Visualisera tidiga infektionsställen för risblastsjukdom (Magnaporthe oryzae) på korn (Hordeum vulgare) med hjälp av ett grundläggande mikroskop och en smartphone
Summary
Detta är ett enkelt protokoll för en kornbladmantelanalys med minimala reagens och vanlig laboratorieutrustning (inklusive en grundläggande smartphone). Syftet är att visualisera den tidiga infektionsprocessen av blastsjukdom i laboratorier utan tillgång till avancerad mikroskopiutrustning.
Abstract
Att förstå hur växter och patogener interagerar, och om den interaktionen kulminerar i försvar eller sjukdom, krävs för att utveckla starkare och mer hållbara strategier för växtskydd. Framsteg inom metoder som mer effektivt avbildar växtpatogenprover under infektion och kolonisering har gett verktyg som risbladsmantelanalysen, som har varit användbar vid övervakning av infektion och tidiga koloniseringshändelser mellan ris och svamppatogenen, Magnaporthe oryzae. Denna hemi-biotrofa patogen orsakar allvarlig sjukdomsförlust i ris och relaterade monocots, inklusive hirs, råg, korn och nyligen vete. Bladmantelanalysen, när den utförs korrekt, ger en optiskt klar växtsektion, flera lager tjock, vilket gör det möjligt för forskare att utföra levande cellavbildning under patogenattack eller generera fasta prover färgade för specifika egenskaper. Detaljerade cellulära undersökningar av korn-M. oryzae-interaktionen har släpat efter risvärdens, trots den växande betydelsen av detta spannmål som livsmedelskälla för djur och människor och som fermenterade drycker. Här rapporteras utvecklingen av en analys av kornbladsmantel för invecklade studier av M. oryzae-interaktioner under de första 48 timmarna efter inokuleringen. Bladmantelanalysen, oavsett vilken art som studeras, är känslig; Förutsatt är ett protokoll som täcker allt, från korntillväxtförhållanden och erhållande av en bladmantel, till ympning, inkubation och avbildning av patogenen på växtblad. Detta protokoll kan optimeras för screening med hög genomströmning med något så enkelt som en smartphone för bildändamål.
Introduction
Magnaporthe oryzae, risblastsvampen, infekterar ett sortiment av spannmålsgrödor, inklusive korn, vete och ris1. Denna patogen orsakar förödande sjukdomar och utgör ett världsomspännande hot mot dessa värdefulla grödor, vilket orsakar fullständig förlust av grödor om den inte kontrolleras. Många laboratorier runt om i världen fokuserar på risblastsjukdom på grund av dess globala hot och dess attribut som en utmärkt modell för växt-svampinteraktioner2. Det har sekvenserats fullständigt, och genetiken i dess infektionscykel, särskilt de tidiga händelserna, har fastställts 3,4. Livscykeln börjar med en spore som spirer på en bladyta och bildar den specialiserade penetrationsstrukturen som kallas appressorium. Appressoriet tränger in i bladvävnaden, och infektionen fortsätter med utvecklingen av lesioner som startar sporuleringsprocessen och sprider sjukdom4. Att förhindra någon av dessa tidiga händelser skulle drastiskt hämma denna förödande sjukdom. Följaktligen har den senaste forskningen om blastsjukdom varit inriktad på de tidiga infektionsstegen, från de grodda konidierna som bildar ett appressorium till utvecklingen av invasiva hyfer och det biotrofa gränssnittskomplexet (BIC)5.
Den stora mängden forskning om blastsjukdom har utförts i ris, även om M. oryzae är en betydande patogen för en mängd olika grödor, och nyutvecklade stammar framträder som ett globalt hot mot vete6. Medan ris är en av de tre bästa stapelgrödorna som används för att mata befolkningen, tillsammans med vete och majs, är korn det fjärde spannmålskornet när det gäller djurfoder och ölproduktion7. När hantverksölindustrin växer, så gör det ekonomiska värdet av korn. Det finns tydliga fördelar med att använda M. oryzae och korn som ett patosystem för att studera blast sjukdom. För det första finns det stammar av M. oryzae som bara infekterar korn, liksom stammar som kan infektera flera gräsarter. Till exempel infekterar 4091-5-8 främst endast korn, medan Guy11 och 70-15 kan infektera både korn och ris8. Dessa stammar är genetiskt lika, och infektionsprocessen är jämförbar9. För det andra, under vanliga laboratorie- och växthusförhållanden är korn lättare att odla, eftersom det inte har de komplicerade kraven på ris (kortfattad temperaturkontroll, hög luftfuktighet, specifika ljusspektra). Det finns också avbildningsutmaningar med ris på grund av bladytans hydrofobicitet, som korn inte uppvisar10.
Detta protokoll presenterar en enkel metod för att isolera och effektivt utnyttja kornbladsmantlar för mikroskopisk analys av flera infektionssteg, med hjälp av vanliga laboratorietillbehör och en smartphone för datainsamling. Denna metod för analysen av kornbladmanteln är anpassningsbar för laboratorier över hela världen eftersom den kräver minimala leveranser och ändå ger en tydlig bild av den mikroskopiska interaktionen mellan patogenen och de första cellerna som den infekterar. Medan patogenicitetsanalyser, såsom en spray- eller droppinokulering, kan ge en makrovy av patogenens förmåga att bilda lesioner, tillåter denna analys forskaren att visualisera specifika steg av tidig infektion, från prepenetrationshändelser till kolonisering av epidermala celler. Vidare kan forskare enkelt jämföra infektion med vildtypsvampen med infektion med en mutant minskad virulens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns många vanliga analyser tillgängliga för att testa M. oryzae-stammar som ger en makroskopisk bild av ett kompatibelt eller inkompatibelt infektionssvar, såsom spray- eller droppinokuleringar, och användningen av klassificeringssystem för att kvantifiera lesionsstorlekarna13,14. En annan vanlig analys för M. oryzae är att testa patogenens förmåga att bilda sin specialiserade penetrationsstruktur, apppressorium…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner finansiering från USDA-NIFA-utmärkelsen 2016-67013-24816.
Materials
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
