Visualización de los sitios de infección temprana de la enfermedad por explosión de arroz (Magnaporthe oryzae) en cebada (Hordeum vulgare) usando un microscopio básico y un teléfono inteligente
Summary
Este es un protocolo sencillo de un ensayo de vaina de hoja de cebada que utiliza reactivos mínimos y equipo de laboratorio común (incluido un teléfono inteligente básico). El propósito es visualizar el proceso de infección temprana de la enfermedad blástica en laboratorios sin acceso a equipos avanzados de microscopía.
Abstract
Comprender cómo interactúan las plantas y los patógenos, y si esa interacción culmina en defensa o enfermedad, es necesario para desarrollar estrategias más sólidas y sostenibles para la salud de las plantas. Los avances en los métodos que obtienen imágenes más efectivas de muestras de patógenos de plantas durante la infección y la colonización han producido herramientas como el ensayo de la vaina de la hoja de arroz, que ha sido útil para monitorear la infección y los eventos de colonización temprana entre el arroz y el patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemi-biotrófico causa una pérdida grave de enfermedades en el arroz y las monocotiledóneas relacionadas, incluyendo el mijo, el centeno, la cebada y, más recientemente, el trigo. El ensayo de la vaina de la hoja, cuando se realiza correctamente, produce una sección de planta ópticamente clara, de varias capas de espesor, que permite a los investigadores realizar imágenes de células vivas durante el ataque de patógenos o generar muestras fijas teñidas para características específicas. Las investigaciones celulares detalladas sobre la interacción cebada-M. oryzae se han quedado atrás de las del huésped del arroz, a pesar de la creciente importancia de este grano como fuente de alimento para animales y humanos y como bebidas fermentadas. Aquí se informa el desarrollo de un ensayo de vaina de hoja de cebada para estudios intrincados de las interacciones de M. oryzae durante las primeras 48 h después de la inoculación. El ensayo de la vaina de la hoja, independientemente de la especie que se esté estudiando, es delicado; Se proporciona un protocolo que cubre todo, desde las condiciones de crecimiento de la cebada y la obtención de una vaina foliar, hasta la inoculación, incubación e imágenes del patógeno en las hojas de las plantas. Este protocolo se puede optimizar para la detección de alto rendimiento utilizando algo tan simple como un teléfono inteligente para fines de imagen.
Introduction
Magnaporthe oryzae, el hongo de la explosión del arroz, infecta una variedad de cultivos de granos, incluyendo cebada, trigo y arroz1. Este patógeno causa enfermedades devastadoras y representa una amenaza mundial para estos valiosos cultivos, causando la pérdida completa de cultivos si no se controla. Muchos laboratorios de todo el mundo se centran en la enfermedad por la explosión del arroz debido a su amenaza global y sus atributos como un excelente modelo para las interacciones planta-hongos2. Ha sido completamente secuenciado, y la genética de su ciclo infeccioso, particularmente los eventos tempranos, se han establecido 3,4. El ciclo de vida comienza con una espora que germina en la superficie de una hoja, formando la estructura de penetración especializada llamada appressorium. El appressorium penetra en el tejido foliar y la infección continúa con el desarrollo de lesiones que inician el proceso de esporulación y diseminan la enfermedad4. La prevención de cualquiera de estos eventos tempranos inhibiría drásticamente esta enfermedad devastadora. En consecuencia, la mayoría de las investigaciones actuales sobre la enfermedad blástica se han centrado en los pasos tempranos de la infección, desde los conidios germinados que forman un appressorium hasta el desarrollo de las hifas invasivas y el complejo interfacial biotrófico (BIC)5.
La gran cantidad de investigación sobre la enfermedad blástica se ha llevado a cabo en el arroz, a pesar de que M. oryzae es un patógeno importante para una variedad de cultivos, y las cepas recién evolucionadas están emergiendo como una amenaza global para el trigo6. Si bien el arroz es uno de los tres principales cultivos básicos utilizados para alimentar a la población, junto con el trigo y el maíz, la cebada es el cuarto grano de cereal en términos de alimentación para el ganado y producción de cerveza7. A medida que la industria de la cerveza artesanal crece, también lo hace el valor económico de la cebada. Existen claras ventajas de utilizar M. oryzae y cebada como patosistema para estudiar la enfermedad blástica. Primero, hay cepas de M. oryzae que infectan solo cebada, así como cepas que pueden infectar múltiples especies de pasto. Por ejemplo, 4091-5-8 infecta principalmente solo cebada, mientras que Guy11 y 70-15 pueden infectar tanto a la cebada como al arroz8. Estas cepas son genéticamente similares, y el proceso de infección es comparable9. En segundo lugar, en condiciones estándar de laboratorio e invernadero, la cebada es más fácil de cultivar, ya que no tiene los complicados requisitos del arroz (control conciso de la temperatura, alta humedad, espectros de luz específicos). También hay desafíos de imagen con el arroz debido a la hidrofobicidad de la superficie de la hoja, que la cebada no exhibe10.
Este protocolo presenta un método simple para aislar y utilizar eficazmente las vainas de hojas de cebada para el análisis microscópico de múltiples etapas de infección, utilizando suministros de laboratorio comunes y un teléfono inteligente para la recopilación de datos. Este método para el ensayo de vaina de hoja de cebada es adaptable para laboratorios de todo el mundo, ya que requiere suministros mínimos y, sin embargo, proporciona una imagen clara de la interacción microscópica entre el patógeno y las primeras células que infecta. Mientras que los ensayos de patogenicidad, como un aerosol o la inoculación de gotitas, pueden proporcionar una visión macro de la capacidad del patógeno para formar lesiones, este ensayo permite al investigador visualizar pasos específicos de infección temprana, desde eventos previos a la penetración hasta la colonización de células epidérmicas. Además, los investigadores pueden comparar fácilmente la infección con el hongo de tipo salvaje con la infección con un mutante reducido en virulencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay muchos ensayos comúnmente utilizados disponibles para probar cepas de M. oryzae que proporcionan una visión a nivel macroscópico de una respuesta de infección compatible o incompatible, como las inoculaciones en aerosol o gotitas, y el uso de sistemas de clasificación para cuantificar el tamaño de las lesiones13,14. Otro ensayo común para M. oryzae es probar la capacidad del patógeno para formar su estructura de penetración especial…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la financiación del premio USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
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