógenos de forma mais eficaz durante a infecção e colonização produziram ferramentas como o ensaio da bainha foliar do arroz, que tem sido útil no monitoramento da infecção e dos eventos de colonização precoce entre o arroz e o patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemibiotrófico causa severa perda de doenças em arroz e monocotiledôneas relacionadas, incluindo milheto, centeio, cevada e, mais recentemente, trigo. O ensaio de bainha foliar, quando realizado corretamente, produz uma seção opticamente clara da planta, com várias camadas de espessura, o que permite aos pesquisadores realizar imagens de células vivas durante o ataque do patógeno ou gerar amostras fixas coradas para características específicas. Investigações celulares detalhadas sobre a interação cevada-M. oryzae têm ficado atrás daquelas do hospedeiro arroz, apesar da crescente importância deste grão como fonte de alimento para animais e humanos e como bebidas fermentadas. Relata-se aqui o desenvolvimento de um ensaio de bainha foliar de cevada para estudos intrincados de interações de M. oryzae durante as primeiras 48 h pós-inoculação. O ensaio da bainha foliar, independentemente da espécie estudada, é delicado; É fornecido um protocolo que abrange tudo, desde as condições de crescimento da cevada e obtenção de uma bainha foliar, até a inoculação, incubação e imagem do patógeno nas folhas das plantas. Esse protocolo pode ser otimizado para triagem de alto rendimento usando algo tão simples quanto um smartphone para fins de imagem.

Introduction

Magnaporthe oryzae, o fungo da brusone do arroz, infecta uma variedade de culturas de grãos, incluindo cevada, trigo e arroz1. Este patógeno causa doenças devastadoras e representa uma ameaça mundial para essas valiosas culturas, causando perda completa de safra se não for controlado. Muitos laboratórios ao redor do mundo se concentram na doença da brusone do arroz devido à sua ameaça global e seus atributos como um excelente modelo para interações planta-fungos2. Foi completamente sequenciada, e a genética de seu ciclo infeccioso, particularmente os eventos iniciais, foi estabelecida 3,4. O ciclo de vida começa com um esporo germinando na superfície da folha, formando a estrutura de penetração especializada chamada apressório. O apressório penetra no tecido foliar e a infecção continua com o desenvolvimento de lesões que iniciam o processo de esporulação e disseminação da doença4. Prevenir qualquer um desses eventos iniciais inibiria drasticamente essa doença devastadora. Consequentemente, a maioria das pesquisas atuais sobre a doença blástica tem se concentrado nas etapas iniciais da infecção, desde os conídios germinados formando um apressório até o desenvolvimento das hifas invasivas e do complexo interfacial biotrófico (BIC)5.

A vasta quantidade de pesquisas sobre a brusone tem sido conduzida em arroz, embora M. oryzae seja um patógeno significativo para uma variedade de culturas, e cepas recém-evoluídas estejam emergindo como uma ameaça global ao trigo6. Enquanto o arroz é uma das três principais culturas básicas usadas para alimentar a população, juntamente com o trigo e o milho, a cevada é o quarto grão de cereal em termos de ração animal e produção de cerveja7. À medida que a indústria da cerveja artesanal cresce, cresce também o valor econômico da cevada. Existem vantagens distintas do uso de M. oryzae e cevada como um patossistema para estudar a doença blástica. Primeiro, existem cepas de M. oryzae que infectam apenas cevada, bem como cepas que podem infectar várias espécies de gramíneas. Por exemplo, 4091-5-8 infecta principalmente apenas cevada, enquanto Guy11 e 70-15 podem infectar cevada e arroz8. Essas cepas são geneticamente semelhantes e o processo de infecção é comparável9. Em segundo lugar, sob condições padrão de laboratório e estufa, a cevada é mais fácil de cultivar, pois não tem os requisitos complicados do arroz (controle conciso de temperatura, alta umidade, espectros de luz específicos). Há também desafios de imagem com o arroz devido à hidrofobicidade da superfície foliar, que a cevada não apresenta10.

Este protocolo apresenta um método simples para isolar e utilizar efetivamente bainhas foliares de cevada para análise microscópica de múltiplos estágios de infecção, utilizando material laboratorial comum e um smartphone para coleta de dados. Este método para o ensaio da bainha da folha de cevada é adaptável para laboratórios em todo o mundo, pois requer suprimentos mínimos, e ainda fornece uma imagem clara da interação microscópica entre o patógeno e as primeiras células que ele infecta. Enquanto ensaios de patogenicidade, como a inoculação por spray ou gotícula, podem fornecer uma visão macro da capacidade do patógeno de formar lesões, este ensaio permite ao pesquisador visualizar etapas específicas da infecção precoce, desde eventos de pré-penetração até a colonização de células epidérmicas. Além disso, os pesquisadores podem facilmente comparar a infecção com o fungo do tipo selvagem à infecção com um mutante reduzido em virulência.

Protocol

1. Preparação de materiais experimentais Prepare o ágar aveia (OMA) misturando a aveia até obter um pó fino. Adicionar 25 g de aveia em pó e 15 g de ágar a 500 mL de ddH2O e autoclave em ciclo de meio (alternativamente, deixe ferver por 20 min). Despeje o meio em placas de Petri estéreis de 60 mm.NOTA: Outros tipos de meios que induzem esporulação, como ágar V8, são aceitáveis para este protocolo. A placa M. oryzae filtra diretamente nas placas OMA…

Representative Results

Uma representação do fluxo de trabalho inicial para essa técnica é exibida na Figura 1. As bainhas foram colhidas de plantas de cevada (H. vulgare) suscetíveis aos 14 dias de idade. Os conídios foram colhidos de placas de OMA esporulantes de M. oryzae com 10 dias de idade, com uma suspensão de conídios preparada com ddH2O estéril para uma concentração final de 5 x 104 esporos por mL. A suspensão de inóculo foi aplicada diretamente nas bain…

Discussion

Existem muitos ensaios comumente utilizados disponíveis para testar cepas de M. oryzae que fornecem uma visão em nível macroscópico de uma resposta infecciosa compatível ou incompatível, como inoculações em spray ou gotículas, e o uso de sistemas de classificação para quantificar o tamanho das lesões13,14. Outro ensaio comum para M. oryzae é testar a capacidade do patógeno de formar sua estrutura de penetração especializada, o ap…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem o financiamento do prêmio USDA-NIFA 2016-67013-24816.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Cell phone  Google  Pixel 4A Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. 
Cell phone Microscope adapter Vankey B01788LT3S https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix=
vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2
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QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Microscope AmScope FM690TC 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats Quaker N/A https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0
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mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint
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ProMix BX ProMix 1038500RG
Rectangular coverglass Corning CLS2975245
Slides, microscope Sigma-Aldrich S8902
Stage micrometer  OMAX A36CALM7 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146

References

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Cite This Article
Cooper, J. G., Donofrio, N. M., Caplan, J. L., Chaya, T. R. Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone. J. Vis. Exp. (193), e64794, doi:10.3791/64794 (2023).

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