Summary

Визуализация ранних очагов заражения рисовой бластной болезнью (Magnaporthe oryzae) на ячмене (Hordeum vulgare) с помощью базового микроскопа и смартфона

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Это простой протокол анализа оболочки листьев ячменя с использованием минимального количества реагентов и обычного лабораторного оборудования (включая базовый смартфон). Цель состоит в том, чтобы визуализировать ранний инфекционный процесс бластной болезни в лабораториях без доступа к передовому микроскопическому оборудованию.

Abstract

Понимание того, как взаимодействуют растения и патогены, и приводит ли это взаимодействие к защите или болезни, необходимо для разработки более сильных и устойчивых стратегий для здоровья растений. Достижения в методах, которые более эффективно визуализируют образцы патогенов растений во время инфекции и колонизации, привели к появлению таких инструментов, как анализ оболочки рисовых листьев, который был полезен для мониторинга инфекции и ранних событий колонизации между рисом и грибковым патогеном Magnaporthe oryzae. Этот полубиотрофный патоген вызывает серьезную потерю болезней у риса и родственных однодольных растений, включая просо, рожь, ячмень и, в последнее время, пшеницу. Анализ оболочки листа при правильном выполнении дает оптически прозрачный срез растения толщиной в несколько слоев, что позволяет исследователям выполнять визуализацию живых клеток во время атаки патогена или генерировать фиксированные образцы, окрашенные по определенным признакам. Детальные клеточные исследования взаимодействия ячменя и M. oryzae отстают от таковых у рисового хозяина, несмотря на растущее значение этого зерна в качестве источника пищи для животных и людей и в качестве ферментированных напитков. Здесь сообщается о разработке анализа оболочки листьев ячменя для сложных исследований взаимодействий M. oryzae в течение первых 48 часов после инокуляции. Проба листового влагалища, независимо от того, какой вид изучается, деликатна; Предоставляется протокол, который охватывает все, от условий роста ячменя и получения листовой оболочки до инокуляции, инкубации и визуализации патогена на листьях растений. Этот протокол может быть оптимизирован для высокопроизводительного скрининга с использованием чего-то столь же простого, как смартфон для целей визуализации.

Introduction

Magnaporthe oryzae, рисовый гриб, поражает ряд зерновых культур, включая ячмень, пшеницу и рис1. Этот патоген вызывает разрушительные болезни и представляет угрозу для этих ценных культур во всем мире, вызывая полную потерю урожая, если его не контролировать. Многие лаборатории по всему миру уделяют особое внимание болезни риса из-за ее глобальной угрозы и ее свойств в качестве отличной модели взаимодействия растений и грибов2. Он был полностью секвенирован, и генетика его инфекционного цикла, особенно ранних событий, была установлена 3,4. Жизненный цикл начинается с того, что споры прорастают на поверхности листа, образуя специализированную структуру проникновения, называемую аппрессориумом. Аппрессориум проникает в ткани листа, и инфекция продолжается с развитием поражений, которые запускают процесс спороношения и распространяют болезнь4. Предотвращение любого из этих ранних событий резко подавило бы эту разрушительную болезнь. Следовательно, большинство современных исследований бластной болезни было сосредоточено на ранних стадиях инфекции, от проросших конидий, образующих аппрессорий, до развития инвазивных гиф и биотрофного межфазного комплекса (BIC)5.

Огромное количество исследований бластной болезни было проведено на рисе, несмотря на то, что M. oryzae является важным патогеном для различных сельскохозяйственных культур, а недавно выведенные штаммы становятся глобальной угрозой для пшеницы6. В то время как рис является одной из трех основных сельскохозяйственных культур, используемых для кормления населения, наряду с пшеницей и кукурузой, ячмень является четвертым зерновым зерном с точки зрения производства кормов для скота и пива7. По мере роста индустрии крафтового пива растет и экономическая ценность ячменя. Существуют явные преимущества использования M. oryzae и ячменя в качестве патосистемы для изучения бластной болезни. Во-первых, существуют штаммы M. oryzae , которые заражают только ячмень, а также штаммы, которые могут заражать несколько видов трав. Например, 4091-5-8 заражает в первую очередь только ячмень, в то время как Guy11 и 70-15 могут заражать как ячмень, так и рис8. Эти штаммы генетически схожи, и процесс заражения сопоставим9. Во-вторых, в стандартных лабораторных и тепличных условиях ячмень легче выращивать, так как он не предъявляет сложных требований к рису (лаконичный контроль температуры, высокая влажность, специфические световые спектры). Существуют также проблемы с визуализацией риса из-за гидрофобности поверхности листа, которую ячмень не проявляет10.

Этот протокол представляет собой простой метод выделения и эффективного использования оболочек листьев ячменя для микроскопического анализа нескольких стадий инфекции с использованием обычных лабораторных принадлежностей и смартфона для сбора данных. Этот метод анализа оболочки листьев ячменя можно адаптировать для лабораторий по всему миру, поскольку он требует минимальных поставок, но при этом дает четкую картину микроскопического взаимодействия между патогеном и первыми несколькими клетками, которые он заражает. В то время как анализы патогенности, такие как инокуляция спреем или каплями, могут обеспечить макропредставление о способности патогена образовывать поражения, этот анализ позволяет исследователю визуализировать конкретные этапы ранней инфекции, от событий до проникновения до колонизации клеток эпидермиса. Кроме того, исследователи могут легко сравнить инфекцию грибком дикого типа с инфекцией мутантом с пониженной вирулентностью.

Protocol

1. Подготовка экспериментальных материалов Приготовьте овсяный агар (ОМА), смешав овсянку до получения мелкого порошка. Добавьте 25 г овсяного порошка и 15 г агара к 500 мл ddH2O и автоклавируйте в цикле среды (в качестве альтернативы доведите до кипения в течение 20 минут). ?…

Representative Results

Описание начального рабочего процесса для этого метода показано на рисунке 1. Оболочки были собраны с 14-дневных восприимчивых растений ячменя «Лейси» (H. vulgare). Конидии собирали из 10-дневных спорорасширяющих пластин M. oryzae OMA с конидиальной суспензией, приготовле…

Discussion

Существует множество широко используемых анализов для тестирования штаммов M. oryzae, которые обеспечивают макроскопическое визуальное изображение совместимого или несовместимого ответа на инфекцию, такого как прививки спреем или воздушно-капельным способом, а также использовани?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы признают финансирование за счет награды USDA-NIFA 2016-67013-24816.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Cell phone  Google  Pixel 4A Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. 
Cell phone Microscope adapter Vankey B01788LT3S https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix=
vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2
-spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd
GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR
jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ
9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E
M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM
DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI
md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY
WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3
QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Microscope AmScope FM690TC 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope
Oatmeal old fashioned rolled oats Quaker N/A https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0
&hvadid=312253390021&hvpos=
&hvnetw=g&hvrand=98212627704
6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq
mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint
=&hvlocphy=9007494&hvtargid
=pla-568492637928&psc=1
ProMix BX ProMix 1038500RG
Rectangular coverglass Corning CLS2975245
Slides, microscope Sigma-Aldrich S8902
Stage micrometer  OMAX A36CALM7 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146

References

  1. Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
  2. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
  3. Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
  4. Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
  5. Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
  6. Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
  7. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
  8. Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
  9. Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
  10. Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
  11. Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
  12. Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
  13. Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
  14. Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
  15. Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
  16. Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).

Play Video

Cite This Article
Cooper, J. G., Donofrio, N. M., Caplan, J. L., Chaya, T. R. Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone. J. Vis. Exp. (193), e64794, doi:10.3791/64794 (2023).

View Video