Visualisering af tidlige infektionssteder for risblæsningssygdom (Magnaporthe oryzae) på byg (Hordeum vulgare) ved hjælp af et grundlæggende mikroskop og en smartphone
Summary
Dette er en ligetil protokol for et bygbladskedeassay ved hjælp af minimale reagenser og almindeligt laboratorieudstyr (inklusive en grundlæggende smartphone). Formålet er at visualisere den tidlige infektionsproces af blastsygdom i laboratorier uden adgang til avanceret mikroskopiudstyr.
Abstract
At forstå, hvordan planter og patogener interagerer, og om denne interaktion kulminerer i forsvar eller sygdom, er nødvendig for at udvikle stærkere og mere bæredygtige strategier for plantesundhed. Fremskridt inden for metoder, der mere effektivt afbilder plantepatogenprøver under infektion og kolonisering, har givet værktøjer såsom risbladskedeanalysen, som har været nyttig til overvågning af infektion og tidlige koloniseringshændelser mellem ris og svampepatogenet, Magnaporthe oryzae. Dette hemi-biotrofe patogen forårsager alvorligt sygdomstab i ris og beslægtede monocots, herunder hirse, rug, byg og for nylig hvede. Bladkappeanalysen giver, når den udføres korrekt, et optisk klart planteafsnit, flere lag tykt, hvilket gør det muligt for forskere at udføre levende cellebilleddannelse under patogenangreb eller generere faste prøver farvet til specifikke funktioner. Detaljerede cellulære undersøgelser af interaktionen mellem byg og M. oryzae har haltet bagefter risværtens, på trods af kornets voksende betydning som fødekilde for dyr og mennesker og som gærede drikkevarer. Her rapporteres udviklingen af et bygbladskedeassay til indviklede undersøgelser af M. oryzae-interaktioner i løbet af de første 48 timer efter podning. Bladskedeanalysen, uanset hvilken art der undersøges, er delikat; forudsat er en protokol, der dækker alt fra bygvækstbetingelser og opnåelse af en bladkappe til podning, inkubation og billeddannelse af patogenet på planteblade. Denne protokol kan optimeres til screening med høj kapacitet ved hjælp af noget så simpelt som en smartphone til billedbehandlingsformål.
Introduction
Magnaporthe oryzae, risblastsvampen, inficerer et udvalg af kornafgrøder, herunder byg, hvede og ris1. Dette patogen forårsager ødelæggende sygdomme og udgør en verdensomspændende trussel mod disse værdifulde afgrøder, hvilket forårsager fuldstændigt afgrødetab, hvis det ikke kontrolleres. Mange laboratorier rundt om i verden fokuserer på risblastsygdom på grund af dens globale trussel og dens egenskaber som en fremragende model for plante-svampeinteraktioner2. Det er blevet fuldt sekventeret, og genetikken i dets infektionscyklus, især de tidlige begivenheder, er blevet fastslået 3,4. Livscyklussen begynder med en spore, der spirer på en bladoverflade, der danner den specialiserede penetrationsstruktur kaldet appressoriet. Appressoriet trænger ind i bladvævet, og infektionen fortsætter med udviklingen af læsioner, som starter sporulationsprocessen og spreder sygdom4. Forebyggelse af nogen af disse tidlige begivenheder ville drastisk hæmme denne ødelæggende sygdom. Derfor har det meste af den aktuelle forskning i blastsygdom været fokuseret på de tidlige infektionstrin, fra de spirede konidier, der danner et appressorium, til udviklingen af invasive hyfer og det biotrofiske grænsefladekompleks (BIC)5.
Den store mængde forskning i blastsygdom er blevet udført i ris, selvom M. oryzae er et betydeligt patogen for en række afgrøder, og nyudviklede stammer fremstår som en global trussel mod hvede6. Mens ris er en af de tre bedste basisafgrøder, der bruges til at fodre befolkningen sammen med hvede og majs, er byg det fjerde kornkorn med hensyn til husdyrfoder og ølproduktion7. Efterhånden som håndværksølindustrien vokser, vokser også bygens økonomiske værdi. Der er klare fordele ved at bruge M. oryzae og byg som et patosystem til at studere blast sygdom. For det første er der stammer af M. oryzae , der kun inficerer byg, samt stammer, der kan inficere flere græsarter. For eksempel inficerer 4091-5-8 primært kun byg, mens Guy11 og 70-15 kan inficere både byg og ris8. Disse stammer er genetisk ens, og infektionsprocessen er sammenlignelig9. For det andet er byg under standard laboratorie- og drivhusforhold lettere at dyrke, da det ikke har de komplicerede krav til ris (kortfattet temperaturkontrol, høj luftfugtighed, specifikke lysspektre). Der er også billeddannelsesudfordringer med ris på grund af bladoverfladens hydrofobicitet, som byg ikke udviser10.
Denne protokol præsenterer en enkel metode til isolering og effektiv udnyttelse af bygbladskeder til mikroskopisk analyse af flere infektionsstadier ved hjælp af almindelige laboratorieforsyninger og en smartphone til dataindsamling. Denne metode til bygbladskedeanalysen kan tilpasses laboratorier over hele verden, da den kræver minimale forsyninger og alligevel giver et klart billede af den mikroskopiske interaktion mellem patogenet og de første par celler, det inficerer. Mens patogenicitetsassays, såsom en spray- eller dråbeinokulation, kan give et makrobillede af patogenets evne til at danne læsioner, giver dette assay forskeren mulighed for at visualisere specifikke trin i tidlig infektion, fra præpenetrationshændelser til kolonisering af epidermale celler. Desuden kan forskere let sammenligne infektion med vildtypesvampen med infektion med en mutant reduceret i virulens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er mange almindeligt anvendte assays tilgængelige til test af M. oryzae-stammer, der giver et makroskopisk niveau af et kompatibelt eller inkompatibelt infektionsrespons, såsom spray- eller dråbevaccinationer, og brugen af klassificeringssystemer til kvantificering af læsionsstørrelser13,14. Et andet almindeligt assay for M. oryzae er at teste patogenets evne til at danne sin specialiserede penetrationsstruktur, apppressorium<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender finansiering fra USDA-NIFA-prisen 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
