Визуализация ранних очагов заражения рисовой бластной болезнью (Magnaporthe oryzae) на ячмене (Hordeum vulgare) с помощью базового микроскопа и смартфона
Summary
Это простой протокол анализа оболочки листьев ячменя с использованием минимального количества реагентов и обычного лабораторного оборудования (включая базовый смартфон). Цель состоит в том, чтобы визуализировать ранний инфекционный процесс бластной болезни в лабораториях без доступа к передовому микроскопическому оборудованию.
Abstract
Понимание того, как взаимодействуют растения и патогены, и приводит ли это взаимодействие к защите или болезни, необходимо для разработки более сильных и устойчивых стратегий для здоровья растений. Достижения в методах, которые более эффективно визуализируют образцы патогенов растений во время инфекции и колонизации, привели к появлению таких инструментов, как анализ оболочки рисовых листьев, который был полезен для мониторинга инфекции и ранних событий колонизации между рисом и грибковым патогеном Magnaporthe oryzae. Этот полубиотрофный патоген вызывает серьезную потерю болезней у риса и родственных однодольных растений, включая просо, рожь, ячмень и, в последнее время, пшеницу. Анализ оболочки листа при правильном выполнении дает оптически прозрачный срез растения толщиной в несколько слоев, что позволяет исследователям выполнять визуализацию живых клеток во время атаки патогена или генерировать фиксированные образцы, окрашенные по определенным признакам. Детальные клеточные исследования взаимодействия ячменя и M. oryzae отстают от таковых у рисового хозяина, несмотря на растущее значение этого зерна в качестве источника пищи для животных и людей и в качестве ферментированных напитков. Здесь сообщается о разработке анализа оболочки листьев ячменя для сложных исследований взаимодействий M. oryzae в течение первых 48 часов после инокуляции. Проба листового влагалища, независимо от того, какой вид изучается, деликатна; Предоставляется протокол, который охватывает все, от условий роста ячменя и получения листовой оболочки до инокуляции, инкубации и визуализации патогена на листьях растений. Этот протокол может быть оптимизирован для высокопроизводительного скрининга с использованием чего-то столь же простого, как смартфон для целей визуализации.
Introduction
Magnaporthe oryzae, рисовый гриб, поражает ряд зерновых культур, включая ячмень, пшеницу и рис1. Этот патоген вызывает разрушительные болезни и представляет угрозу для этих ценных культур во всем мире, вызывая полную потерю урожая, если его не контролировать. Многие лаборатории по всему миру уделяют особое внимание болезни риса из-за ее глобальной угрозы и ее свойств в качестве отличной модели взаимодействия растений и грибов2. Он был полностью секвенирован, и генетика его инфекционного цикла, особенно ранних событий, была установлена 3,4. Жизненный цикл начинается с того, что споры прорастают на поверхности листа, образуя специализированную структуру проникновения, называемую аппрессориумом. Аппрессориум проникает в ткани листа, и инфекция продолжается с развитием поражений, которые запускают процесс спороношения и распространяют болезнь4. Предотвращение любого из этих ранних событий резко подавило бы эту разрушительную болезнь. Следовательно, большинство современных исследований бластной болезни было сосредоточено на ранних стадиях инфекции, от проросших конидий, образующих аппрессорий, до развития инвазивных гиф и биотрофного межфазного комплекса (BIC)5.
Огромное количество исследований бластной болезни было проведено на рисе, несмотря на то, что M. oryzae является важным патогеном для различных сельскохозяйственных культур, а недавно выведенные штаммы становятся глобальной угрозой для пшеницы6. В то время как рис является одной из трех основных сельскохозяйственных культур, используемых для кормления населения, наряду с пшеницей и кукурузой, ячмень является четвертым зерновым зерном с точки зрения производства кормов для скота и пива7. По мере роста индустрии крафтового пива растет и экономическая ценность ячменя. Существуют явные преимущества использования M. oryzae и ячменя в качестве патосистемы для изучения бластной болезни. Во-первых, существуют штаммы M. oryzae , которые заражают только ячмень, а также штаммы, которые могут заражать несколько видов трав. Например, 4091-5-8 заражает в первую очередь только ячмень, в то время как Guy11 и 70-15 могут заражать как ячмень, так и рис8. Эти штаммы генетически схожи, и процесс заражения сопоставим9. Во-вторых, в стандартных лабораторных и тепличных условиях ячмень легче выращивать, так как он не предъявляет сложных требований к рису (лаконичный контроль температуры, высокая влажность, специфические световые спектры). Существуют также проблемы с визуализацией риса из-за гидрофобности поверхности листа, которую ячмень не проявляет10.
Этот протокол представляет собой простой метод выделения и эффективного использования оболочек листьев ячменя для микроскопического анализа нескольких стадий инфекции с использованием обычных лабораторных принадлежностей и смартфона для сбора данных. Этот метод анализа оболочки листьев ячменя можно адаптировать для лабораторий по всему миру, поскольку он требует минимальных поставок, но при этом дает четкую картину микроскопического взаимодействия между патогеном и первыми несколькими клетками, которые он заражает. В то время как анализы патогенности, такие как инокуляция спреем или каплями, могут обеспечить макропредставление о способности патогена образовывать поражения, этот анализ позволяет исследователю визуализировать конкретные этапы ранней инфекции, от событий до проникновения до колонизации клеток эпидермиса. Кроме того, исследователи могут легко сравнить инфекцию грибком дикого типа с инфекцией мутантом с пониженной вирулентностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует множество широко используемых анализов для тестирования штаммов M. oryzae, которые обеспечивают макроскопическое визуальное изображение совместимого или несовместимого ответа на инфекцию, такого как прививки спреем или воздушно-капельным способом, а также использовани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают финансирование за счет награды USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
