Visualisierung früher Infektionsherde der Reisexplosionskrankheit (Magnaporthe oryzae) an Gerste (Hordeum vulgare) mit einem einfachen Mikroskop und einem Smartphone
Summary
Dies ist ein einfaches Protokoll eines Gerstenblattscheiden-Assays mit minimalen Reagenzien und gängigen Laborgeräten (einschließlich eines einfachen Smartphones). Ziel ist es, den frühen Infektionsprozess der Blastenkrankheit in Labors ohne Zugang zu fortschrittlichen Mikroskopiegeräten zu visualisieren.
Abstract
Zu verstehen, wie Pflanzen und Krankheitserreger interagieren und ob diese Interaktion in Abwehr oder Krankheit gipfelt, ist erforderlich, um stärkere und nachhaltigere Strategien für die Pflanzengesundheit zu entwickeln. Fortschritte bei Methoden, die Pflanzenpathogenproben während der Infektion und Besiedlung effektiver abbilden, haben Werkzeuge wie den Reisblattscheiden-Assay hervorgebracht, der sich bei der Überwachung von Infektionen und frühen Kolonisierungsereignissen zwischen Reis und dem Pilzpathogen Magnaporthe oryzae als nützlich erwiesen hat. Dieser hemi-biotrophe Erreger verursacht schwere Krankheitsverluste bei Reis und verwandten Monokotyledonen, einschließlich Hirse, Roggen, Gerste und in jüngerer Zeit Weizen. Der Blattscheiden-Assay liefert, wenn er korrekt durchgeführt wird, einen optisch klaren Pflanzenabschnitt mit einer Dicke von mehreren Schichten, der es den Forschern ermöglicht, während des Pathogenangriffs eine Bildgebung von lebenden Zellen durchzuführen oder feste Proben zu erzeugen, die für bestimmte Merkmale gefärbt sind. Detaillierte zelluläre Untersuchungen der Interaktion zwischen Gerste und M. oryzae hinkten denen des Reiswirts hinterher, trotz der wachsenden Bedeutung dieses Getreides als Nahrungsquelle für Tier und Mensch sowie als fermentierte Getränke. Hier wird über die Entwicklung eines Gerstenblattscheiden-Assays für komplizierte Studien von M. oryzae-Interaktionen während der ersten 48 Stunden nach der Inokulation berichtet. Der Blattscheiden-Assay, unabhängig davon, welche Art untersucht wird, ist heikel; Es wird ein Protokoll bereitgestellt, das alles abdeckt, von den Wachstumsbedingungen für Gerste und der Gewinnung einer Blattscheide bis hin zur Inokulation, Inkubation und Bildgebung des Erregers auf Pflanzenblättern. Dieses Protokoll kann für das Hochdurchsatz-Screening optimiert werden, indem etwas so Einfaches wie ein Smartphone für Bildgebungszwecke verwendet wird.
Introduction
Magnaporthe oryzae, der Reisexplosionspilz, infiziert eine Reihe von Getreidekulturen, darunter Gerste, Weizen und Reis1. Dieser Erreger verursacht verheerende Krankheiten und stellt eine weltweite Bedrohung für diese wertvollen Nutzpflanzen dar, die zu vollständigen Ernteverlusten führt, wenn er nicht kontrolliert wird. Viele Labore auf der ganzen Welt konzentrieren sich auf die Reisexplosionskrankheit aufgrund ihrer globalen Bedrohung und ihrer Eigenschaften als hervorragendes Modell für Pflanzen-Pilz-Interaktionen2. Es wurde vollständig sequenziert, und die Genetik seines Infektionszyklus, insbesondere der frühen Ereignisse, wurde festgestellt 3,4. Der Lebenszyklus beginnt damit, dass eine Spore auf einer Blattoberfläche keimt und die spezialisierte Penetrationsstruktur bildet, die als Appressorium bezeichnet wird. Das Appressorium dringt in das Blattgewebe ein und die Infektion setzt sich mit der Entwicklung von Läsionen fort, die den Prozess der Sporulation auslösen und die Krankheit verbreiten4. Die Verhinderung eines dieser frühen Ereignisse würde diese verheerende Krankheit drastisch hemmen. Folglich konzentrierte sich der Großteil der aktuellen Forschung zur Blastenerkrankung auf die frühen Infektionsschritte, von den gekeimten Konidien, die ein Appressorium bilden, bis zur Entwicklung der invasiven Hyphen und des biotrophen Grenzflächenkomplexes (BIC)5.
Die umfangreiche Forschung zur Explosionskrankheit wurde bei Reis durchgeführt, obwohl M. oryzae ein bedeutender Krankheitserreger für eine Vielzahl von Nutzpflanzen ist und neu entwickelte Stämme zu einer globalen Bedrohung für Weizen werden6. Während Reis neben Weizen und Mais zu den drei wichtigsten Grundnahrungsmitteln gehört, um die Bevölkerung zu ernähren, ist Gerste das vierte Getreidekorn in Bezug auf Viehfutter und Bierproduktion7. Mit dem Wachstum der Craft-Beer-Industrie wächst auch der wirtschaftliche Wert von Gerste. Es gibt deutliche Vorteile bei der Verwendung von M. oryzae und Gerste als Pathosystem zur Untersuchung von Blastenkrankheiten. Erstens gibt es Stämme von M. oryzae , die nur Gerste infizieren, sowie Stämme, die mehrere Grasarten infizieren können. Zum Beispiel infiziert 4091-5-8 hauptsächlich nur Gerste, während Guy11 und 70-15 sowohl Gerste als auch Reis8 infizieren können. Diese Stämme sind genetisch ähnlich und der Infektionsprozess ist vergleichbar9. Zweitens ist Gerste unter Standard-Labor- und Gewächshausbedingungen einfacher zu züchten, da sie nicht die komplizierten Anforderungen von Reis hat (präzise Temperaturkontrolle, hohe Luftfeuchtigkeit, spezifische Lichtspektren). Es gibt auch Herausforderungen bei der Bildgebung von Reis aufgrund der Hydrophobie der Blattoberfläche, die Gerste nicht aufweist10.
Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und effektiven Nutzung von Gerstenblatthüllen für die mikroskopische Analyse mehrerer Infektionsstadien dar, wobei gängiges Laborzubehör und ein Smartphone zur Datenerfassung verwendet werden. Diese Methode für den Gerstenblattscheiden-Assay ist für Labore auf der ganzen Welt anpassbar, da sie nur minimale Vorräte erfordert und dennoch ein klares Bild der mikroskopischen Wechselwirkung zwischen dem Erreger und den ersten Zellen, die er infiziert, liefert. Während Pathogenitätstests, wie z. B. eine Spray- oder Tröpfchenimpfung, eine Makroansicht der Fähigkeit des Erregers, Läsionen zu bilden, liefern können, ermöglicht dieser Assay dem Forscher, bestimmte Schritte der frühen Infektion zu visualisieren, von Ereignissen vor der Penetration bis zur Besiedlung von Epidermiszellen. Darüber hinaus können die Forscher die Infektion mit dem Wildtyp-Pilz leicht mit einer Infektion mit einer Mutante vergleichen, deren Virulenz reduziert ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt viele häufig verwendete Assays zum Testen von M. oryzae-Stämmen, die eine makroskopische Darstellung einer kompatiblen oder inkompatiblen Infektionsreaktion liefern, wie z. B. Sprüh- oder Tröpfchenimpfungen, und die Verwendung von Bewertungssystemen zur Quantifizierung der Läsionsgrößen13,14. Ein weiterer gängiger Test für M. oryzae besteht darin, die Fähigkeit des Erregers zu testen, seine spezialisierte Penetrationsstruktur, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren erkennen die Finanzierung durch den USDA-NIFA-Preis 2016-67013-24816 an.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
